小分子量透明质酸的制备方法与应用及透明质酸裂解酶基因载体和工程菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及透明质酸生产领域，更具体地说涉及一种小分子量透明质酸的制备方 法与应用及透明质酸裂解酶基因载体和工程菌。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（HA)又名玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺双糖单位以 β_1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替连接而成的线性高分子酸性粘多糖。HA广泛分布于机 体的组织间质中并随分布部位的的不同而展现出不同的生理作用，如在皮肤中有较好的保 水作用，在关节滑液中有润滑和防磨损的作用，并对组织和血管的再生有重要作用，因而透 明质酸被广泛应用于化妆品、食品保健、美容整形和医药等领域。
[0003] 近来文献报道，小分子量的透明质酸展现出特有的生物活性。West等发现4~25 个双糖单位的透明质酸寡糖具有促进血管生成的活性，Mr低于lOOOODa的透明质酸对于血 管的再生有显著意义。Kim等将低分子量的透明质酸接枝到其他聚合物主链上制成聚合物 药物载体，做成温控释放型的药物载体。Brown分别给胸腺癌裸鼠尾静脉注射含透明质酸 (Mr为0. 825X106)和不含透明质酸的5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤，发现含透明质酸的5-氟尿 嘧啶和甲氨蝶呤明显增加药物的疗效，主要表现在动物体质量增加，肿瘤体积明显减少，淋 巴结转移率降低等。
[0004]目前，小分子量的透明质酸的制备方法主要有物理方法如超声波降解，化学方法 如过氧化氢和次氯酸钠降解法，和酶法降解如动物睾丸来源的透明质酸酶来酶解透明质 酸，三种方法相比，物理方法需要剧烈的条件，而且很难制备分子量在10KD以下的透明质 酸寡糖。化学方法对透明质酸结构的破坏程度较大，而且生产过程容易对环境造成污染，而 酶法制备小分子量透明质酸条件较温和，反应容易控制，但动物组织来源的的透明质酸裂 解酶数量有限，不利于工业化生产。因此，利用生物工程技术克隆和表达微生物来源的透明 质酸裂解酶基因对于小分子量透明质酸的工业化生产具有重要意义。
[0005] 关于对微生物来源的透明质酸酶的研究，其中最深入的是 Streptococcuspneumoniaea矛口Streptococcusagalactiae(groupB)〇JedrzejasMJ^ 对这两种酶的催化机制做了详细的阐述，两种酶均通过β-消除机制降解大分子量的透 明质酸得到4,5-不饱和双糖。中国专利化附032550764)提供了一种从芽孢杆菌发酵液 中分离纯化透明质酸裂解酶，并用纯化后的酶来制备低分子量的透明质酸盐。中国专利 (CN101633931)利用pBV220表达载体表达透明质酸裂解酶基因并在42°C条件下诱导，不过 得到的产物为包涵体，需要进行蛋白的复性，不利于大规模工业化生产。
【发明内容】
[0006] 本发明克服了现有技术中的不足，现有的酶法制备小分子量透明质酸条件较温 和，反应容易控制，但动物组织来源的的透明质酸裂解酶数量有限，不利于工业化生产，提 供了一种小分子量透明质酸的制备方法与应用及透明质酸裂解酶基因载体和工程菌，通过 克隆兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920透明质酸裂解酶基因hylb 片段，并构建包含其基因的表达载体，转到宿主菌后并通过宿主菌发酵获得酶活力较高的 透明质酸裂解酶，并用该裂解酶催化大分子量透明质酸的降解，通过控制反应条件，成功且 大量的制备小分子量的透明质酸。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0008] 透明质酸裂解酶基因载体，所述基因载体将长度为2208bp的hylb基因插入载体 pET28a中，形成载体pET28a: :hylb。
[0009] 所述hylb基因来源于兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920 基 因组。
[0010] 所述hylb基因始于第128个氨基酸GCC，结束于终止密码子TAG，所述hylb基因 序列如序列1所示。
[0011] 将所述载体pET28a::hylb转入宿主菌，即获得透明质酸裂解酶工程菌。
[0012] 所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0013] 所述诱导条件为在20-37°C的条件下，向培养基中加入0-lmMIPTG诱导过夜；优 选在20°C的条件下，向培养基中加入0.ImMIPTG诱导过夜。
[0014] 透明质酸裂解酶的制备方法为使用所述透明质酸裂解酶工程菌发酵获得，按照下 述步骤进行：
[0015] 步骤1，将所述透明质酸裂解酶工程菌接种到LB培养基上，在37°C的条件下培养， 得到菌液；
[0016] 步骤2,将上述菌液转入离心杯中，4°C离心，收集菌体；
[0017] 步骤3,将菌体置于预冷的PBS缓冲液中重悬，得到重悬后的菌体；
[0018] 步骤4,用超声破碎仪破碎重悬后的菌体，得到破碎后的菌液；
[0019] 步骤5,将上述破碎后的菌液，在4°C的条件下离心后，收集上清液，即得透明质酸 裂解酶粗酶液。
[0020] 在所述步骤3中，所述PBS缓冲液的体积比为5:1~10:1。
[0021] 小分子量透明质酸的制备方法，按照下述步骤进行：
[0022] 步骤1，底物配制：将野生型兽疫链球菌发酵后所得的发酵液经过处理提取得到 大分子量的透明质酸，将干燥后的大分子量透明质酸用超纯水溶解，并控制浓度在2~ 3mg/ml，使其完全溶解，得到底物；
[0023] 步骤2,酶解：将上述底物在37°C保温，并加入适量的透明质酸裂解酶，并反应一 段时间后，即得降解后的透明质酸溶液；
[0024] 步骤3,灭活：将上述降解后的透明质酸溶液用沸水煮沸1~2min，得到经过灭活 的透明质酸溶液；
[0025] 步骤4,过滤：将上述经过灭活的透明质酸溶液用0.45um滤膜过滤，除去杂质，得 到经纯化的透明质酸溶液；
[0026] 步骤5,沉淀：向上述经纯化的透明质酸溶液中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，即 得到小分子量透明质酸沉淀；
[0027] 步骤6,冷冻干燥：将上述沉淀在-80°C条件下冷冻干燥，得到小分子量透明质酸 成品。
[0028] 在所述步骤2中，所述透明质酸裂解酶的加入量为每1L底物加入46U~ 79U(4. 6X105IU~7· 9X105IU)酶活力单位的透明质酸裂解酶。
[0029] 在所述步骤2中，所述酶解反应时间为0~6h。
[0030] 小分子量透明质酸在食品、化妆品或者医药领域的应用。
[0031] 本发明的有益效果为：
[0032] 1、本发明利用基因工程技术克隆了微生物来源的透明质酸裂解酶基因，并使其成 功表达，获得了酶活力较高的可溶性酶-透明质酸裂解酶；
[0033] 2、本发明提出的酶法制备小分子量透明质酸做到了反应条件温和，节约能源，分 子量可控等特点，易于形成工业化规模生产。
【附图说明】
[0034] 图1是本发明中透明质酸裂解酶基因载体的构建图谱；
[0035] 图2是本发明中hylb基因表达载体的PCR验证图，其中，Μ为DNAMarker，l为阴 性对照，2为阳性对照，以基因组为模板，3和4为PCR扩增hylb基因，大小为2208bp;
[0036] 图3是本发明中酶切验证图，其中，Μ为DNAMarker;1和2为EcoRI和Xhol双酶 切验证质粒；
[0037] 图4是本发明制备得到的透明质酸裂解酶SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，Μ为蛋 白Marker的SDS-PAGE蛋白电泳图；1为流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；2和3为采用咪 唑含量为20mM流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；4和5为采用咪唑含量为60mM流穿液的 SDS-PAGE蛋白电泳图；6和7为采用咪唑含量为80mM流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；8和9 为采用咪唑含量为100mM流穿液的SDS-PAGE蛋白电泳图；10和11为采用咪唑含