采用透明质酸作为不同类别治疗活性剂的载体分子的制作方法

专利名称：采用透明质酸作为不同类别治疗活性剂的载体分子的制作方法
采用透明质酸作为不同类别治疗活性剂的载体分子
现有技术
许多具有疏水特性因而在水中表现出低溶解度的药物常与亲水性聚 合物结合以增加其水溶性并增进药物的生物利用度。为此目的，使用了 大量显示出生物相容性、生物可降解性的聚合物材料，其中部分材料是 生物活性的、具有充足的药物负载能力以及具备药物靶向能力。其实例
有聚谷氨酸、聚乙二醇、羧甲基葡聚糖和透明质酸。然而，PLG、 PEG 和CMD缺乏生物活性及革巴向能力，而HA由于除生物活性外还具备将 药物靶向疾病部位的能力因而优于其他材料。许多肺瘤类型会过度表达 CD44受体；HA可用于结合抗癌药物并靶向给药至患病部位。衍生化 HA的胞吞反应已被证实可发生于CD44 HA受体过表达的细胞系中。荧 光标记的HA-紫杉醇结合物已被证实对已知过表达HA受体的人癌细胞 具有选择性毒性。HA肝脏受体(HARLEC)的存在表明HA可被用作载 体分子将药物靶向肝脏组织。HA曾被证实可用于小鼠结肠腺癌的肝转 移。
W00168105曾描述了 C-6伯羟基被二氬叶酸还原酶抑制剂(DHFR) 取代的HA制备方法。该结合是通过HA的选择性面化反应制备HA-6-囟素后再用DHFR置换卣素而得。该结合反应还赋予了化合物抗增殖活 性，但含有卣素基团残留的问题仍然存在。
Carbo Res. 340, 2229-2235， 2005曾描述在多糖中选择性引入离去基 团，其中报告了在乙酰胺和氯化锂的混合物中进行纤维素的曱苯磺酰化 反应；其所选的条件可4吏其以封闭所述位点并在游离位点f 1入其他化学 基团为目的的所有伯羟基完全磺酰化。
附图简述


图1:表示DDSs的化学式HA-6-氨甲喋呤、HA-6-布洛芬、HA-6-
青霉素G。
图2:表示实施例9中所得HA-6-OMs的DOSYNMR图if(在DOSY 的加权一维NMR语中，仅有刚性大分子存在，为聚合物的化学修饰提 供了证据)。
图3:表示HA-6-OMs的I3C NMR谱，出现DIEA成盐峰。 图4:表示实施例24中所得HA-6-MTX的DOSY NMR谱。 图5:表示实施例24中所得HA-6-MTX的"CNMR谱。 图6:表示实施例26中所得HA-6-布洛芬的DOSYNMR谱。 图7:表示实施例26中所得HA-6-布洛芬的"CNMR谱。 图8:表示实施例29中所得HA-6-青霉素G的DOSYNMR语。
发明详述
本发明第 一 方面提供了由透明质酸(HA)和治疗活性剂组成的药物 输送系统(DDS)，其中该活性剂与透明质酸的W-乙酰基-D-葡糖胺残基 的C-6位共价结合，但除了如化学式(I)的活性剂而外
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其中
R2和R4分别代表-NH2、 -OH、 -OCH3、 d-Cs烷基、=0; X和Y 代表-C(R5)=、 -CH(R5)-、 -NH-、 -N=),其中Rs代表-H、 C广C5烷基； Z代表-CH(R10)-、 -N(R10)-、 -O-, R10代表-H、 CrC5烷基、C!-C5 烯基、d-Cs炔基、有l-3个杂原子的5-6元杂环，其中所述杂原子选自 氮、硫和氧；Ar代表l,4-苯基、与一个或多个5-6元芳香环稠合的1，4-苯基、与一个或多个5-6元杂环稠合的1，4-苯基，其中所述Ar可能被R2 取代；环A和b可分别各自为芳香环或非芳香环。
如化学式(I)的化合物是W001681 05中描述的二氢叶酸还原酶抑 制剂。
透明质酸(本文也指HA)是由二糖重复单元组成，包4舌D-葡糖醛 酸和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(W-乙酰基-D-葡糖胺)，通过p(1—3)糖 苷链合；D-葡糖醛酸残基可以以酸的形式存在，也可以以盐的形式存在。 每个重复单元通过p(1—4)糖苦链彼此结合形成线性聚合物。 本发明中使用的术语透明质酸涵盖其酸的形式及成盐形式。 术语透明质酸通常用于描述总的一类具有不同分子量的HA分子级 分或所述化合物的水解级分。为了本发明目的，透明质酸的平均分子量 优选包括1万至100万，更优选为2万至50万。
治疗活性剂选自属于多种不同治疗种类的药物镇痛药、抗高血压 药、麻醉药、利尿药、支气管扩张药、钓通道阻滞药、胆石威能药、CNS 药、雌激素、免疫调节剂、免疫抑制剂、抗脂肪药、抗焦虑药、抗溃疡 药、抗关节炎药、抗心绞痛药、抗生素、抗炎药、抗病毒药、溶血栓药、 血管扩张药、解热药、抗抑郁药、安定药、抗肺瘤药、粘液溶解药、麻 醉拮抗剂、激素、抗惊厥药、抗组胺药、抗真菌药、抗银屑病药。
这些治疗活性剂含有亲核基团。亲核基团属电子对供体基团，例如 羧基、氨基、取代氨基、羟基、巯基、酰氨基团；优选为M基团。
DDS中透明质酸和活性剂之间的化学键结形式是酯、氨基、醚、硫 醚、酰胺。优选为酯。
DDSs可为酸的形式，也可为盐的形式。若为盐的形式，可选择与碱 金属(优选Na或K )、碱土金属(优选Ca或Mg )、过渡金属(优选Cu、 Zn、 Ag、 Au、 Co、 Ag)成盐。成盐反应采用技术人员所知的方法进行。
根据需要，DDSs上的仲羟基也可经衍生化形成下述基团，所述基团 选自-OR 、 -OCOR 、 -S02H 、 -OP03H2 、 -0-CO-(CH2)n-COOH 、 -0-(CH2)n-OCOR，其中n是l國4， R是C广d。烷基、-丽2、 -NHCOCH3。 这些取代反应均可通过本领域共知的方法很容易地完成，通常是为了调 节DDSs的亲水特性而加以选用。
DDSs中治疗活性剂的总量被定义为取代度(C6-DS);取代度可表示 为活性剂相对于DDS总重的重量。/。(C6-DSw)，或者表示为活性剂相对于 经修饰的HA重复单元摩尔数的摩尔。/o(C6-DSm。i)。
在本发明的DDS中，C6-DSw优选为0.1-60%之间，更优选1-50%, 甚至更为优选5-40%。
如实验部分所证实，本发明的DDSs其特征在于活性剂直接连接到 透明质酸7V-乙酰基-D-葡糖胺的伯羟基基团上。HA的其他羟基不参与药 物的化学连接。并且，DDSs性质稳定，不含可能对其发挥药学用途产生 有害作用的非预期反应副产物及杂质。
他们保留了治疗药剂的药理作用。因此，可成功用于治疗DDS中特 定治疗活性剂相应的<壬<可病症。
因此，本发明的另一方面是将所述的DDSs应用于药剂生产中以治 疗各个治疗药物相对应的病症。所述病症选自肿瘤、皮肤病、4艮屑病、 炎症、类风湿性关节炎和感染性疾病。
本发明还有一方面是包括本发明DDSs与药学可接受的辅料和/或稀 释剂相混合的药物组合物。药物组合物可为液体形式或固体形式；可经 口、胃肠道外、局部途径给药。尤其让人感兴趣的是包括所发明DDSs 的可注射药物组合物。
本发明另一方面是制备HA和治疗活性剂给药系统的方法，其中治 疗活性剂是除具有上述特征的如化学式(I)化合物之外。令人惊讶的发 现M应不仅在具有化学式(I)结构含两个羧基和杂环的化合物中发生， 而且该反应高度也适用于大量属于不同治疗类别的各种活性剂。
该方法包括以下反应步骤 - (a)在游离形式或盐形式透明质酸的W-乙酰基-D-葡糖胺单元中的 C-6位点引入离去基团以获得HA-6-活化物；
(b)通过以治疗活性剂上所含的亲核基团取代离去基团(HA的C6 位点)使得HA-6-活化的C6位与治疗活性剂之间形成化学键，从而得到 HA-6-治疗活性剂；
(c) 尽可能置换步骤(b)所得的HA-6-治疗活性剂中任何未取代 的离去基团；
(d) 回收HA-6-治疗活性剂。
通过该方法，所得DDSs可能其C6-DSw优选在0.1-60。/。之间，更优 选1-50%,甚至更为优选5-40%。
实施本发明的方法有两种不同方式。在第一种方式中，将步骤(a) 所得HA-6-活化物从反应混合物中分离，再才艮据步骤(b)与治疗活性剂 反应生成最后的HA-6-治疗活性剂，也可任选是否经过步骤(c)。
在实施本方法的第二种方式中，将步骤(a)所得含HA-6-活化物的 反应混合物直接进行步骤(b)反应。施行反应的第二种方式优点在于避 免了对HA-6-活化物的分离步骤。
起始HA可以是游离形式或盐的形式，其中平衡离子优选是碱金属 或碱土金属或者是含氮平衡离子。在后者的情形中，平衡离子可能包含 杂环，该杂环选自p比梵、p比口秦、嘧咬、p比咯、p比哇、咪哇、三哇、四喳， 其可被一个或多个Cl-C6烷基取代。含氮平衡离子的优选实施例是铵、 四丁铵(TBA)、吡啶鐵或^w-可力丁鎿(^m-collidinium)离子。
步骤(a)属于选择性反应，通过将适当试剂加入充分搅拌的HA(游 离形式或盐形式)溶于非质子有机溶剂的混悬液或溶液中进行反应。
引入HA的葡糖胺单元C-6位点的离去基团为任意电子对受体基团， 它会在亲核基团取代过程中脱离。离去基团选自磺酸根基团、膦酸根基 团(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亚硝酸根(N02-)、离素(优选氯)、 硫酸根基团、卤代硫酸根基团、硝酸根、卣代亚硫酸根(氯代亚硫酸根)。
若离去基团为卣素，则卣化反应按W09918133和WO0168105所述进行。在g素基团中氯族为优选基团，进行囟化反应的优选试剂是甲磺
酰氯的a/;w-二甲基甲酰胺溶液。
该步反应使得HA-6-活化物生成。
进行步骤(b)是将步骤(a)所得HA-6-活化物或其盐与治疗活性 剂反应。在该步反应中，离去基团被活性剂中含有的亲核基团取代，使 得在HA的C-6位点与活性剂之间形成共价键。所述键的化学性质取决 于亲核基团的化学性质。若亲核基团为歡基则可以形成酯键。在HA和 治疗活性剂之间形成的其他化学键有氨基键、醚键、硫醚键、酰胺键。
步骤(c)是一个可选步骤，它可以是允许可行的未取代离去基团进 行置换的任何适当反应。可通过例如光分解反应、还原反应来完成这种 置换。在某些情形中步骤(c)不是必需的，因为未取代的离去基团可能 在步骤(b)中由于反应条件或在处理过程中已被破坏。
在步骤(d)中，通过常规技术对得到的HA-6-治疗活性剂(DDS) 力口以回jR。
在本方法的一种优选实施方式中，离去基团是磺酰基，因此所得活 化HA为HA-6-磺酰化物。该优选反应包括以下反应步骤
(a) 向盐形式HA的7v-乙酰基-D-葡糖胺单元C-6位点引入磺酸根 基团，以获得HA-6-磺酰化物；
(b) 通过以治疗活性剂上的亲核基团置换磺酸根基团(HA的C6 位)使得在HA-6-磺酰化物的C-6位点与治疗活性剂之间形成化学键， 从而得到HA-6-治疗活性剂；
(d)回收HA-6-治疗活性剂。
在该实施方式中，步骤(a)的选择性石黄酰化反应采用含有才/U威或无
才;u威(优选有机碱)的烷基-或芳基-磺酰卣(优选磺酰氯)作为磺酰化试
剂进行。烷基-或芳基-磺酰卣优选选自甲磺酰基(mesyl)、甲苯-对磺酰基 (tosyl)、三氟曱磺酰基、三曱磺酰基、三丙磺酰基、l，l-磺酰基-咪唑等的 酰卣。
有机碱优选选自各种有机胺，例如二异丙基乙胺、三乙胺。 溶剂选自二曱基甲酰胺、二曱乙酰胺、二甲基亚砜、甲酰胺。 常规的磺酰化过程如下。将碱(优选有机碱)加入盐形式HA (优 选其有机碱的盐)的混悬液或溶液中，同时在氮气流下搅拌。滴加溶于
适当溶剂(优选相同溶剂)的烷基-或芳基-磺酰氯。在经过范围在2-90 分钟(优选45-75 )的时间段之后，加入NaHC03使反应猝灭，以去除反 应过程中在HA仲羟基处形成的曱酸酯基团。接着继续反应约10-20小 时，优选18小时。反应产物(HA-6-磺酰化物)既可通过现有技术如沉 淀、干燥从溶液中直接回收，也可在回收前对溶液进行处理，而得到适 当盐形式的HA-6-磺酰化物，例如HA-6-磺酰化:TBA。
反应条件应温和；事实上，反应可在室温或更低温度下成功进行， 不需冷却-加热循环，pH条件也应温和。
所用试剂需限量，合适的用量是在相对于HA重复单元有2-20摩尔 当量(优选4-12摩尔当量)的有机胺(例如D正A)存在的情形下，使 用相对于HA重复单元l-10摩尔当量(优选2-6摩尔当量)的磺酰面(例 如甲磺酰氯)。
在上述反应条件下得到的透明质酸-6-磺酰化物所具有的取代度 (DSn^)范围在10%-91%摩尔/摩尔之间，优选20-90%,甚至更优选 40-80%。曱磺酰反应对iV-乙酰基-D-葡糖胺残基伯位(C-6)的选择性在50-100%之间(C6-DSm()1)。部分曱磺酰反应也发生在仲位，例如W-乙酰 基-D-葡糖胺的C-4位点和D-葡糖醛酸残基的C-2、 C-3位点。他们的结 构和聚合物中甲磺酰基团的取代度通过NMR光谱进行确认。
在磺酰化反应的优选实施方式中，步骤(b)使得在HA和治疗药剂 上存在的g之间形成酯键。
在这个最后的实施方式中，步骤(a)如上所述进行，步骤(b)通 常按下述程序进行。
将含羧基的活性药剂溶液加入含有碱金属或碱土金属(如碳酸铯) 的HA-5-磺酰化TBA盐或钠盐形式(优选TBA)的溶液中。反应在40-90 。C之间进行，优选在80。C下持续搅拌，优选处于氮气流中时间范围5-42 小时，优选8-20小时(18小时)。根据现有技术对反应混合物进行处理。
本发明另一方面是包括透明质酸和化学式(I)化合物的药物输送系 统，化学式(I)化合物的羧基通过酯键的方式与透明质酸的iV-乙酰基-D-葡糖胺单元C-6位共价连接，所述DDS可采用下述特定方法获得。该新 型DDSs包含与HA的C-6位直接相连的化学式(I)的化合物，其特征 在于HA重复单元中没有其他幾基参与4建4妄，即既不与药物，也不与其 他化学基团键接。特别是该DDSs在HA单元的伯位和仲位均无残留的 离去基团(例如磺酸根基团)。用语"无"是指经NMR测定，残留的离 去基团含量低于0.5%w/w。该特点维持了原始HA化学结构的一致性并 保留了碳原子构型，这些特性/方面对于保证其有效性和与特定受体的相 互作用非常重要。
不同的是，WO0168105描述的HA与氨曱喋呤的结合却包含残留氯 原子，这是在卣化步骤过程中引入多糖中的。
在各种具有化学式(I)的化合物中，优选化合物是氨曱喋呤。氨曱
喋呤(MTX)如化学式(I)所示，其中R2和R4是-NH2; A环是芳香环； B环是芳香环；X和Y是-N=; Z是-N(CH3)-; Ar是1，4-苯基。DDSs 的C6-DSw优选0.1-60%,更优选1-50%,甚至更优选5-40%,其MW在 10，000-500,000之间。
制备该DDS的方法包括以下反应步骤
(a) 在游离形式或盐形式透明质酸的iV-乙酰基-D-葡糖胺单元C-6 位点引入离去基团以得到HA-6-活化物，该离去基团选自磺酸根基团、 膦酸根基团(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亚硝酸根(N02-)、硫酸根 基团、卣代硫酸根基团、硝酸根、卣代亚硫酸根(氯代亚硫酸根)；
(b) 通过以化合物(I)上所含的羧基取代离去基团(HA的C6位 点)使得在HA-6-活化物的C6位点与如化学式(I)的化合物之间形成 酯键，从而得到HA-6-化学式(I)化合物；
(d)回收HA-6-化学式(I)化合物。
在优选实施方式中，步骤(a)为磺酰化反应，由于引入磺化基团的 试剂是含有机碱或无机碱的烷基-或芳基-磺酰卤，优选磺酰氯。优选试剂 为曱磺酰氯或甲苯-对-磺酰氯，有机碱是二异丙基乙胺或三乙胺。
DDS可采用上述方法按两种不同方式获得。在第一种方式中，将步 骤(a)所得HA-6-磺酰化物从反应混合物中分离，再按步骤(b)与如 化学式(I)的化合物进行反应，得到最后的HA-6-化学式(I)化合物。
在实施本方法的第二种方式中，步骤(a)所得含HA-6-磺酰化物的 反应混合物直接进行步骤(b)反应。施行反应的第二种方式优点在于避 免了对HA-6-磺酰化物的分离步骤。
实验部分
实施例1:结构测定
通过NMR以3.10+3.32ppm区(HA链的1H和甲磺酸根的3H)峰 值对1.95ppm(HA链的3H)峰值积分，以确定HA-6-曱磺酰化物(HA-Ms) 中甲磺酸根的含量。
实施例2:结构测定
通过NMR以7.8 ppm ( 2H )、 7.5ppm (2H) and 2.45ppm (3H)处的对 甲苯磺酸根峰值对1.95ppm (HA链的3H)峰值积分，以确定HA-6-对 曱苯磺酰化物(HA-Ts)中甲苯磺酸根的含量。
实施例3:结构测定
通过NMR以6.0+8.6ppm区(MTX的5H)峰值对1.85+2.58 ppm区 (HA链的3H和MTX的4H)峰值积分，以确定HA-6- MTX中氨甲喋 呤的含量。
实施例4:结构测定
通过NMR以7.02+7.24ppm (4H)、 2.38ppm (2H)、 1.40ppm (3H)、 0.78ppm (6H)区的布洛芬峰值对1.95ppm ( 3H)处HA链峰值积分以确定 HA-6-布洛芬中布洛芬的含量。
实施例5:结构测定
通过NMR以7.05+7.20ppm ( 5H )、 5.55ppm (1H)、 5.40 (1H)区青霉 素G峰值对1.95ppm ( 3H)处HA链峰值积分，以确定HA-6-青霉素G 中布洛芬的含量。
实施例6:根据氨甲喋呤药典专著OJSP 23第页)采用HPLC以
碱水解前后样品进行分析以测定氨曱喋呤含量。测定条件是色语 Dionex DX-600,色i普柱Phenomenex柱Synergi Hydro-RP80，柱尺 寸150x460mm，柱内颗粒直径4p，温度40°C，洗脱液900/0 0.2M 磷酸氢二钠/0.1M枸橼酸(630:270)、 10%CH3CN，洗脱条件0.5 mL/min， 检测二极管阵列(范围200-780nm),定量检测所选波长302 nm,注 射体积25 4全测时间30分钟。将HA-MTX按适当浓度直接溶于 MilliQ水，制备用于测定游离氨甲喋呤的溶液。室温下在0.1 M NaOH 中进行碱水解2小时后测定总氨甲喋呤含量。溶液经1 M盐酸中和后过 滤(0.45 pm) (SartoriusMinisartRC25 17795Q),之后进样至HPLC系统 中。采用已知浓度的氨曱喋呤标准溶液测定校准曲线。该方法可测出样 品溶液中的MTX浓度，经样品浓度标准化后得到DS重量％w/w。 实施例7:重均分子量(Mw)测定。
采用HP-SEC(高压尺寸排阻色谱法)测定透明质酸DDS的分子量。 测定条件是色谱HPLC泵980-PU (Jasco系列号B3901325)带Rheodyne 9125注射器，色谱柱TSKPWxl(TosoBioscience)G6000+G5000+G3000 6、 10、 13pm粒径，温度40°C,流动相0.15 MNaCl + 0.01%NaN3， 流速0.8 mL/min,检测MALS (WYATT DAWN EOS—WYATT, USA), X二690 nm, (dn/dc = 0.167 mL/g)， UV分光光度计875-UV (Jasco，序列号 D3693916),人=305 nm, Interferometric Refractive Index OPTILAB REX (WYATT，USA), X=690nm，灵敏度128x ，温度35。C，注射体积:100 jul, 4全测时间60分钟。
将HA-C1、 HA-OMs、 HA-MTX、 HA-结合不同药物的待测样品溶于 0.9 %NaCl,浓度约为1.0 mg/ml,保持搅拌12小时。接着溶液经0.45
多孔滤器过滤，最后进样至色i普。该分析法可测定Mw (重均分子量)、 Mn (数均分子量)、PI (多分散性)。Mw和Mn值以g/mol表示。聚合物 样品溶液的浓度通过折光率积分加以控制。
实施例8: 6-6>-甲磺酰透明质酸(HA-6-Ms或HA-Ms)的制备
在氮气下向500 mg (0.806 mmol) HATBA盐(MW 20，000)溶于20 ml 二甲基亚砜(DMSO)的溶液中搅拌加入l.llml (6.48mmol) 二异丙基乙胺 (DIEA)。接着室温下滴加甲磺酰氯(MsCl)(314pL;4.03mmo1),从而形成 才登色溶液。室温搅拌1小时后，把三分之一反应混合液倒入饱和NaHC03 溶液(50ml)中使反应猝灭，pH9下搅拌过夜。所得溶液经超滤后，置旋 转式蒸发器中浓缩再经冷冻干燥得到40mg灰白色固体(经NMR检测总 DS为83%摩尔/摩尔)。
剩余反应混合液搅拌过夜再按上述操作进行处理，得到90mg灰白 色固体(经NMR检测总DS为86%摩尔/摩尔)。
总产量130mgHA-Ms钠盐(40。/0)。
& NMR (D20) ppm: 1.95 (s, 3H， NHCOCH3)， 3.23 (s, 2.58H， MsO), 3.2+4.2 (m， 7.42H， HA链)，4.3+4.7 (m， 2H，端基+ 1.72H， CH-OMs); 13C NMR (D20) ppm: 23 (NHCOgH3)， 37 (MsO)， 55， 61 (CH2OH)， 68, 69.5 (CH2OMs)， 72, 74, 75, 76， 80, 83， 101， 103， 174, 175。
实施例9: 6-Q-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备
在氮气下向5.00 g (8.06 mmol) HA TBA盐(MW 20,000)溶于200 ml DMSO的溶液中搅拌加入13.9ml (81mmol)DIEA。接着室温下滴加MsCl (3.2 ml; 41 mmol),从而形成橙色溶液。室温搅拌l小时后，把反应混合 液倒入饱和NaHCO3溶液(400ml)中使反应猝灭，用水调节总体积至IL(终
pH:9.5)，持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置旋转式蒸发器中 浓缩。取小部分该浓缩物于旋转式蒸发器中蒸发干燥(100 mg)供NMR检 测；NMR氢傳测得总曱磺酸根DS为91%摩尔/摩尔，NMR氩谱测得伯 位甲磺酸根为58%摩尔/摩尔，C6位点选择性为64%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 4.62g灰白色固体(HA-Ms:TBA盐)。
实施例10: 6-(9-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向2.50 g (4.03 mmol) HA TBA盐(MW 20，000)溶于100 ml DMSO的溶液中搅拌加入5.6 ml (32.7mmol) DIEA。接着室温下滴加 MsCl(1.3ml; 16.7mmol),从而形成橙色溶液。室温搅拌l小时后，把反 应混合液倒入饱和NaHC03溶液(200ml)中以使反应猝灭，用水调节总体 积至600ml (终pH: 9.2),持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置 旋转式蒸发器中浓缩。取小部分该浓缩物经冷冻千燥(136mg)供NMR检 测NMR氩语测得总甲磺酸根DS为79%摩尔/摩尔，NMR氬谱测得伯 位甲磺酸根为64%摩尔/摩尔，C6位选择性为81%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 2.10g灰白色固体(HA-Ms:TBA盐)。
实施例11: 6-0-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向3.00 g (4.84 mmol) HA TBA盐(MW 20，000)溶于100 ml DMSO的溶液中搅拌加入8.4 ml (48.4 mmol) DIEA。接着室温下滴加 MsCl (1.92 ml; 24.2 mmol),从而形成橙色溶液。室温搅拌15分钟后，把 反应混合液倒入饱和NaHC03溶液(200ml)中《吏反应猝灭，用水调节总体 积至600ml (终pH: 9.5),持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置
旋转式蒸发器中浓缩。取小部分经冷冻干燥(187mg)供NMR检测NMR 氢镨测得总甲磺酸根DS为76。/。摩尔/摩尔，NMR氢谱测得伯位甲磺酸根 为58%摩尔/摩尔，C6选择性为76%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 2.561g灰白色固体(HA-Ms:TBA盐)。
实施例12: 6-(9-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向3.00 g (4.84 mmol) HA TBA盐(MW 20,000)溶于DMSO (100 ml)的溶液中搅拌加入4.96ml (29.0mmo1) DIEA。接着室温下滴加 MsCl(1.13ml; 14.5mmo1)，从而形成橙色溶液。室温搅拌15分钟后，把 反应混合液倒入饱和NaHC03溶液(200ml)中使反应猝灭，用水调节总体 积至600ml (终pH: 9.5)并持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置 旋转式蒸发器中浓缩。取小部分经冷冻干燥(248 mg)供NMR检测NMR 氢谱测得总甲磺酸根DS为55%摩尔/摩尔，NMR氢谱测得伯位甲磺酸根 为41%摩尔/摩尔，C6选择性为75%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 2.41g灰白色固体(HA-Ms:TBA盐)。
实施例13: 6-(9-曱磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向3.00 g (4.84 mmol) HA TBA盐(MW 20，000)溶于DMSO (100 ml)的溶液中搅拌加入4.96ml (29.0mmo1) DIEA。接着室温下在20 min内滴加MsCl (1.13ml; 14.5mmol)溶于二氯甲烷(20ml)的溶液，从而形 成橙色溶液。之后立即把反应混合液倒入饱和NaHCO3溶液(200ml)中使 反应猝灭，用水调节总体积至600ml (终pH: 9.5)并持续搅拌过夜。所得 溶液在通风橱中超滤后置旋转式蒸发器中浓缩。取小部分经冷冻干燥 (172mg)供NMR检测NMR氢语测得总甲磺酸根DS为85%摩尔/摩尔， NMR氢i普测得伯位甲磺酸根为50%摩尔/摩尔，C6选择性为59%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 2.78g灰白色固体(HA-Ms:TBA盐)。
实施例14: 6-0-曱磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备
向3.00 g (7.48 mmol) HA钠盐(MW 20，000)溶于DMSO (100 ml)的混 悬液中搅拌加入DIEA (12.8ml; 74.8mmol)和MsCl (2.90ml; 37.4mmo1), 在一分钟之内可观察到形成深橙色。室温搅拌1小时15分钟后，把反应 混合液倒入饱和NaHC03溶液(200ml)中使反应猝灭，用水调节总体积至 800ml (终pH: 9.5)并持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置旋转 式蒸发器中浓缩。取小部分经冷冻干燥(0.15mg)供NMR检测NMR氬 谱测得总甲磺酸才艮DS为5%摩尔/摩尔。
实施例15: 6-0-甲苯磺酰透明质酸的制备
HA:TBA盐(1.01S g; 1.64 mmol) (MW 20000)溶于30ml无水DMF的 溶液在室温下用Et3N (3.2 mL; 23.0 mmol)和TsCl (2.24 g; 11.7 mmol)处 理；反应混合液变为橙红色且溶液变稠。1小时后，6ml反应混合液置旋 转式蒸发器中浓缩为一半体积，所得样品用丙酮沉淀。将少量固体溶于 DMSO-d6，进行111 NMR和DOSY NMR光谱检测，结果显示曱苯磺酰 DS为16。/o摩尔/摩尔；回收得到曱酰化物样品-95mg。
丄H NMR (d6-DMSO) ppm: 1.95 (s， 3H， NHCOCH3), 2.45 (s, 0.49H，甲 苯磺酸根CH3)， 3.0+5.4 (m， 12.3H， HA链和端基)，7.5 (d， 0.34H，甲苯磺酸 芳族)，7.85 (d， 0.30H,甲苯磺酸芳族)，8.0+8.5 (m, 2.14H, O國CHO甲酯 基)。 其余反应液加热至50。C 1小时，在pH 9的饱和NaHC03溶液中使 反应猝灭，搅拌24小时，中和后过滤去除固体。溶液再经超滤并冷冻干 燥。进行DMSO-d6的}HNMR和DOSYNMR光谱检测，结果显示曱苯 磺酰DS为12%摩尔/摩尔。回收得到样品55mg。
实施例16: 6-(9-对-甲苯磺酰透明质酸的制备
HA:TBA盐(1.053 g; 1.70 mmol) (MW 20000)溶于30ml无水DMF的 溶液，在O'C下用Et3N (3.2 mL; 23.0 mmol)和TsCl (2.24 g; 11.7 mmol) 处理；反应混合液变为橙红色且溶液变稠。30分钟后，将其置于室温下， 放置1小时后，把反应混合液置旋转式蒸发器中浓缩为一半体积，所得 样品用丙酮沉淀。取少量固体溶于DMSO-d6,进行& NMR和DOSY NMR光谱检测，结果显示甲苯磺酰DS为45%摩尔/摩尔；回收得到甲酰 4匕物纟羊品700mg。
& NMR (d6-DMSO) ppm.. 1.95 (s， 3H， NHCOCH3), 2.45 (s， 1.36H，甲 苯磺酸根CH3)， 3.0+5.4 (m， 13.0H， HA链和端基)，7.5 (d， 0.97H，甲苯磺酸 芳族)，7.85 (d, 0.90H，甲^s黄酸芳族)，8.0+8.5 (m， 2.33H, O國CHO曱酯 基)。
实施例17: 6-(9-曱磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向500mg (0.806mmo1) HA TBA盐(MW 20,000)溶于20 ml DMSO的溶液中搅拌加入829pL (4.84mmo1) DIEA。接着在室温下滴加 MsCl(188pL;2.42mmo1)，从而形成橙色溶液。室温搅拌l小时后，把反 应混合液倒入饱和NaHC03溶液(40ml)中使反应猝灭，用水调节总体积 至100ml (终pH: 9.5)并持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置旋 转式蒸发器中浓缩。该溶液经冷冻千燥后得到白色固体392mg。 NMR氢
谱测得总甲磺酸根DS为77%摩尔/摩尔，NMR碳谦测得伯位甲磺酸根为 59%摩尔/摩尔，06位点选择性为77%。
实施例18: 6-(9-曱磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向500mg (0.806mmo1) HA TBA盐(MW 20，000)溶于20 ml DMSO的溶液中搅拌加入414^L (2.42mmo1) DIEA。接着在室温下滴加 MsCl (94pL; 1.21mmo1),从而形成橙色溶液。室温搅拌l小时后，把反 应混合液倒入饱和NaHC03溶液(40ml)中使反应猝灭，用水调节总体积 至100ml (终pH: 9.5)并持续搅拌过夜。所得溶液在通风橱中超滤后置旋 转式蒸发器中浓缩。该溶液经冷冻干燥后得到白色固体310mg。 NMR氢 谱测得总甲磺酸根DS为34。/。摩尔/摩尔，NMR碳谱测得伯位甲磺酸根为 22%摩尔/摩尔，C6位点选择性为65%。
实施例19: 6-<9-甲磺酰透明质酸(HA-Ms〗的制备 在氮气下向500mg (0.806mmo1) HA TBA盐(MW 20,000)溶于20 ml DMF的溶液中搅拌加入829|uL (4.84mmol) D正A。接着在室温下滴加 MsCl(188jiL;2.42mmo1)，从而形成黄色溶液。室温搅拌l小时后，把反 应混合液倒入饱和NaHC03溶液(40ml)中使反应猝灭，用水调节总体积 至100ml (终pH: 9.5);持续搅拌过夜。此后pH调高至lO,混悬液搅拌 3天，由此大部分固体被溶解。将其过滤后，所得溶液进行超滤后置旋 转式蒸发器中浓缩。该溶液经冷冻干燥后得到白色固体270mg。 NMR氢 镨测得总甲磺酸根DS为42。/。摩尔/摩尔，NMR碳谱测得伯位曱磺酸根为 40%摩尔/摩尔，C6位点选择性为95%。
实施例20: 6-Q-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在-10。C下氮气中向500mg (0.806mmol) HA TBA盐(MW 20，000)溶
于20 ml DMF的溶液中搅拌加入829pL (4.84mmol) DIEA。接着滴加 MsCl (188pL; 2.42mmol)，所得混合液于-10。C搅拌1小时。向反应混合 液中加入饱和NaHC03溶液(40ml)使反应猝灭，用水调节总体积至 100ml (终pH: 9.5);持续搅拌过夜。将pH调高至lO，混悬液搅拌3天， 由此大部分固体被溶解。所得溶液进行超滤后置旋转式蒸发器中浓缩。 该溶液经冷冻干燥后得到白色固体207mg。 NMR氢镨测得总曱磺酸根 DS为37。/。摩尔/摩尔，NMR碳谱测得伯位甲磺酸根为37%摩尔/摩尔，C6 位点选择性为100%。
实施例21: 6-(9-曱磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在氮气下向500mg (0.806mmo1) HA TBA盐(MW 20，000)溶于20 ml N-甲基J-吡咯烷酮的溶液中搅拌加入W^L (4.84mmol) D正A。接着在 室温下滴加MsCl (188jliL; 2.42mmo1)，从而形成黄色溶液。室温搅拌1 小时后，向反应混合液中加入饱和NaHCO3溶液(40ml)使反应猝灭，用 水调节总体积至100ml (终pH: 9.5);持续搅拌过夜。所得溶液进行超滤 后置旋转式蒸发器中浓缩。该溶液经冷冻干燥后得到白色固体310mg。 NMR氢谱测得总甲磺酸根DS为50%摩尔/摩尔，NMR碳谱测得伯位甲 磺酸根为31%摩尔/摩尔，C6位点选择性为62%。
实施例22: 6-(9-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在-10。C下氮气中向500mg (0.806mmol) HA TBA盐(MW 20,000)溶 于20 ml N-甲基-2-p比咯烷酮的溶液中搅拌加入829|iL (4.84mmol) D正A。 接着滴加MsCl (188pL; 2.42mmo1),所得混合液于-10。C搅拌1小时。向 反应混合液中加入饱和NaHCO3溶液(40ml)使反应猝灭，用水调节总体 积至100ml (终pH: 9.5);持续搅拌过夜。所得溶液进行超滤后置旋转式蒸发器中浓缩。该溶液经冷冻干燥后得到白色固体250mg。 NMR氢谱测 得总曱磺酸根DS为41。/。摩尔/摩尔，NMR碳镨测得伯位甲磺酸根为39% 摩尔/摩尔，C6位点选择性为95。/。。 HSQCNMR谱验证了该选择性。 实施例23: 6-(9-甲磺酰透明质酸(HA-Ms)的制备 在(TC下氮气中向500mg (0.806mmo1) HA TBA盐(MW 20,000)溶于 20 ml N-甲基-2-p比咯烷酮的溶液中搅拌加入829juL (4.84mmo1) DIEA。接 着滴加MsCl(188pL;2.42mmo1)，所得混合液于0。C搅拌1小时。向反应 混合液中加入饱和NaHCO3溶液(40ml)使反应猝灭，用水调节总体积至 100ml (终pH: 9.5);持续搅拌过夜。所得溶液进行超滤后置旋转式蒸发 器中浓缩。该溶液经冷冻干燥后得到白色固体275mg。 NMR氬谱测得总 甲磺酸根DS为44。/。摩尔/摩尔，NMR碳谱测得伯位甲磺酸根为40%摩尔 /摩尔，C6位点选择性为90%。
实施例24: 6-(9-氨甲喋呤基透明质酸的制备
将实施例10制备的HA-OMs:TBA盐(500mg; 0.73mmol)溶于DMSO (15 ml)的溶液用氨甲喋呤(833mg; 1.83mmol)溶于DMSO (10ml)并含固体 碳酸铯(596mg; L83mmol)的溶液进行处理。混合液于80。C氮气中搅拌 18h,由于生成固体而致溶液颜色变深。此后将其冷却至室温，倒入100ml 水(pH6.5)中，用15ml饱和NaCl溶液进行处理，搅拌1.5h。过滤除去固 体，溶液经超滤、浓缩并冷冻干燥后得到黄褐色固体131mg。经NMR 检测MTX的DS: 40%摩尔/摩尔；13C NMR显示有40% C6被修饰。经 HPLC检测为32°/0 w/w,相当于40%摩尔/摩尔。此外，NMR还发现由 于被MTX取代，除了某些C-6位点而外，化合物不含任何残留的仲位 甲磺酰基团并且HA的基本结构无改变。该结果表明任何可能在甲磺酰
化反应过程中引入仲位(C-4,C-2，,C-3，)的离去基团(甲磺酸根)已在置换 反应中的碱性条件下被水解，该水解反应可能是直接水解，也可通过生 成2',3，-酸酐后以这些位点保持构型不变的方式进行水解来完成。对同一 样品在保存3个月后再次在室温下进行NMR谱检测，其提供的峰值和 强度与新鲜制备样品得到的结果相同，由此表明取代度得以保持并且无 副产物生成。
实施例25: HA-C1: TBA盐的制备
在氮气下将50g透明质烷钠盐混悬于900 mL无水二曱基酰胺中，于 20。C进行机械搅拌。接着混悬液冷却至-10。C,在30min内加入97mL甲 磺酰氯。继续于-10。C放置30min后，把温度升至20。C。 lh后温度逐渐 升至(在lh内)60°C,继续搅拌18h。之后把反应混合液分批倒入冰与 义灰酸钠溶液(4 L,初始pH41)的混合物中并充分混合，按需加入1.5 M NaOH使pH值保持在9左右。所得褐色混悬液(终体积6 L)于pH 9.5 室温搅拌48h,而后形成澄清溶液。该溶液经过滤除去固体后进行超滤(10 KDa截留滤膜)。所得溶液在旋转式蒸发器中浓缩至终体积1升，再用载 有TBA的离子交换树脂IRA-120处理。经冷冻干燥后得到灰白色固体 HA-6-C1: TBA盐46.7g (13C NMR测得DS为64%摩尔/摩尔)。
实施例26: HA-布洛芬的制备
室温下于氮气中将实施例12制备的HA-Ms:TBA盐(400mg; 0.64mmol)和布洛芬(333mg; 1.61mmol)搅拌溶于DMSO (16ml)中。加入固 体碳酸铯(264mg; 0.81mmo1)，混悬液加热至70。C搅拌20h。把所得橙黄 色溶液倒入150ml水(pH为6.5)中，加入10ml饱和NaCl溶液。搅拌30min 后，溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体0.15g。 NMR氩语测
得DS: 27%摩尔/摩尔。
实施例27: HA-布洛芬的制备
室温下于氮气中将实施例25制备的HA-C1:TBA盐(lg; L6mmol)和 布洛芬(670mg; 3.2mmol)搅拌溶于DMSO (50ml)中。加入固体碳酸铯 (264mg; 0.81mmo1),混悬液加热至80。C搅拌40h。把所得深黄色溶液倒 入100ml水(pH为8)中，再进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到淡褐色固体 g。 NMR氬谱测得DS: 20%摩尔/摩尔。
实施例28: HA-音霉素G的制备
将实施例12制备的HA-Ms:TBA盐(400mg; 0.64mmo1)、 18-冠-6 (338 mg; 1.28mmol)和青霉素G钠盐(574mg; 1.61mmol)溶于DMSO (16ml)的 溶液加热至70。C搅拌20h。
把所得黄色溶液倒入150ml水(pH为6.5)中，加入10ml饱和NaCl 溶液。搅拌30min后，溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体 0.29g。 NMR氬谱测得DS: 26%摩尔/摩尔。
实施例29: HA-青霉素G的制备
室温下将实施例25制备的HA- C1:TBA盐(lg; 1.6mmo1)、 18-冠-6 (840 mg; 3.2mmol)和青霉素G钠盐(1.13g; 3.2mmo1)搅拌溶于DMSO (50ml)。溶液加热至80。C搅拌40h，之后倒入100ml水(pH为7.4)中，对 溶液进行超滤、浓缩并冷冻千燥得到浅黄色固体lg (产率64% )。 NMR !U普测4f DS: 6%摩尔/摩尔。
实施例30: HA-白蛋白的制备
室温下于氮气中将实施例25制备的HA- C1:TBA盐(lg; 1.6mmol)和 人血清白蛋白(300mg)搅拌溶于DMSO (50ml)。加入固体碳酸铯(264mg;
0.81mmol),混悬液加热至80。C搅拌40h。把所得褐色溶液倒入100ml 水(pH为9.5)中，对溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到浅褐色固体0.9g。 HPLC RP测得DS: 5%摩尔/摩尔。
实施例31: 6-0-氨曱喋呤基透明质酸的制备
在氮气下将HA:TBA盐(250mg; 0.403mmol; MW 20，000)搅拌下并轻 孩吏加热溶于DMSO (10 ml);室温加入三乙胺(452)nL; 3.22mmol)后滴加 MsCl (157|iL; 2.02mmo1),从而形成黄色溶液。室温搅拌lh后，再加入 0.50ml三乙胺，把反应瓶与真空相连，轻微加热至50°C (浴槽温度)， 直到放气停止。接着加入1.1 Og (2.43mmol)氨甲喋呤和792mg (2.43mmo1) 碳酸铯，混合液于8(TC搅拌过夜。把一半反应混合液倒入pH6.3的水中 (20ml )使反应猝灭。采用饱和NaHC03溶液调节pH到6.8,再加入10ml 饱和NaCl溶液。搅拌10min后，对溶液进行超滤、于旋转式蒸发器中浓 缩并冷冻干燥后得到黄色固体60mg。经HPLC检测MTX DS为11.6% w/w，并经NMR检测验证(12。/o摩尔/摩尔)，结果也显示聚合物中仅留有 少量甲磺酸根。
其余反应混合液于80。C继续反应24h (总共40h)后按上述操作进 行处理，得到黄色固体103mg。经HPLC检测MTX的DS为14.4% w/w, 经NMR检测验证(15%摩尔/摩尔)，结果显示聚合物无甲磺酸根残留。 MW是269610， PI是10.5。将冷冻干燥的产物置于10ml碳酸盐緩冲液(pH 10)中水解8h以切断交联酯键。经中和及渗析后，冷冻干燥得到黄色固 体96mg。经HPLC检测产物中的MTXDS为12.6%w/w,同时经NMR 检测验证(13%摩尔/摩尔)；MW是27，120，PI是1.9。
实施例32: 6-0-氨曱喋呤基透明质酸的制备
于-10。C N2流中向HATBA(50g，Mw70，000)溶于1000ml无水DMF 的溶液中在lh时间内搅拌滴加甲磺酰氯(10当量)。混合液室温放置1小 时，再加热至60。C持续16小时。该处理获得HA-CL 46.9 g,其氯含量 为4.2%w/w(13C-NMR)。
HA-C1 TBA盐(20 g)溶于DMSO (1.25 L)的溶液加入MTX (29.3g) 和碳酸铯(21 g)于80。C处理40h,得到黄色固体5.6 g。
"C-NMR语证实iV-乙酰基-D-葡糖胺第6位点的化学键64 ppm处 峰值被认定是￡H20-MTX得出的，与亲本氯衍生物相比，其强度相当于 44ppm处峰值(Ol2Cl)所P争低的值。MTX含量为18.8%w/w(HPLC);游 离MTX为0.1% w/w,水含量8.2% w/w; MW: ll，OOO; PI: 1.4。此外， NMR发现存在残留氯，其含量为1.76%w/w。
实施例33: 6-(9-甲磺酰透明质酸TBA盐(HA-Ms:TBA)的制备
于-10。C N2流中向5.0g (8.1 mmol) HA:TBA (MW 5，000)溶于100 mL 无水DMF的溶液中搅拌加入3.1 mLDIEA(5.62 mL， 33.9 mmol)。接着滴 加MsCl (1.25 mL; 16.1 mmol),所得混合液于-10。C搅拌1小时。向反 应混合液中加入饱和NaHC03溶液(200ml) 4吏反应猝灭，用水调节总体 积至1L;采用稀释HCl溶液调节pH到10.5,持续搅拌过夜。所得溶液 进行超滤后置旋转式蒸发器中浓缩。取小部分冷冻干燥(100mg)供NMR 检测经NMR检测其伯位甲磺酸根为30。/。摩尔/摩尔，C6选择性为100%。 (3.2 g;Mw: 6,925; P.I. 1.87)
实施例34: 6-0-曱磺酰透明质酸TBA盐(HA-Ms:TBA)的制备
于-10。C N2流中向10.0g (16.1mmo1) HA TBA盐(MW 20，000)溶于 250 ml DMF的溶液中搅拌加入7.58ml (44.3mmol)DIEA。接着滴加MsCl (1.56mL; 20.1mmol)，所得混合液于-10。C搅拌1小时。向反应混合液中 加入饱和NaHCO3溶液(400ml)使反应猝灭，用水调节总体积至2L;采 用稀释HC1溶液调节pH到10.5,持续搅拌过夜。所得溶液经超滤后置 旋转式蒸发器中浓缩。取小部分冷冻干燥(100mg)供NMR检测经NMR 检测其伯位甲磺酸根为24%摩尔/摩尔，C6选择性为100%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 白色固体9.92g (HA-Ms:TBA盐)。
实施例35: HA-C1:钠盐的制备
在氮气下将5g透明质酸钠盐(MW 200，000)混悬于90 mL无水二曱基 甲酰胺中，于20。C进行机械搅拌。接着混悬液冷却至-10。C,在30min 内加入9.7 mL曱磺酰氯。继续于-10。C放置30min后，温度升至20。C。 lh后温度逐渐升至(在lh内)60°C，继续搅拌18h。之后把反应混合液 分批倒入冰与碳酸钠溶液(400 mL，初始pH=ll)的混合物中并充分混合， 按需加入1.5 MNaOH使pH值保持在9左右。所得褐色混悬液(终体积 500 mL )于pH 9.5室温搅拌48h，而后形成澄清溶液。该溶液经过滤除 去固体后进行超滤(IO KDa截留滤膜)。所得溶液经浓缩并冷冻干燥后得 到灰白色固体的HA-6-C1:钠盐4.05g (13C NMR测得DS为17%摩尔/摩 尔)。MW是79,560， RI.是3.5。
实施例36: HA-C1:钠盐的制备
在氮气下将5g透明质酸钠盐(MW 500，000)混悬于90 mL干燥二甲基 酰胺中，于20。C进行机械搅拌。接着混悬液冷却至-10。C，在30min内加 入9.7mL曱磺酰氯。继续于-10。C放置30min后，温度升至20。C。 lh后 温度逐渐升至(在lh内)70°C,继续搅拌21h。之后把反应混合液分批
倒入冰与碳酸钠溶液(400mL，初始pH-ll)的混合物中并充分混合，按需 加入1.5 M NaOH使pH值保持在9左右。所得褐色混悬液(终体积500 mL)于pH9.5室温搅拌48h，而后形成澄清溶液。该溶液经过滤除去固 体后进行超滤(IO KDa截留滤膜)。所得溶液经浓缩并冷冻干燥后得到灰 白色固体的HA-6-Cl:钠盐3.56g("CNMR测得DS为10%摩尔/摩尔)。 MW是53,830， P.I.是4.02。
实施例37: 6-(9-曱磺酰透明质酸TBA盐OIA-Ms:TBA)的制备 于國10。C氮气中向10.0g(16.1mmol)HATBA盐(MW 180，000)溶于 500 ml DMF的溶液中搅拌加入9.16ml (53.4mmol) DIEA。接着滴加MsCl (1.87mL; 24.2mmol)，所得混合液于-10。C搅拌1小时。向反应混合液中 加入饱和NaHC03溶液(40011110使反应猝灭，用水调节总体积至2L;采 用稀释HCl溶液调节pH到10.5,持续搅拌过夜。所得溶液经超滤后置 旋转式蒸发器中浓缩。取小部分冷冻干燥(150mg)供NMR检测经NMR 检测其伯位曱磺酸根为30%摩尔/摩尔，C6选择性为100%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 白色固体9.80g (HA-Ms:TBA盐)。
实施例38: 6-0-甲磺酰透明质酸TBA盐(HA-Ms:TBA)的制备 于-10。C氮气中向20.0g (32.2mmo1) HA TBA盐(MW 180,000)溶于 1000 ml DMF的溶液中搅拌加入36.7ml (214mmol) D正A。接着滴加MsCl (7.48rnL; 97mmol)，所得混合液于-10。C搅拌1小时。向反应混合液中加 入饱和NaHC03溶液(800mL)使反应猝灭，用水调节总体积至4L;采用 稀释HC1溶液调节pH到10.5，持续搅拌过夜。所得溶液经超滤后置旋 转式蒸发器中浓缩。取小部分冷冻干燥(120mg)供NMR检测经NMR
检测伯位曱磺酸根为55%摩尔/摩尔，C6选择性为100%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 白色固体19.95g (HA-Ms:TBA盐)。
实施例39: 6-(9-甲磺酰透明质酸TBA盐(HA-Ms:TBA)的制备 于-10。C氮气中向2.00g (3.22mmo1) HA TBA盐(MW 500,000)溶于 150 ml DMF的溶液中搅拌加入3.67ml (21.4mmol) DIEA。接着滴加MsCl (750nL; 9.7mmol),所得混合液于-10。C搅拌1小时。向反应混合液中加 入饱和NaHCO3溶液(80mL)使反应猝灭，用水调节总体积至1L;采用 稀释HCl溶液调节pH到10.5,持续搅拌过夜。所得溶液经超滤后置旋 转式蒸发器中浓缩。取小部分冷冻干燥(90mg)供NMR检测经NMR检 测伯位甲磺酸根为70%摩尔/摩尔，C6选择性为100%。
其余溶液经载有TBA的离子交换树脂IRA-120处理后冷冻干燥得到 白色固体1.94g (HA-Ms:TBA盐)。
实施例40: 6-(9-氨甲喋呤基透明质酸的制备
将实施例34制备的HA-OMs:TBA盐(8.0g; 12.9mmol)溶于DMSO (250 ml)的溶液用氨甲喋呤(14.66g; 32.3mmol)溶于DMSO (150ml)并含固 体碳酸铯(10.5g; 32.2mmol)的溶液进行处理。混合液于80。C氮气中搅拌 20h。此后将其冷却至室温，倒入^ 友酸盐緩冲液中，调节pH到9.7且体 积至2L。搅拌18h后，溶液经中和、过滤、超滤、浓缩并冷冻干燥后得 到黄色固体4.70g。经NMR检测MTX的DS: 7.5%摩尔/摩尔；MW是 27,960, RI.是1.92。
实施例41: 6-(9-氨甲喋呤基透明质酸的制备
将实施例37制备的HA-OMs:TBA盐(7.0g; 11.3mmol)溶于DMSO
(670 ml)的溶液用氨曱喋呤(12.79g; 28.1mmol)溶于DMSO (120ml)并含固 体碳酸铯(义15g; 28.1mmol)的溶液进行处理。混合液于75。C氮气中搅拌 18h。此后将其冷却至室温，倒入碳酸盐緩冲液中，调节pH到8.8且体 积至2.5L。搅拌24h后，溶液经中和、过滤、超滤、浓缩并冷冻干燥后 得到黄色固体4.30g。经NMR检测MTX的DS: 13%摩尔/摩尔；MW 是208,400， P.I.是2.18。
实施例42: 6-(9-氨甲喋呤基透明质酸的制备
将实施例38制备的HA-OMs:TBA盐(13.2g; 21.3mmol)溶于DMSO (1270 ml)的溶液用氨甲喋呤(24.13g; 53.1mmol)溶于DMSO (120ml)并含 固体碳酸铯(17.26g; 53.1mmol)的溶液进行处理。混合液于75。C氮气中搅 拌18h。此后将其冷却至室温，倒入> 友酸盐緩冲液中，调节pH到10.0 且体积至5L。搅拌18h后，溶液经中和、过滤、超滤、浓缩并冷冻干燥 后得到黄色固体6.52g。经NMR检测MTX的DS: 20%摩尔/摩尔；MW 是217,300， P.I.是2.02。
实施例43: 6-(9-氨曱喋呤基透明质酸的制备
将实施例39制备的HA-OMs:TBA盐(500mg; 0.74mmol)溶于DMSO (80 ml)的溶液用氨曱喋呤(1.01g; 2.23mmol)溶于DMSO (10ml)并含固体 碳酸铯(1.01g; 2.23mmol)的溶液进行处理。混合液于80。C氮气中搅拌 22h。此后将其冷却至室温，倒入碳酸盐緩冲液中，调节pH到10.0且体 积至400mL。搅拌18h后，溶液经中和、过滤、超滤、浓缩并冷冻干燥 后得到黄色固体260mg。经NMR检测MTX的DS: 11%摩尔/摩尔；MW 是460,100， P丄是2.21。
实施例44: 6-(9-氨甲喋呤基透明质酸的制备
将实施例33制备的HA-OMs钠盐(1.0g; 2.0 mmol)溶于DMSO (40 ml) 的溶液用氨甲喋呤(1.83 g; 4mmol)溶于DMSO (40ml)并含固体碳酸铯 (1.30g; 2mmol)的溶液进行处理。混合液于80。C氮气中搅拌20h。采用 Na2C03饱和溶液中和该溶液并调终体积至500 mL,经过滤、超滤、浓 缩并冷冻干燥后得到黄色固体500mg。经HPLC检测MTX的DS: 7.8% w/w; MW是16,000, RI.是2.4。
实施例45: HA-布洛芬的制备
室温下于氮气中将实施例20制备的HA-Ms:TBA盐(500mg; 0.80mmol)和布洛芬(416mg; 2.01mmol)搅拌溶于DMSO (20ml)中。加入固 体碳酸铯(330mg; l.Olmmol),混悬液加热至70。C搅拌20h。把所得溶液 倒入200ml水(pH为6.5)中，加入10ml饱和NaCl溶液。搅拌30min后， 溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体0.22g。 NMR氢谱测得DS: 30%摩尔/摩尔。
实施例46: HA-萘普生的制备
室温下于氮气中将实施例20制备的HA-Ms:TBA盐(500mg; 0.80mmol)和萘普生(463mg; 2.01mmol)搅拌溶于DMSO (20ml)中。加入固 体碳酸铯(330mg; l.Olmmol)，混悬液加热至70。C搅拌20h。把所得溶液 倒入200ml水(pH为6.6)中，加入10ml饱和NaCl溶液。搅拌30min后， 溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体0.27g。 NMR氢谱测得DS: 28%摩尔/摩尔。
实施例47: HA-赖诺普利的制备
室温下于氮气中将实施例20制备的HA-Ms:TBA盐(500mg; 0.80mmol)和赖诺普利(887mg; 2.01mmol)搅拌溶于DMSO (25ml)中。加入
固体碳酸铯(655mg; 2.01mmol),混悬液加热至70。C搅拌20h。把所得溶 液倒入200ml水(pH为6.5)中，加入10ml饱和NaCl溶液。搅拌30min 后，混合液经过滤、超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体0.20g。 NMR 氬谱测得DS: 26%摩尔/摩尔。
实施例48: HA-萘咬酸盐的制备
室温下于氮气中将实施例20制备的HA-Ms:TBA盐(500mg; 0.80mmol)和赖诺普利(467mg; 2.01mmol)搅拌溶于DMSO (20ml)中。加入 固体碳酸铯(330mg; l.Olmmol)，混悬液加热至70。C搅拌20h。把所得溶 液倒入200ml水(pH为6.6)中，加入10ml饱和NaCl溶液。搅拌30min 后，溶液经超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体0.26g。 NMR氩谱测得 DS: 30%摩尔/摩尔。
实施例49: HA-青霉素G的制备
将实施例20制备的HA-Ms:TBA盐(400mg; 0.64mmo1)、 18-冠-6 (338 mg; 1.28mmol)和青霉素G钠盐(574mg; 1.61mmol)溶于DMSO (16ml)的 、溶液加热至70。C搅拌20h。
把所得黄色溶液倒入150ml水(pH为6.5)中，加入10ml饱和NaCl 溶液。搅拌30min后，溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体 0.27g。 NMR氩谱测得DS: 31%摩尔/摩尔。 - 实施例50: HA-头孢唑林的制备
将实施例20制备的HA-Ms:TBA盐(400mg; 0.64mmo1)、 18-冠-6 (338 mg; 1.28mmol)和头孢唑林钠盐(767mg; 1.61mmol)溶于DMSO (18ml)的 溶液加热至70。C搅拌20h。
把所得黄色溶液倒入180ml水(pH为6.7)中，加入10ml饱和NaCl
溶液。搅拌30min后，溶液进行超滤、浓缩并冷冻干燥得到白色固体 0.25g。 NMR氩谱测得DS: 29%摩尔/摩尔。
权利要求
1.由透明质酸和治疗活性剂组成的药物输送系统，其中该活性剂与透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺残基的C-6位共价结合，其中所述活性剂除化学式(I)活性剂之外:其中:R2和R4分别各自代表:-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O；X和Y代表:-C(R5)＝、-CH(R5)-、-NH-、-N＝)，其中R5代表:-H、C1-C5烷基；Z代表:-CH(R10)-、-N(R10)-、-O-，其中R10代表:-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、有1-3个杂原子的5-6元杂环，其中杂原子选自氮、硫和氧；Ar代表1，4-苯基、与一个或多个5-6元芳香环稠合的1，4-苯基、与一个或多个5-6元杂环稠合的1，4-苯基，其中所述Ar可能被R2取代；环A和b可分别各自为芳香环或非芳香环。
2.如权利要求1的DDS,其中透明质酸和活性剂之间的化学键是酯 键、氨基键、醚键、硫醚键、酰胺键，优选为酯键。
3.如权利要求1-2的DDS,其中治疗活性剂选自属于多种不同治疗 种类的药物镇痛药、抗高血压药、麻醉药、利尿药、支气管扩张药、 钙通道阻滞药、胆石咸能药、CNS药、雌激素、免疫调节剂、免疫抑制剂、 抗脂肪药、抗焦虑药、抗溃疡药、抗关节炎药、抗心绞痛药、抗生素、 抗炎药、抗病毒药、溶血栓药、血管扩张药、解热药、抗抑郁药、安定 药、抗肿瘤药、粘液溶解药、麻醉拮抗剂、激素、抗惊厥药、抗组胺药、 抗真菌药、抗4艮屑病药。(优选抗炎药、抗生素、抗肿瘤药)
4. 如权利要求1-3的DDS，其中活性剂的含量占DDS总重的0.1-60% w/w (优选1-50%)。
5. 如权利要求1-4的DDS,其中透明质酸的仲羟基经衍生化形成基 团选自-OR 、 -OCOR 、 -S02H 、 -OP03H2 、 -0-CO-(CH2)n-COOH 、 -0-(CH2)n-OCOR,其中n是l-4， R是C广C^烷基、-NH2、 -NHCOCH3。
6. 如权利要求1-5的DDS,其可为酸性形式或与碱金属或碱土金属 或过渡金属成盐。
7. 将如权利要求1-6的药物输送系统用于生产药剂。
8. 包含如权利要求1-7的药物输送系统并与药学可接受的赋形剂和/ 或稀释剂混合的药物组合物。
9. 为可注射形式的如权利要求8的药物组合物。
10. 制备如权利要求1-6的药物输送系统的方法，该方法包括以下 反应步骤(a) 在游离形式或盐形式透明质酸的iV-乙酰基-D-葡糖胺单元中的 C-6位引入离去基团以获得HA-6-活化物；(b) 通过以治疗活性剂上所含的亲核基团置换离去基团(HA的C6 位)使得HA-6-活化物的C6位与治疗活性剂之间形成化学键，从而得到 HA-6-治疗活性剂；(c) 从步骤(b)中所得的HA-6-治疗活性剂上置换任意未取代离 去基团；(d) 回收HA-6-治疗活性剂。
11. 如权利要求10的方法，其中将步骤(a)所得HA-6-活化物从 反应混合物中分离出，再根据步骤(b)与治疗活性剂反应。
12. 如权利要求10的方法，其中将步骤(a)所得含HA-6-活化物 的反应混合物直接进行步骤(b)反应。
13. 如权利要求10-12的方法，其中引入HA的iV-乙酰基-D-葡糖胺 单元C-6位的离去基团选自磺酸根基团、膦酸根基团(三苯基膦酸根)、 氰化物(CN-)、亚硝酸根(N02-)、卣素(优选氯)、硫酸根基团、卣代硫 酸根基团、硝酸根、囟代亚硫酸根(氯代亚硫酸根)。
14.制备如权利要求1-6的药物输送系统的方法，该方法包括以下 反应步骤(a) 向盐形式HA的W-乙酰基-D-葡糖胺单元C-6位引入磺酸根基 团，以获得HA-6-磺酰化物；(b) 通过以治疗活性剂上的亲核基团置换HA C6位的磺酰化基团， 使得HA-6-磺酰化物的C6位与治疗活性剂之间形成化学键，从而得到 HA-6-治疗活性剂；(c) 回收HA-6-治疗活性剂。
15. 如权利要求14的方法，其中透明质酸和治疗活性剂之间的化 学键是酯键、氨基键、醚键、硫醚键、酰胺键。
16. 如权利要求15的方法，其中透明质酸和治疗活性剂之间的化 学键是酯键。
17. 如权利要求14-16的方法，其中用于引入磺酸根基团的试剂是 含有机碱或无机碱(优选有机碱)的烷基-或芳基-磺酰卣(优选磺酰氯)。
18. 如权利要求17的方法，其中试剂为曱磺酰氯或甲苯-对-磺酰氯， 有机碱是二异丙基乙胺或三乙胺。
19. 包含透明质酸和化学式(I)化合物的药物输送系统，其中，化 学式(I)化合物的羧基通过酯键的方式与透明质酸的TV-乙酰基-D-葡糖 胺残基的C-6位共价连接，<formula>formula see original document page 6</formula>formula①获得所述DDS的方法包括以下反应步骤(a) 在游离形式或盐形式透明质酸的,乙酰基-D-葡糖胺单元C-6 位引入离去基团以得到HA-6-活化物，该离去基团选自磺酸才艮基团、膦 酸根基团(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亚硝酸根(N02-)、硫酸根基 团、卣代硫酸根基团(优选氯代硫酸根)、硝酸根、囟代亚硫酸根(氯代 亚硫酸根)；(b) 通过以化合物(I)上所含的羧基置换离去基团(HA的C6位) 使得HA-6-活化物的C6位与化学式(I)的化合物之间形成酯键，从而 得到HA-6-化学式(I)化合物；(c) 回收HA-6-化学式(I)化合物。
20. 如权利要求19的DDS，其C6-DSw为1-50%之间，优选5-40%。
21.如权利要求19-20的DDS，其中化学式(I)的化合物是氨甲喋呤。
22.如权利要求19-21的DDS，其中步骤(a)所得HA-6-活化从反应混合物中分离，再按步骤(b)与治疗活性剂反应。
23. 如权利要求19-22的DDS，其中以步骤(a)所得含HA-6-活化 物的反应混合物直接进行步骤(b)反应。
24. 如权利要求19-23的DDS,其中用于引入磺酸根基团的试剂是 含有机碱或无机碱(优选有机碱)的烷基-或芳基-磺酰卣(优选磺酰氯)。
25. 如权利要求24的DDS,其中试剂为曱磺酰氯或甲苯-对-磺酰氯，有才;u威是二异丙基乙胺或三乙胺。
26. 将如权利要求19-25的DDS用于生产药剂。
27. 包含如权利要求19-25的药物输送系统并与药学可接受的赋形 剂和/或稀释剂混合的药物组合物。
28. 为可注射形式的如权利要求27的药物组合物。
29. HA-6-活化物的获得是通过在游离形式或盐形式透明质酸的W-乙酰基-D-葡糖胺单元C-6位引入离去基团，该离去基团选自磺酸根基团、 膦酸根基团(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亚硝酸根(N02-)、硫酸根 基团、闺代疏酸根基团(优选氯代硫酸根)、硝酸根、卣代亚硫酸根(氯 代亚硫酸根)。
30. 如权利要求29的HA-6-活化物，其中离去基团是磺酸根基团。
31. 如权利要求29-30的HA-6-活化物，其C6-DSm。!为10-91%之间。
32. 如权利要求29-30的HA-6-活化物，其C6-DS^为20-90%之间。
33. 如权利要求29-30的HA-6-活化物，其C6-DSmd为40-80%之间。
全文摘要
本发明涉及包含透明质酸和治疗活性剂的药物输送系统。
文档编号A61P35/00GK101374531SQ200780003387
公开日2009年2月25日 申请日期2007年1月25日 优先权日2006年1月25日
发明者埃尔米尼奥·穆拉诺, 斯特凡诺·诺尔贝多, 苏珊娜·博西, 里亚·艾哈迈德·卡恩, 马西莫·贝尔加明 申请人:欧兰德制药有限公司