一种低分子透明质酸盐、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种低分子透明质酸盐、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种低分子透明质酸盐、其制备方法及用途。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid, HA)是一种酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为IO5 — IO7Da (道尔顿)。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性(郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24 (3):148-150)。目前一般将分子量在IO4Da — IO6Da的透明质酸称为低分子透明质酸(LMW-HA)。分子量为2万一 6万的LMW-HA可刺激体外培养的骨细胞的增生，增加培养基中骨细胞集落的数目和单个集落的面积(US 5646129)。使用含有妥布霉素和分子量为50万的HA的滴眼液治疗细菌性角膜溃疡，与只含妥布霉素的滴眼液相比，可显著缩短愈合时间(Gandolfi SA, Massari A,Orsoni JG.Low-molecular-weight sodium hyaluronatein the treatment o f bacterial corneal ulcers s[J].Graefes Arch Clin ExpOphthalmol, 1992, 230(1): 20-23)。韩国专利(KR20080087941)提供了一种含分子量小于10万的HA的组合物，该组合物易于被人体吸收，口服可有效改善皮肤皱纹、提高皮肤弹性。日本专利(JP2000-103723)提供了一种含分子量20万一 40万HA的组合物，该组合物可促进毛发生长。但是，酶解法制备的低分子透明质酸或其盐在结构上比化学法制备的要完整，化学法制备的低分子透明质酸或其盐的结构会发生开环、脱乙酰基等。LMW-HA因其相对分子质量较小，外用时可被皮肤更好的吸收，促进皮肤营养的供给和废物排泄，从而防止皮肤老化，达到深层保湿和美容养颜的效果，而且还可促进表皮细胞的增殖和分化，清除氧自由基，修复日光或紫外线伤害的皮肤。口服LMW-HA易于吸收，不仅可以活化皮肤细胞，保持表皮湿润，同时具有良好的增强免疫功能和抗衰老功能。因此化妆品用及保健食品用HA多为LMW-HA。另外，LMW-HA还具有促血管生成、细胞免疫活化和促进骨生成的作用，对治疗细菌性角膜溃疡具也有良好的疗效，在医药领域应用广泛。LMW-HA是由高分子量HA降解得到的，降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类。物理降解法中的超声降解法虽然不添加化学试剂和酶，但很难将高分子量HA降解至分子量200kDa以下(覃彩凤，王淼，陈晓峰.透明质酸的降解方法及工艺条件研究[J].2007，4:32-36)。机械研磨法也是一种有效降低HA相对分子量的方法，有专利报道在室温下研磨时间为0.5h - 12h，振荡频率为IOHz - 30Hz，但不适用于大规模生产(CN101942037A)。化学降解法会造成结构破坏，这时不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。有报道酶解法生产低分子HA的制备过程，先将HA从发酵液中分离纯化出来，然后再加入透明质酸酶进行酶解，再经过膜过滤、乙醇沉淀、脱水干燥得到低分子HA(CN101020724A)，上述制备工艺所用的透明质酸酶为透明质酸酶成品，价格很高，很难实现工业化生产。目前，有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低，发酵液最高酶活是1.3 X 102IU/mL (W02010130810A1)，其余文献报道的酶活均低于102IU/mL，因此应用酶切法大规模生产低分子量HA目前很难实现。

发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种芽孢杆菌和一种透明质酸酶。该透明质酸酶活性高，可达105IU/mL(发酵液)，纯化后可以达到8 X IO6 — 1.5 X IO7IU/mg，远高于目前文献中报道的最高酶活。该透明质酸酶的分子量为123KDa，最适作用温度及PH分别为42°C、6.5，热稳定性和pH稳定性高。该酶可催化裂解透明质酸和硫酸软骨素，但是不能降解海藻酸钠，肝素钠，壳聚糖，几丁质和羟甲基纤维素钠。利用该透明质酸酶降解高分子透明质酸，反应速度快、反应条件温和、环境污染小，可大规模工业化生产低分子透明质酸，还可生产低分子硫酸软骨素(本发明中是指分子量为1，000 - 10, 000的硫酸软骨素，也称为低分子量硫酸软骨素)。本发明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，酶活高、条件温和、操作简单、无环境污染。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC N0.5744，保藏日期为2012年2月8日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶活性低、来源有限、成本高的缺点，发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50，该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号为CGMCCN0.5744，保藏时间为2012年2月8日。本发明的另一方面涉及一种制备透明质酸酶的方法，包括使用本发明的芽孢杆菌的步骤；具体地，包括下述步骤:将本发明的芽孢杆菌进行斜面培养、种子培养、发酵培养、离心、硫酸铵分级沉淀、超滤，制得透明质酸酶。根据本发明任一项所述的制备透明质酸酶的方法，包括如下步骤:(I)将本发明的芽孢杆菌进行斜面培养，得斜面菌种；(2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25 - 400CUOO 一 200rpm的条件下培养10 — 24h,得种子液；(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25 - 400CUOO 一 300rpm的条件下培养12 - 24h，得透明质酸酶发酵液；(4)离心分离发酵液，取上清液；(5)将上清液用硫酸铵分级沉淀，过滤(例如采用0.65 μ m的微孔滤膜进行过滤)，得到粗制的透明质酸酶；(6)将步骤(5)沉淀出来的粗制透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的透明质酸酶。可选地，步骤(6)也可以采用如下的步骤(6 -1)至(6 - 3):(6 -1):将步骤(5)中的粗制透明质酸酶溶于pH4.5-8.0的缓冲溶液中，得粗酶液；将粗酶液装入截留分子量为3.0X IO3 - 1.4X IO4Da的透析袋，放入pH4.5 — 8.0的缓冲溶液中，4°C下透析过夜；(6 - 2):将透析后的粗酶液进行离子交换色谱分离，色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质，用O — 0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，并收集洗脱峰；(6 - 3):将步骤(6 - 2)得到的透明质酸酶样品进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为透明质酸酶。步骤6 — I至6 — 3是对透明质酸酶的进一步纯化。上述分离纯化透明质酸酶的方法中，SDS-PAGE电泳检测步骤(6_2)得到的透明质酸酶纯度达到97%以上。上述步骤(I)中，每IOOmL斜面培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g，K2HP04.3Η20 0.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5-1.5g,琼脂粉2.0g, pH调至6.0 — 8.0，斜面培养的温度为25 — 40°C。上述步骤(2)中，每IOOmL种子培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g，K2HPO4.3Η20 0.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5 — 1.5g,pH 调至 6.0 - 8.0。上述步骤(3)中，每IOOmL发酵培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g，K2HPO4.3Η20 0.05 — 0.15g，MgS04.7Η200.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5-1.5g,吐温 800.05mL, pH 调至 6.0 — 8.0。可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基、种子培养基和发酵培养基pH。斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养基的接种量一般在3 — 15%即可。上述步骤(4)中，发酵液离心的转速为10000 - 15000rpm，离心时间为10 —20mino上述步骤(5)中，硫酸铵分级沉淀的步骤是:将上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为20% — 25%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为35% -40%为止，得到的沉淀即为透明质酸酶。本发明中所述的质量体积浓度的意思是:每mL上清液中含有硫酸铵的质量(g)。上述步骤(6)中，磷酸盐缓冲液的pH优选为6.0，浓度优选为50mmol/L，在实际应用中可酌情变动。超滤 所用的为超滤膜。超滤膜的截留分子量为3XlO4Da15本发明的再一方面涉及一种透明质酸酶，其由上面任一项所述的制备透明质酸酶的方法制得。本发明芽孢杆菌生产的透明质酸酶在发酵液中的酶活可达到IX IO5 — 3X IO5IU/mL,大大高于文献报道中的最高酶活(1.3 X 102IU/mL),且该酶热稳定性和pH稳定性高，用其降解高分子透明质酸，用来制备低分子透明质酸，成本显著降低，可用于大规模生产，解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，在生化研究领域及低分子透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。本发明还涉及一种分离的多肽(或蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；具体地，所述多肽(或蛋白)为透明质酸酶。一种分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:2所示所示的氨基酸序列；具体地，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 3所示。一种重组载体，其含有本发明的多核苷酸。一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组载体。本发明的再一方面涉及一种制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法，包括使用本发明中任一项所述的透明质酸酶或者含有本发明中任一项所述的透明质酸酶的发酵液对分子量大于IOOOkDa的透明质酸或其盐进行降解的步骤。根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法，其包含如下步骤:I)配制透明质酸或其盐溶液:向纯化水中加入分子量大于IOOOkDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为0.1 - 2%的溶液；2)酶解:调节步骤I)中溶液的温度为20 - 48°C、pH为4 一 9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液；3)灭活:将酶解液在50 — 90°C下保持10 — 60min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活； 优选地，还包括如下步骤:4)过滤:向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，得滤液，每IOOmL酶解液中加入0.1 一 IOg的易溶性无机盐；5)沉淀:将步骤4)的滤液与滤液体积I 一 10倍的醇或酮混合均匀，析出低分子透明质酸盐沉淀；6)脱水干燥:将步骤5)中的低分子透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得低分子透明质酸盐。根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法，其中，步骤I)中，每Ikg透明质酸或其盐中加IO6 — IO7IU的芽孢杆菌透明质酸酶。根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法，其中，步骤2)中，酶解温度为35 - 45°C，酶解pH为5.5 — 7.5，将透明质酸酶解至分子量为 IOkDa -1OOOkDa ;优选为 IOkDa — 770kDa 或 IOkDa — 700kDa 或 IOkDa — 600kDa 或IOkDa - 500kDa ;更优选为 IOkDa — 400kDa ;进一步优选为 IOkDa — 300kDa、IOkDa —200kDa、IOkDa — 150kDa、IOkDa — lOOkDa、IOkDa — 50kDa 或 IOkDa — 30kDa。根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法，其满足如下的A — F中的任一项或多项:A.步骤I)中，透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐；B.步骤2)中，采用酸或碱调节pH至4 一 9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；C.步骤3)中，将酶解液在55 - 65°C下保持20 — 30min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；D.步骤4)中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐；优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐或硝酸盐；E.步骤5)中，所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇；F.步骤6)中，脱水所用的有机溶剂为酮或醇。本发明的再一方面涉及一种低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其由本发明中任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法制得。本发明的再一方面涉及一种低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量> 90%或> 95% (w/w);具体地，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法或咔唑法测得。更具体地，HPLC的条件为:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定；流动相为0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速为0.6ml/min ;柱温为35°C ;检测波长为232nm ;进样量为20 μ L。咔唑法测定寡聚透明质酸或低分子透明质酸的含量可参考凌沛学等编的《透明质酸》(中国轻工业出版社，2002)的第41页内容。例如HPLC法可以采用下面的步骤:a.标准对照品溶液:称取一定量的标准对照品(Hyaluronic acid disaccharideΔ DiHA sodium salt, Η9649, Sigma)用憐酸盐缓冲液(ρΗ6.0, 5mmol/L)溶解配制成 lmg/mL的溶液，得到标准对照品溶液；b.样品预处理:称取一定量的待测样品，用磷酸盐缓冲液(pH6.0,5mmol/L)溶解配制成lmg/mL的溶液。取I·mL样品溶液加入1000IU的透明质酸酶，42°C水浴2h ;酶解结束后，将酶解液煮沸2min使酶失活，得到样品酶解液。将样品酶解液转移至20mL容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，混匀，过滤即得供试液。c.标准对照品溶液处理:取ImL标准对照品溶液采用流动相稀释20倍，过滤待用。d.色谱条件:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定；流动相为0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速为0.6ml/min ;柱温为35°C ;检测波长为232nm ;进样量为20 μ L ;e.结果计算:采用高效液相色谱分别对标准对照品和待测样品进行色谱分离，按外标法以透明质酸双糖峰面积计算；具体地，按以下公式计算低分子透明质酸或其盐的含量(以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量表示):
低分子逢嚷质酸或其盤的含量CC%)=X.%^°......^Xi00%
Ar X Wx x(100 —h)Ax:待测样品的透明质酸双糖峰面积；Ae:标准对照品的透明质酸双糖峰面积；Wx:待测样品称样量，mg ；Ce:标准对照品溶液浓度，mg/mL ；h(% )为待测样品干燥失重。
具体方法也可以参照公开号为CN102323344A的中国专利申请，其全部内容在此通过引用并入本发明。根据本发明的任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其分子量为IOkDa -1OOOkDa ;优选为 IOkDa — 770kDa 或 IOkDa — 700kDa 或 IOkDa — 600kDa 或 IOkDa —500kDa ;更优选为 IOkDa — 400kDa ;进一步优选为 IOkDa — 300kDa、IOkDa — 200kDa、IOkDa - 150kDa、IOkDa — IOOkDaUOkDa 一 50kDa 或 IOkDa — 30kDa。具体地，所述低分子透明质酸或低分子透明质酸盐为酶解法(酶切法)制得；更具体地，由本发明的透明质酸酶制得。根据本发明的任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其通过HPLC法和咔唑法测得的含量的差值小于1%。不拘于理论的限制，在相同酶量的情况下，只要控制不同的酶解时间即可得到不同分子量的透明质酸盐，即只要控制合适的酶解时间即可得到低分子透明质酸盐或寡聚透明质酸盐。但实际上，会出现时间长了酶的活性可能降低、透明质酸盐的溶液会染菌等问题，所以优选通过控制加不同的酶量来控制得到不同分子量的透明质酸盐，如制备低分子透明质酸盐时可加酶量少一些，制备寡聚透明质酸盐时则需加酶量多一些。可以间隔取样检测产物的分子量。低分子透明质酸盐的分子量测定采用GPC-MALLS法或Laure nt法(GPC-MALLS法更方便一些);本领域技术人员可以根据本领域知识自行选择合适的检测时间间隔。本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含本发明中任一项所述的透明质酸酶、本发明的多核苷酸、本发明的重组载体、本发明的重组宿主细胞、或者本发明任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐；可选地，其还包含药学上或食品学上可接受的载体或辅料。具体地，所述组合物为化妆品；更具体地，所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。本发明的再一方面涉及本发明的芽孢杆菌或本发明的多核苷酸或本发明的重组载体或本发明的重组宿主细胞在制备透明质酸酶中的用途。可以利用本领域人员知悉的技术手段，将本发明的编码透明质酸酶的多核苷酸克隆至表达载体，转导至合适的宿主细胞，表达本发明的透明质酸酶。本发明还涉及本发明中任一项所述的透明质酸酶在制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐或者低分子硫酸软骨素中的用途。本发明还涉及本发明任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐在制备促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或防晒或晒后修复或促进HUVEC细胞增殖或抗肿瘤(例如乳腺癌、肺癌、或神经胶质瘤)或提高免疫力的药物或者在制备食品或保健品或化妆品中的用途；具体地，所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆
品O本发明的再一方面涉及一种在体内或体外促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或防晒或晒后修复或促进HUVEC细胞增殖或抑制肿瘤细胞(例如乳腺癌细胞、肺癌细胞、或神经胶质瘤细胞)的方法，包括给与受试者或使用有效量的本发明任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的步骤；具体地，所述受试者为哺乳动物，更具体地，所述受试者为人。
在本发明中，如果没有特别说明，“低分子透明质酸或低分子透明质酸盐”亦简称为“低分子透明质酸或其盐”，低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的分子量为IOkDa -1OOOkDa ;优选为 IOkDa — 500kDa ;更优选为 IOkDa — 400kDa ;进一步优选为 IOkDa —300kDa、IOkDa — 200kDa、IOkDa — 150kDa、IOkDa — lOOkDa、IOkDa — 50kDa 或 IOkDa —30kDa。低分子透明质酸盐的种类并不特别限定，包括但不限于:钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌
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ΠΤΤ.-rf* -rf* O本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比(w/w)。下面还给出了本发明涉及的术语的解释。表达载体本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括一个或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码透明质酸酶的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自 主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich, 1978，美国国家科学院学报75:1433)。可以向宿主细胞插入一个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少一个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如SambiOOk等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。宿主细胞本发明还涉及包含可用来重组生产透明质酸酶的本发明所述核酸序列(多核苷酸)的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞,从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于透明质酸酶编码基因及其来源。宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。制备方法本发明还涉及重组制备本发明透明质酸酶的方法，该方法包括:(a)在适于产生透明质酸酶的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述透明质酸酶的核酸序列；和(b)回收该肽。在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适透明质酸酶产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许透明质酸酶表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果透明质酸酶被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收。如果透明质酸酶不分泌，可以从细胞裂解物中回收。可以用本领域已知方法回收所产生的透明质酸酶。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收。可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述透明质酸酶，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、HPLC、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers, NewYork, 1989)。发明的有益效果该发明的透明质酸酶是一种新酶，未见报道，该酶酶活高，解决了现有发酵来源的透明质酸酶酶活低、动物来源的透明质酸酶成本高的缺点。本发明生产低分子透明质酸或其盐的制备方法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产。本发明制备的低分子透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强、颜色无褐变等优点，可用在化妆品、食品及医药领域。


图1:SDS-PAGE 电泳图。其中 ，Marker 为 Unstained Protein Molecular WeightMarker，泳道1、2、3分别为实施例10、11、12制备的透明质酸酶。图2:温度对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的热稳定性实验结果。图2A，温度对酶活性的影响；图2B，透明质酸酶的热稳定性实验结果。图3:pH对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的pH稳定性实验结果。图3A，pH对酶活性的影响；图3B,透明质酸酶的pH稳定性实验结果。图4A:低分子透明质酸盐的DPPH自由基清除能力。图4B:低分子透明质酸盐的还原能力。图5A:低分子透明质酸盐对L929细胞UVA辐照后的修复作用。图5B:低分子透明质酸盐对L929细胞UVA辐照的防护作用。本发明涉及保藏的生物材料:本发明芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50，其于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.5744，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，100101。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。下述的实施例或比较例或实验例中，低分子透明质酸盐的分子量测定采用GPC-MALLS法；含量测定采用HPLC法或咔唑法。低分子透明质酸与直接发酵制得的透明质酸(结构未被破坏)都是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的，因此它们的含量等于双糖的含量，可以用芽孢杆菌透明质酸酶将低分子透明质酸或普通透明质酸降解成双糖，通过HPLC法测定双糖含量，得到低分子透明质酸盐的含量；还可采用咔唑法(凌沛学.透明质酸M.北京:中国轻工业出版社，2002)测定低分子透明质酸的含量。如果透明质酸或其盐的结构受到破坏，则透明质酸酶不会对破坏部分的糖苷键进行裂解，这样会造成双糖含量降低。而咔唑法的测定原理是通过测定己糖醛酸的含量来推测低分子透明质酸或直接发酵制得的透明质酸的含量。因此，也可用这两种方法测得的含量的差值来间接地考察透明质酸或其盐的结构是否受到破坏及破坏的程度。本发明降解透明质酸或其盐所用的透明质酸酶(即芽孢杆菌透明质酸酶，下同)是由芽孢杆菌A50发酵得透明质酸酶发酵液，然后经离心、硫酸铵分级沉淀、超滤等步骤得到的。其制备过程是:取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.) A50 CGMCC N0.5744)接种于已灭菌的种子培养基中，25 - 400C UOO - 200rpm下培养10 — 24小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为3 — 15%，25 — 400C >100 — 300rpm下培养12 — 24小时，发酵过程中用酸将PH维持在6.0 — 8.0,发酵结束得透明质酸酶发酵液，发酵液经10000 - 15000rpm离心10 — 20min得上清液，，将上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为20% — 25%，过滤产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为35% -40%为止，得到的沉淀即为透明质酸酶，溶于磷酸盐缓冲液中，最后经3 X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得酶解用透明质酸酶。所用的 培养基为:
斜面培养基(IOOmL):蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g，MgSO4.7H20 0.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g，琼脂粉 2.0g, pH 调至 6.0 — 8.0，水，斜面培养的温度为25 - 40°C。种子培养基(IOOmL):蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g, MgSO4.7H20 0.05 — 0.15g,葡萄糖 0.5 — 1.5g, pH 调至 6.0 — 8.0。发酵培养基(IOOmL):蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g, MgSO4.7Η20 0.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g，吐温 800.05mL，pH 调至 6.0 - 8.0。采用中国药典方法(参照中国药典2010版附录YD C玻璃酸酶测定法)测定由以上方案制得的发酵液中的透明质酸酶活力在IXlO5 — 3X105IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为 8 X IO6 — 1.5 X 107IU/mg。实施例1:芽孢杆菌(Bacillus sp.) A50的获得和鉴定1.芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 的获取将装有富集培养基的平皿打开盖，放置于空气中，收集空气中沉降菌，约I小时后，盖上盖，置于25 — 40°C培养箱中有氧培养,培养24小时后,将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中，25 — 40°C，150rpm，有氧培养12 — 16小时，采用中国药典方法测定透明质酸酶活力，选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种，菌种酶活力可达105IU/mL。上述所采用的各培养基组成如下:富集培养基(IOOmL):蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0g，K2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g，MgSO4.7H20 0.05 — 0.15g，透明质酸钠 0.01 — lg，琼脂粉 2.0g。筛选培养基(IOOmL):蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g，MgSO4.7Η20 0.05 — 0.15g，透明质酸钠 0.01 — lg。得到芽孢杆菌(Bacillus sp.) A50于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.5744，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，100101。2.芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的形态特征菌体杆状，单个或链状。菌落乳白色，有皱褶。3.芽孢杆菌(Bacillus sp.) A50的分子生物学特征鉴定按照Weisburg的方法合成细菌16S rDNA通用引物:引物1:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；(SEQ ID NO:4)；引物2:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO:5)。以菌株A50的总DNA (使用北京天恩泽柱式细菌基因组DNAout试剂盒提取)为模板，扩增其16S rDNA片段，PCR扩增反应体系如下:
权利要求
1.一种制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法，包括使用由保藏号为CGMCCNo. 5744的芽孢杆菌制得的透明质酸酶或者SEQID NO 2所编码的透明质酸酶对分子量大于IOOOkDa的透明质酸或其盐进行降解的步骤。
2.根据权利要求I所述的方法，其包含如下步骤 1)配制透明质酸或其盐溶液向纯化水中加入分子量大于IOOOkDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为O. 1% — 2%的溶液； 2)酶解调节步骤I)中溶液的温度为20- 48°C、pH为4 一 9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液； 3)灭活将酶解液在50— 90°C下保持10 — 60min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活； 优选地，还包括如下步骤 4)过滤向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为O. 45m的滤膜过滤，得滤液，每IOOmL酶解液中加入O. I 一 IOg的易溶性无机盐； 5)沉淀将步骤4)的滤液与滤液体积I一 10倍的醇或酮混合均匀，析出低分子透明质酸盐沉淀； 6)脱水干燥将步骤5)中的低分子透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得低分子透明质酸盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤I)中，每Ikg透明质酸或其盐中加IO6-IO7IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤2)中，酶解温度为35- 45°C，酶解pH为5. 5 - 7. 5，将透明质酸酶解至分子量为IOkDa — IOOOkDa0
5.根据权利要求2所述的方法，其满足如下的A— F中的任一项或多项 A.步骤I)中，透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐； B.步骤2)中，采用酸或碱调节pH至4一 9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾； C.步骤3)中，将酶解液在55- 65°C下保持20 — 30min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活； D.步骤4)中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐；优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐、或硝酸盐； E.步骤5)中，所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇； F.步骤6)中，脱水所用的有机溶剂为酮或醇。
6.一种低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其由权利要求I至5中任一项所述的方法制得。
7.一种低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量≥ 90%或≥95% (w/w);具体地，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法测得。
8.根据权利要求6或7所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，其分子量为IOkDa - IOOOkDa ;优选为 IOkDa — 770kDa 或 IOkDa — 700kDa 或 IOkDa — 600kDa 或 IOkDa —500kDa ;更优选为 IOkDa — 400kDa ;进一步优选为 IOkDa — 300kDa、IOkDa — 200kDa、IOkDa 一 150kDa、IOkDa — lOOkDa、IOkDa — 50kDa 或 IOkDa — 30kDa。
9.一种组合物，其包含权利要求6至8中任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐；可选地，其还包含药学上或食品学上可接受的载体或辅料。具体地，所述组合物为化妆品；更具体地，所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。
10.权利要求6至8中任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐在制备促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或防晒或晒后修复或促进HUVEC细胞增殖或抗肿瘤或提高免疫力的药物或者在制备食品或保健品或化妆品中的用途；具体地，所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。
11.一种在体内或体外促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或防晒或晒后修复或促进HUVEC细胞增殖或抑制肿瘤细胞的方法,包括给与受试者或使用有效量的权利要求6至8中任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的步骤；具体地，所述受试者为哺乳动物，更具体地，所述受试者为人。
全文摘要
本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种低分子透明质酸盐、其制备方法及用途。具体地，所述制备方法包括使用由保藏号为CGMCC No.5744的芽孢杆菌制得的透明质酸酶或者SEQ ID NO2所编码的透明质酸酶对分子量大于1000kDa的透明质酸或其盐进行降解的步骤。本发明利用芽孢杆菌生产的透明质酸酶制备低分子透明质酸或其盐的方法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产。本发明制备的低分子透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强、颜色无褐变等优点，可用在化妆品、食品及医药领域。
文档编号A61K8/73GK103255187SQ20121049937
公开日2013年8月21日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年2月21日
发明者郭学平, 石艳丽, 王冠凤, 冯宁, 李海娜, 乔莉苹, 毛华, 栾贻宏, 刘爱华 申请人:华熙福瑞达生物医药有限公司