一种改造调控因子降低酵母尿素积累的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种改造调控因子降低酵母尿素积累的方法，属于微生物遗传和分子 生物学领域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症 研究机构（IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直 接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了 2A级（与甲醛同级）。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场 竞争力的重要隐患。
[0003] 在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物 质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。当发酵培养基中无酵母偏 好型氮源（谷氨酰胺、天冬酰胺等）存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶降解为二氧化碳 和氨。但当酵母偏好型氮源存在时，尿素水解酶的表达会受到强烈的抑制。这种现象由酿 酒酵母的氮源阻遏效应（Nitrogencataboliterepression，简称NCR)调控，可以保证酵母 细胞能在复杂的生存环境中优先利用最利于其生存的氮源。NCR效应的调控会导致酵母细 胞内高浓度尿素的积累。由于尿素对酿酒酵母细胞有毒害作用，因此细胞通过尿素透性酶 以主动运输的方式将尿素转运至胞外。在胞外的发酵液中，尿素可以在发酵的过程中自发 的和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯。
[0004] NCR效应相关的全局性调控因子主要有：四个GATA家族调控因子（Gln3p、Gatlp、 Gzf3p和Dal80p)和Ure2p。其中Gln3p和Gatlp是正调控因子，Gzf3p和Dal80p是负调控 因子，而Ure2p则是一个可以与Gln3p和Gatlp相结合的阻遏蛋白。在酿酒酵母中，Gln3p 和Gatlp能否发挥其功能与它们在胞内的定位密切相关，只有当这两个激活因子被转运至 细胞核内时，它们才能激活尿素代谢相关基因的表达。对这两个调控因子胞内定位的调控 与它们蛋白序列上的核定位序列和核定位调控序列密切相关。Gln3p和Gatlp的核定位序 列和核定位调控序列是酿酒酵母NCR效应重要的调控开关。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的问题是提供一种通过改造氮代谢物阻遏效应调控因子，降低酿酒 酵母发酵过程中尿素积累的方法。通过这种遗传改造，可以从根本上减少酿酒酵母发酵过 程中尿素的积累。
[0006] 本发明的降低酵母尿素积累的方法，是对氮代谢物阻遏效应相关调控因子Gln3p 或Gatlp进行改造。
[0007] 所述改造是消除调控因子Gln3p或Gatlp的核定位调控序列并突变核定位序列上 的磷酸化位点。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述改造是将氨基酸序列为SEQIDNO. 1的Gln3p 的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝 氨酸突变为丙氨酸。
[0009] 在本发明的另一种实施方式中，所述改造是将氨基酸序列为SEQIDN0. 2的Gatlp 的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变 为丙氨酸。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将Gln3p或Gatlp进行改造后的基因序 列连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pYX212。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述酵母是酿酒酵母。
[0013] 本发明还提供一种尿素积累能力降低的酵母，所述酵母是将氨基酸序列为SEQID NO. 1的Gln3p或SEQIDNO. 2的Gatlp进行改造后的基因序列连接到表达载体上得到重组 质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中而得到的。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述改造是将Gln3p的第654-667位氨基酸消除并 将第344位、347位、355位的丝氨酸突变为丙氨酸，或者是将Gatlp的第376-510位氨基酸 消除并将第360、361位的丝氨酸突变为丙氨酸。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述酵母，具体构建方法是：⑴对Gln3p或 Gatlp的核定位调控序列进行消除：将相应截短后的基因连接到表达载体pYX212,得到 重组质粒pYX212-Gln3Pl653或pYX212-Gatlpi375;⑵对Gln3p和Gatlp的核定位序列 上的磷酸化位点进行突变：将质粒pYX212-Gln3Pl653或pYX212-Gatlp1375上的GLN3和 GAT1基因相应磷酸化位点基因突变，得到重组质粒pYX212-Gln3Pl653,, S344A,s347A, S355A和 pYXSU-GatlPi375,S36QA,s361A; (3)将上一步得到的重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述酵母，是酿酒酵母菌株为CEN.PK2_lC(MATa; ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112 ;his3A1 ;MAL2-8c;SUC2)单倍体模式菌株。
[0017] 本发明所述的尿素积累减少，指的是基因工程菌株相对于野生菌株，在偏好型氮 源阻遏培养基中尿素的积累情况。
[0018] 本发明的有益之处：本发明对酿酒酵母氮代谢物阻遏效应相关调控因子进行了遗 传改造，通过对2个不同的调控因子的改造，尿素积累量分别减少了 37. 4%和44. 3%。通 过对酿酒酵母的这种遗传改造，可以从根本上较少酿酒酵母发酵过程中尿素的积累。
【附图说明】
[0019] 图1 :代谢改造Gln3p和Gatlp对菌株尿素利用情况的影响。
【具体实施方式】
[0020] 尿素和氨基酸的检测方法参考文献：KnorstMT,NeubertR,Wohlrab ff.Analyticalmethodsformeasuringureainpharmaceuticalformulations.Journal ofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis15, 1627-1632 (1997)〇
[0021] 材料与方法
[0022] 本发明所用酿酒酵母菌株为CEN.PK2-lC(MATa;ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112; his3Al;MAL2-8%SUC2)单倍体模式菌株，其他操作均为常规分子生物学操作。
[0023] 大肠杆菌的培养使用LB培养基，酿酒酵母的活化使用YH)培养基，酿酒酵母尿素 利用情况使用使用偏好型氮源阻遏培养基。这些培养基的配方如下。
[0024] LB培养基dOg.L1 蛋白胨，5g.L1 酵母浸膏，lOg.L1NaCl，pH7.4。筛选E.coli JM109转化子时，培养基中添加氨苄青霉素100μg·mLS
[0025] YPD培养基：20g·L1蛋白胨，lOg·L1酉孝母浸膏，20g·L1葡萄糖；
[0026] 偏好型氮源阻遏培养基：1. 7g*L1YNB合成培养基（无氨基酸和硫酸铵），20g*L1 葡萄糖，lOmmol·L1谷氨酰胺，lOmmol·L1 (尿素或其他单一的非偏好型氮源）。培养不同 的营养缺陷型基因工