一种高产透明质酸的基因工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物技术和生物化工领域的一种高产透明质酸的基因工程菌及其应用。所述基因工程菌，其是将含有透明质酸合成酶基因的重组载体转化谷氨酸棒杆菌构建而成，所述透明质酸合成酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No:1所示。上述基因工程菌用于生产透明质酸，单独表达透明质酸合成酶就可以获得高透明质酸产量，CgHasB和CgHasC不会成为限制重组菌高产的瓶颈。本发明方法的谷氨酸棒杆菌宿主对人和动物均无致病性，为食品级安全微生物，合成的透明质酸产量高，达到6.0g/L以上，具有良好的产业化应用前景。
【专利说明】一种高产透明质酸的基因工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高产透明质酸的基因工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002]透明质酸 (Hyaluronic acid, HA)是广泛存在于人和动物体内的一种酸性粘多糖，是由D-葡萄糖醒酸(D-glucuronic acid, GlcA)和N-乙酰-氨基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)交替构成的直链多糖,其分子量能够达到105~107道尔顿。透明质酸溶于水，不溶于有机溶剂。透明质酸在人体内具有多种重要生理功能，主要包括对关节的润滑作用、促进创伤的愈合、对血管壁通透性的调节、调节蛋白质/水电解质扩散及运转、影响人类皮肤的成熟和老化等等。临床上，透明质酸广泛用于眼科手术、各种骨关节炎、风湿性关节炎以及股骨头坏死及药物递送。在化妆品方面，透明质酸是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质，被誉为理想的天然保湿因子。在保健品方面，口服透明质酸可使血液微循环量增加，细胞活化，预防衰老。
[0003]透明质酸发展至20世纪80年代初时，主要采用生物组织提取法制备，原料为雄公鸡的鸡冠，产量很低；同时由于组织提取时受动物蛋白以及粘多糖影响，纯化成本较高；而且对于某些蛋白过敏的人来说，提取HA产品的安全性也是一个问题。丹麦Novozytne公司在80年代末首创通过微生物发酵法生产透明质酸。该方法成本低、容易大量规模成产，且产品易于分离纯化。
[0004]目前，发酵法已成为中国透明质酸生产的主要工艺。常用的生产菌株为兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等动物致病菌(中国发明专利ZL94104439.4，制备透明质酸的微生物、培养基和方法)，透明质酸的产量一般为4~7g/L，国外可达到6~10g/L(Kim J
H,Yoo S Jj Kweon Y G，Selection of a Streptococcus equi mutant and optimizationof culture conditions for the production of high molecular weight hyaluronicacid, Enzyme Microbiol.Technolj 1996，19:440-445)。链球菌发酵生产的营养要求较高，培养基需含血清、小牛肉浸出液、脑心浸出液等，工业生产的成本高；并且由于菌株具有致病性风险，HA的生产安全性限制了链球菌工艺的发展，研究更加安全并且经济可行的基因重组菌发酵生产透明质酸受到了重视。
[0005]2001年，中国发明专利ZL98812773.3公开了“透明质酸合成酶基因及其应用”。利用不同来源的透明质酸合成酶基因，Novozyme公司开发了基因重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来合成透明质酸,优选菌株的透明质酸产量与链球菌发酵法的产量相当(Widner B, Behr R, Von Dollen S, Hyaluronic acid production in Bacillussubtilis, Appl Environ Microbiol, 2005, 71 (7): 3747-52)，还申请了发明专利“低分子量透明质酸的产生”(CN101384724A)。Yu等人探讨了在革兰氏阴性菌重组大肠杆菌(Escherichia coli)中发酵生产HA的可行性，分别考察了操纵子选择、稀有密码子效应、细菌生长抑制、HA产量和分子量大小等影响(Yu H, Stephanopoulos G, Metabolicengineering of Escherichia coli for biosynthesis of hyaluronic acid, MetabEng.，2008，Jan, 10(1):24-32)。Chien等人于2007年成功构建了基因重组乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis),36小时发酵培养后,积累了 0.65g/L的透明质酸(Chien L J, Lee CK, Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis, Appl MicrobiolBiotechnol, 2007, 77 (2):339-46)。Mao 等在 2007 年报道了在土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)中克隆并表达来自多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的二类透明质酸合成酶(pmHAS)和来自大肠杆菌E.coli K15菌株的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(kfiD)，摇瓶培养 56 小时后，积累得到透明质酸 0.3g/L(Mao Z, Chen R R, Recombinant synthesis ofhyaluronan by Agrobacterium sp., Biotechnol Prog, 2007, 23 (5): 1038-42)。以绿藻病毒(Chlorella virus) PBCV-1感染绿藻细胞,也能够合成透明质酸,产量能够达到0.5~Ig/L(Graves M V, Burbank D E, Roth R, Hyaluronan synthesis in virus PBCV-1infectedChlorella-1ike green algae,Virology, 1999,257:15-23)。
[0006]到目前为止，未见有利用谷氨酸棒杆菌为宿主，来生产透明质酸的报道。
[0007]谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是好氧细菌，细胞短杆或小棒状，革兰氏阳性。2003年，谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组测序工作完成(http://gib.Renes.niR.ac.jp/)，分析发现，其基因组中不含有降解HA的透明质酸酶，而存在协助透明质酸合成酶表达的Μ)Ρ-葡萄糖脱氢酶(简写为CgHasB)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(简写为CgHasC)。谷氨酸棒杆菌是多年来世界氨基酸生产的主要菌株。其本身不分泌任何内毒素和外毒素的特点保证了其分泌产品符合食品安全和医药产品安全标准。而作为长久沿用的工业化生产菌株，它也具有强大的生物合成和分泌功能。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种高产透明质酸的基因工程菌。
[0009]本发明的目的还在于提供上述基因工程菌在制备透明质酸中的应用。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将含有透明质酸合成酶基因(shasA)的重组载体转化谷氨酸棒杆菌构建而成，所述透明质酸合成酶基因的核苷酸序列如序列表SEQID No:1 所示。
[0012]所述重组载体还含有UDP-葡萄糖脱氢酶基因Cgl0360。
[0013]所述重组载体还含有UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因Cgl0367。
[0014]C.glutamicum中Cgl0360编码的UDP-葡萄糖脱氢酶与马链球菌中HasB的同源性为55%，将其简记为CgHasB。
[0015]C.glutamicum中Cgl0367编码的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶与马链球菌中HasC的同源性为37%，将其简记为CgHasC。
[0016]所述重组载体为pEC-XK99E、pXMJ19 或 pJCl。
[0017]所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
[0018]上基因工程菌在制备透明质酸的中的应用。
[0019]采用权利要求上述基因工程菌生产明质酸，步骤如下:
[0020] I)将工程菌接入LB液体培养基中，在25-40°C、摇床转速为100-300rpm/min的条件下培养10-30小时，得到工程菌菌液；
[0021]2)按照1-20%的体积百分比将步骤I)得到的工程菌菌液接入发酵培养基中，在25-40°C、摇床转速为100-300rpm/min的条件下培养1-5小时，加入诱导剂0.05-5.0g/L，继续培养24-72小时，得到含有透明质酸的发酵液；
[0022]所述发酵培养基的组成为:糖类20_100g/L，无机氮源10_50g/L，有机氮源2_40g/L, KH2PO40.l-5g/L, K2HPO4.12H200.5_5g/L，MgSO4.7H200.l_8g/L，MnSO4.H2O0.002-0.lg/L, FeSO4.7H200.002-0.lg/L g/L, pH6.0-8.0。
[0023]所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷或乳糖。
[0024]所述糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液。[0025]所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠或硝酸钾；所述有机氮源为蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、玉米浆粉或大豆粉。
[0026]本发明的基因工程菌为重组谷氨酸棒杆菌，是以谷氨酸棒杆菌为宿主菌，将设计合成的透明质酸合成酶基因shasA通过大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒载体转化至谷氨酸棒杆菌、同时过表达UDP-葡萄糖脱氢酶(CgHasB)或者CgHasB和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(CgHasC)构建而成，分别获得基因工程菌C.glu A、C.glu AB和C.glu ABC。
[0027]一种上述重组谷氨酸棒杆菌构建方法步骤包括:
[0028]1、基于谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的密码子偏爱性，设计并化学合成透明质酸合成酶 sHasA 的基因序列 shasA，如 SEQ ID No:l 所示。以 A_s (SEQ ID No: 2)和 A_as (SEQ IDNo:3)为上下游引物，进行聚合酶链式反应，扩增获得shasA基因。
[0029]2、将shasA基因以及谷氨酸棒杆菌_大肠杆菌穿梭质粒，如pXMJ19 (BiovectorC0.，LTD,北京)，分别进行Xba I与BamH I双酶切，37°C反应过夜；然后将酶切产物纯化，使用T4连接酶将两种酶切产物进行连接，反应温度15-25°C，反应时间12-16h，得到连接产物。
[0030]3、将连接产物转化E.coli宿主菌T0P10感受态细胞，涂布LB平板(含氯霉素)，挑取抗性克隆进行培养，提取质粒进行PCR及测序验证，得到带有shasA基因的重组质粒PXMJ19-A。
[0031]4、以B-S和B-as为上下游引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应，获得Μ)Ρ-葡萄糖脱氢酶CgHasB基因序列，如SEQ ID No:4所示。所述上游引物B-s的碱基序列如SEQ ID No: 5所示，所述下游引物B-as的碱基序列如SEQ IDNo:6所示。
[0032]5、将CgHasB基因以及重组质粒pXMJ19_A分别进行Kpn I与Sac I双酶切，37°C反应过夜；然后将酶切产物纯化，使用T4连接酶将两种酶切产物进行连接，反应温度15-250C，反应时间12-16h，得到连接产物。
[0033]6、将连接产物转化E.coli宿主菌T0P10感受态细胞，涂布LB平板(含氯霉素)，挑取抗性克隆进行培养，提取质粒进行PCR及测序验证，得到带有shasA及CgHasB基因的重组质粒PXMJ19-AB。
[0034]7、以C-S和C-as为上下游引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应，获得Μ)Ρ-葡萄糖焦磷酸化酶(CgHasC)的基因序列，如SEQ ID No: 7所示。所述上游引物C-s的碱基序列如SEQ ID No:8所示，所述下游引物C-as的碱基序列如 SEQ ID No:9 所示。
[0035] 8、将CgHasC基因以及重组质粒pXMJ19_AB分别进行Sac I单酶切，37°C反应过夜；然后将酶切产物纯化，使用碱性磷酸酶将质粒纯化产物进行去磷酸化处理，反应温度37°C，反应时间Ih ;然后将产物纯化，使用T4连接酶将两种酶切产物进行连接，反应温度15-250C，反应时间12-16h，得到连接产物。
[0036]9、将连接产物转化E.coli宿主菌T0P10感受态细胞，涂布LB平板(含氯霉素)，挑取抗性克隆进行培养，提取质粒进行PCR及测序验证，得到带有shasAXghasB和CghasC基因的重组质粒PXMJ19-ABC。
[0037]10、将重组质粒pXMJ19-A、pXMJ19_AB和pXMJ19_ABC使用电转化方法转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，涂布LB平板(含氯霉素)，挑取抗性克隆进行培养，进行PCR验证，分别获得转化有PXMJ19-A、pXMJ19-AB和pXMJ19_ABC质粒的基因工程菌C.glu A、C.glu AB和 C.glu ABC0
[0038]本发明的优点和有益效果:本发明采用分子生物学方法和技术，根据谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌密码子偏爱性重新设计并化学合成了透明质酸合成酶sHasA基因序列SEQ IDNo:1。该基因被谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒携带在谷氨酸棒杆菌中表达时，谷氨酸棒杆菌高度稀有密码子(使用频率为0-10%)从47个下降为O个，一般稀有密码子(使用频率为10-20%)从63个下降为29个。而在大肠杆菌中表达时，大肠杆菌高度稀有密码子则从36个下降为O个。将SEQID No:1与谷氨酸棒杆菌中的Μ)Ρ_葡萄糖脱氢酶(CgHasB)或者CgHasB和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(CgHasC)同时过表达发现，当以谷氨酸棒杆菌为宿主时，单独表达SEQ ID No:1就可以获得高透明质酸产量，CgHasB和CgHasC不会成为限制重组菌高产的瓶颈。本发明方法的谷氨酸棒杆菌宿主对人和动物均无致病性，为食品级安全微生物，合成的透明质酸产量高，达到6.0g/L以上，具有良好的产业化应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为含有sHasA基因的重组质粒pXMJ19_A的PCR验证图；泳道I为DNA分子量标准，由上至下第四条带为1.2kb ;泳道2为重组质粒pXMJ19-A使用引物A_s和A_as进行PCR扩增的结果，约1.3kb。
[0040]图2为含有CgHasB基因的重组质粒pXMJ19_AB的PCR验证图；泳道I为重组质粒PXMJ19-AB使用引物B-s和B_as进行PCR扩增的结果，1.2kb ;泳道2为DNA分子量标准，由上至下第四条带为1.2kb。
[0041 ] 图3为含有CgHasC基因的重组质粒pXMJ19_ABC的PCR验证图；泳道I为DNA分子量标准，由上至下第四条带为1.2kb ;泳道2为重组质粒pXMJ19-ABC使用引物C_s和C_as进行PCR扩增的结果，lkb。
[0042]图4为含有未插入外源基因的空质粒pXMJ19的谷氨酸棒杆菌与基因工程菌C.gluA、C.glu AB和C.glu ABC生产的透明质酸的浓度的比较结果。
【具体实施方式】
[0043]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。
[0044]实施例1
[0045]携带透明质酸合成酶sHasA基因以及CgHasB、CgHasC基因的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭质粒的构建
[0046]质粒PXMJ19-A的构建:基于谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的密码子偏爱性，设计并化学合成透明质酸合成酶sHasA的基因序列shasA，如SEQ ID No:1所示。对该基因和原马链球菌透明质酸合成酶基因在谷氨酸棒杆菌中的密码子使用频率进行分析，发现SEQ IDNo:1不含谷氨酸棒杆菌的高度稀有密码子(使用频率为0-10% )，一般稀有密码子数量也仅为29个,相对于原基因的63个也大幅度下降。同样分析SEQ ID No:l在大肠杆菌中的密码子使用频率，结果发现，SEQID No:1同样适合在大肠杆菌中表达，不含有大肠杆菌的高度稀有密码子。
[0047]以A_s(SEQ ID No: 2)和A_as (SEQ ID No: 3)为上下游引物，进行聚合酶链式反应，扩增获得shasA基因。引物由钼尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10 μ M使用。PCR扩增所用聚合酶、缓冲液、dNTP购自TaKaRa公司。
[0048]PCR扩增反应体系为:
[0049]
【权利要求】
1.一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将含有透明质酸合成酶基因的重组载体转化谷氨酸棒杆菌构建而成，所述透明质酸合成酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组载体还含有UDP-葡萄糖脱氢酶基因Cgl0360。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组载体还含有UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因Cgl0367。
4.权利要求1、2或3所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组载体为PEC-XK99E、PXMJ19 或 pJCl。
5.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
6.权利要求1-5任一所述的基因工程菌在制备透明质酸的中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述基因工程菌生产明质酸，步骤如下: 1)将工程菌接入LB液体培养基中，在25-40°C、摇床转速为100-300rpm/min的条件下培养10-30小时，得到工程菌菌液； 2)按照1-20%的体积 百分比将步骤I)得到的工程菌菌液接入发酵培养基中，在25-40°C、摇床转速为100-300rpm/min的条件下培养1-5小时，加入诱导剂0.05-5.0g/L，继续培养24-72小时，得到含有透明质酸的发酵液； 所述发酵培养基的组成为:糖类20-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源2_40g/L，KH2PO40.l-5g/L, K2HPO4.12H200.5_5g/L，MgSO4.7H200.l_8g/L，MnSO4.H2O0.002-0.lg/L,FeSO4.7H200.002-0.lg/L g/L, pH6.0-8.0。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷或乳糖。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠或硝酸钾；所述有机氮源为蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、玉米浆粉或大豆粉。
【文档编号】C12P19/26GK103937734SQ201410166015
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】于慧敏, 龚倩莹, 王君婷, 成方宇, 沈忠耀 申请人:清华大学