程菌株时，需补加菌株生长所必需的氨基酸或尿嘧啶（40mg·L3。
[0027] 实施例1 :调控因子Gln3p的改造及对减少尿素积累的影响
[0028] Gln3p核定位调控序列缺失截短表达载体的构建：以破壁提取的酿酒酵母CEN. PK2-1C单倍体模式菌株基因组为模板设计引物（正向引物添加SalI限制性内切酶酶切位 点；反向引物添加SacI限制性内切酶酶切位点）（见表1)，PCR扩增得到截短的GLN3。将 扩增得到的基因片段和PYX212质粒分别用SalI和SacI限制性内切酶酶切后，用DNA连 接酶连接，得到pYX212-Gln3Pl653。将所得质粒转化至E.coliJM109菌株中，送至上海生工 生物工程有限公司测序。经验证基因序列完全正确的质粒，再转化至酿酒酵母CEN.PK2-1C 单倍体模式菌株中。Gln3p完整表达载体的构建（实验对照）：设计引物扩增得到完整的 GLN3 (见表1)。以同样的方法构建得到pYX212-Gln3p。
[0029] 表1扩增GLN3部分基因的引物
[0030]
[0031] 使用MutanBESTkit定点突变试剂盒将Gln3p核定位序列上第344位、第347位 和第355位的丝氨酸位点突变为丙氨酸（A)，所用引用见表2。得到重组质粒pYX212-Gln3 Pi653"S344A,s347A,S355A。，然后转化到宿主酵母中得到酿酒酵母基因工程菌CEN.PK2-lC(pYX2 ^"GlnSpj 653, S344A, S347A, S355a) °
[0032] 表2Gln3p核定位序列上磷酸化位点定点突变引物表
[0033]
[0034] 将基因工程菌株和对照菌株（未改造的菌株），经30°C摇床（200r/min)培养24h 活化后，接种至偏好型氮源阻遏培养基中，在30°C摇床（200r/min)的条件下培养48h，其间 每隔8h检测培养基中尿素的利用情况。
[0035] 对酿酒酵母基因工程菌株和对照菌株在真实的发酵条件下，尿素利用情况进行检 测。在偏好型氮源阻遏培养基中，检测了 48h发酵过程中尿素含量的变化情况，实验结果如 图1所示。结果表明，48h后检测的尿素含量比对照菌株分别下降了 37.4%。
[0036] 实施例2 :调控因子Gatlp的改造及对减少尿素积累的影响
[0037] Gatlp核定位调控序列缺失截短表达载体的构建：以破壁提取的酿酒酵母CEN. PK2-1C单倍体模式菌株基因组为模板设计引物（正向引物添加SalI限制性内切酶酶切 位点；反向引物添加SacI限制性内切酶酶切位点）（见表3)，PCR扩增得到截短的GAT1。 将扩增得到的基因片段和PYX212质粒分别用SalI和SacI限制性内切酶酶切后，用DNA 连接酶连接，得到pYXSU-GatlPi375质粒。将所得质粒转化至E.coliJM109菌株中，送至上 海生工生物工程有限公司测序。经验证基因序列完全正确的质粒，再转化至酿酒酵母CEN. PK2-1C单倍体模式菌株中。Gatlp完整表达载体的构建（实验对照）：设计引物扩增得到 完整的GAT1 (见表3)。以同样的方法构建得到pYX212-Gatlp质粒。
[0038] 表3扩增GAT1部分基因的引物
[0039]
[0040] 使用MutanBESTkit定点突变试剂盒将Gatlp核定位序列上第360位 和第361位的丝氨酸位点突变为丙氨酸（A)，所用引物见表4。得到的重组质粒 pYX212-GatlPlm,S36QA,s361A转化到宿主酵母中得到酿酒酵母基因工程菌CEN.PK2-lC(pYX21 2-GatlPi 375，S360A，s361A)〇
[0041] 表4Gatlp核定位序列上磷酸化位点定点突变引物表
[0042]
[0043] 将基因工程菌株和对照菌株，经30°C摇床（200r/min)培养24h活化后，接种至偏 好型氮源阻遏培养基中，在30°C摇床（200r/min)的条件下培养48h，其间每隔8h检测培养 基中尿素的利用情况。
[0044] 对酿酒酵母基因工程菌株和对照菌株在真实的发酵条件下，尿素利用情况进行检 测。在偏好型氮源阻遏培养基中，检测了 48h发酵过程中尿素含量的变化情况，实验结果如 图1所示。结果表明，48h后检测的尿素含量比对照菌株分别下降了 44. 3%。
[0045] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种降低酵母尿素积累的方法，其特征在于，所述方法是对氮代谢物阻遏效应相关 调控因子Gln3p或Gatlp进行改造。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造是消除调控因子Gln3p或Gatlp 的核定位调控序列并突变核定位序列上的磷酸化位点。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述改造是将氨基酸序列为SEQIDNO. 1 的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第 355位的丝氨酸突变为丙氨酸。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述改造是将氨基酸序列为SEQIDNO. 2 的Gatlp的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝 氨酸突变为丙氨酸。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是将Gln3p或Gatlp进行改造 后的基因序列连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表 达。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pYX212。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母。8. -种尿素积累能力降低的酵母，其特征在于，所述酵母是将氨基酸序列为SEQ ID NO. 1的Gln3p或SEQ ID NO. 2的Gatlp进行改造后的基因序列连接到表达载体上得到重组 质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中而得到的。9. 根据权利要求8所述的酵母，其特征在于，所述改造是将Gln3p的第654-667位氨基 酸消除并将第344位、347位、355位的丝氨酸突变为丙氨酸，或者是将Gatlp的第376-510 位氨基酸消除并将第360、361位的丝氨酸突变为丙氨酸。10. 权利要求8或9所述酵母在食品方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种改造调控因子降低酵母尿素积累的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明方法是对调控因子进行改造，具体是消除调控因子Gln3p或Gat1p的核定位调控序列并突变核定位序列上的磷酸化位点，然后将改造后的序列连接到表达载体并转化到酵母中进行表达。本发明通过对2个不同的酿酒酵母氮代谢物阻遏效应相关调控因子的改造，从根本上较少酿酒酵母发酵过程中尿素的积累，得到的基因工程菌的尿素积累量分别减少了37.4％和44.3％。
【IPC分类】C12R1/865, C12N15/81, C12N1/19
【公开号】CN105274132
【申请号】CN201510810669
【发明人】周景文, 陈坚, 堵国成, 吕永坤, 赵鑫锐
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月20日