专利名称：鹅掌草皂苷的抗癌作用及其在制备抗癌剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹅掌草皂苷的抗癌作用及其应用。
背景技术：
鹅掌草(Anemone flaccida Fr.Schmidt)系毛茛科银莲花属(Anemone L.)多年生植物。该属植物约有150种左右，世界各大洲均有分布，我国有54种，除海南省外，其它各省均有分布，其中鹅掌草在湖北省西部有广泛的分布。该属植物可作药用的有竹节香附(A.raddeana)、鹅掌草(A.flaccida)、草玉梅(A.rivularis)等数种，多以根或根茎入药，具有祛风湿、消肿解毒等功效。如《风湿安中药制剂及制备和应用》(专利号200510018364.3)，其组成有效成分为3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为地乌皂苷W3，分子式为C59H96O25，用于治疗风湿类疾病。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供鹅掌草皂苷的抗癌作用及其在制备抗癌剂中的应用。
本发明目的的实现方式为，鹅掌草皂苷的抗癌作用，化学结构式为 的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物，如3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C54H86O23；3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C48H76O19；3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-葡萄糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C58H94O25；3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)α-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C59H96O25；3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C59H96O23能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞有抑制作用。
鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，化学结构式为 的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物与固体或液体形式的剂型赋形剂一起制备抗癌剂，抗癌剂中的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物成人口服剂量为1-50mg/60kg体重。
抗癌剂每天一次或几次，较佳为3-15mg/天/60kg体重。
图1是鹅掌草中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用效果2是鹅掌草中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物对人宫颈癌HeLa细胞中Caspase-3表达影响效果图具体实施方式
本发明鹅掌草皂苷的化学结构式为 R1、R2取代基不同的鹅掌草皂苷类化合物有以下几种
1.3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，R1、R2取代基分别为glcA、glc(6-1)glc(4-1)rha，分子式C54H86O23，波谱数据Mp217～218℃(dec)IRvmaxKBr3421(-OH)，1733(C＝O)，1613(C＝C)，1480，1385，1260，1032UVλmaxMeOHnm206ESI-MS m/z1102[M]-，632，4561H-NMR(C5D5N+D2O)δ0.77(3H，s，CH3)、0.83(3H，s，CH3)、0.85(3H，s，CH3)、0.94(3H，s，CH3)、1.01(3H，s，CH3)、1.19(3H，s，CH3)、1.24(3H，s，CH3)，1.63(3H，d，J＝6.18Hz)δ4.84(1H，d，J＝9.3Hz)，4.93(1H，d，J＝7.8Hz)，5.76(1H，br.s)，6.16(1H，d，J＝8.11Hz)2.3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，R1、R2取代基分别为glcA、glc(6-1)glc，分子式C48H76O19，波谱数据Mp207～208℃(dec)IRvmaxKBr3406(-OH)，1732(C＝O)，1611(C＝C)，1480，1385，1260，1029UVλmaxMeOHnm206ESI-MS m/z956[M]-，632，4561H-NMR(C5D5N+D2O)δ0.76(3H，s，CH3)、0.82(3H，s，CH3)、0.84(3H，s，CH3)、0.94(3H，s，CH3)、1.02(3H，s，CH3)、1.19(3H，s，CH3)、1.24(3H，s，CH3)；δ4.85(1H，d，J＝8.0Hz)，4.95(1H，d，J＝8.0Hz)，6.17(1H，d，J＝8.8Hz)3.3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-葡萄糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，R1、R2取代基分别为glc(2-1)rha，glc(6-1)glc(4-1)rha，C58H94O25，波谱数据Mp215～218℃(dec)IRvmaxKBr3100-3600，1063，2940，1735，1635UVλmaxMeOHnm209ESI-MS m/z1233[M-H]-，1087，763，469，4551H-NMR(C5D5N)δ0.82(3H，s，CH3)，0.84(3H，s，CH3)，0.85(3H，s，CH3)，1.05(3H，s，CH3)1.16(3H，s，CH3)，1.19(3H，s，CH3)，1.21(3H，s，CH3)，δ1.65(3H，d，J＝6.18Hz)，5.35(1H，br.s)6.55(1H，br.s)，6.21(1H，d，J＝7.9Hz)，5.83(1H，br.s)，4.96(1H，d，J＝8.2Hz)4.82(1H，d，J＝6.5Hz)4.3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)α-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，R1、R2取代基分别为glc(2-1)rha，glc(6-1)glc(4-1)rha，C58H96O25，波谱数据Mp208～210℃(dec)
IRvmaxKBr3413(-OH)，1734(C＝O)，1648(C＝C)，1458，1387，1262，1231，1085UVλmaxMeOHnm206ESI-MS m/z1227.5[M+Na]+，1081.5，949.5，757.41H-NMR(C5D5N)δ0.87(9H，m，3×CH3)，1.06(3H，s，CH3)，1.07(3H，s，CH3)，1.15(3H，s，CH3)，1.22(3H，s，CH3)，1.61(3H，d，J＝5.86Hz)，1.70(3H，d，J＝5.86Hz)δ4.87(1H，d，J＝4.89Hz)，4.97(1H，d，J＝8.3Hz)，5.85(1H，br.s)，6.14(1H，d，br.s)，6.23(1H，d，J＝7.81Hz)5.3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，R1、R2取代基分别为glc(2-1)rha，glc(6-1)glc(4-1)rha，C58H96O25，波谱数据Mp208～210℃(dec)IRvmaxKBr3408(-OH)，1735(C＝O)，1642(C＝C)，1480，1387，1260，1232，1037UVλmaxMeOHnm205ESI-MS m/z1203[M-H]-，733，4691H-NMR(C5D5N)δ0.87(9H，m，3×CH3)，1.08(3H，s，CH3)，1.18(3H，s，CH3)，1.22(3H，s，CH3)，1.23(3H，s，CH3)，1.69(3H，d，J＝4.88Hz)，1.70(3H，d，J＝5.37Hz)δ4.82(1H，d，J＝7.3Hz)，4.98(1H，d，J＝7.8Hz)，5.85(1H，br.s)，6.23(1H，d，J＝7.82Hz)，6.53(1H，br.s，C-5-CH3 of Rha)鹅掌草皂苷与固体或液体形式的剂型赋形剂一起制备抗癌剂，固体或液体形式的剂型赋形剂为常用的赋形剂，赋形剂的加量应满足抗癌剂中的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物成人口服剂量为1-50mg/60kg体重。抗癌剂每天一次或几次，较佳为3-15mg/天/60kg体重。剂型有口服剂型、注射剂、局部给药剂型；口服剂型有粉剂、片剂、悬浮液、乳剂、胶囊剂、颗粒剂、锭剂、丸剂、醑剂、糖浆剂或柠檬水剂；局部给药剂型有软膏、固体、悬浮液、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、搽剂、洗剂、灌肠剂或乳剂。
可使用的，公知的固体或液体形式的赋形剂，都可用于本发明的抗癌剂，粉剂和其它口服粉剂的赋形剂有乳糖、结晶纤维素、淀粉、糊精、磷酸钙、碳酸钙、合成的和天然的二氧化铝、氧化镁、干燥氢氧化铝、硬脂酸镁、碳酸氢钠中的一种或几种；局部给药粉剂中的赋形剂有氧化锌、滑石粉、淀粉、高岭土、硼酸盐粉、硬脂酸锌、硬脂酸镁、碳酸镁、沉淀碳酸钙、碱式没食子酸铋、硫酸钾铝粉中的一种或几种；液体药剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、甜味糖浆、乙醇、脂肪油、聚乙二醇、山梨醇中的一种或几种；
软膏的赋形剂有经混合脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜡、日本腊、石蜡、硫酸石蜡、树脂、高级醇、塑料、乙二醇类、水或表面活性剂而制成的疏水或亲水性基质，包括油溶基、水溶基和悬浮基。
下面举出本发明配方实施例例1将乳糖、结晶纤维素和1％硬脂酸镁的混合物加到30mg R1、R2取代基为1的鹅掌草皂苷中，混合均匀，用压片机压片，得片剂。
例2将乳糖、结晶纤维素和1％硬脂酸镁的混合物加到30mg R1、R2取代基为2的鹅掌草皂苷中，混合均匀，用压片机压片，得片剂。
例3将乳糖、结晶纤维素和1％硬脂酸镁的混合物加到30mg R1、R2取代基为3的鹅掌草皂苷中，混合均匀，用压片机压片，得片剂。
例4将乳糖、结晶纤维素和1％硬脂酸镁的混合物加到30mg R1、R2取代基为4的鹅掌草皂苷中，混合均匀，用压片机压片，得片剂。
例5将乳糖、结晶纤维素和1％硬脂酸镁的混合物加到30mg R1、R2取代基为5的皂苷中，混合均匀，用压片机压片，得片剂。
例6在无菌操作下，将15mg R1、R2取代基为1的鹅掌草皂苷和多乙氧基醚(polysorbit 80)的溶液灌入无菌小瓶，除去水分后，得到注射用制剂。
例7在无菌操作下，将15mg R1、R2取代基为2的鹅掌草皂苷和多乙氧基醚(polysorbit 80)的溶液灌入无菌小瓶，除去水分后，得到注射用制剂。
例8在无菌操作下，将15mg R1、R2取代基为3的鹅掌草皂苷和多乙氧基醚(polysorbit 80)的溶液灌入无菌小瓶，除去水分后，得到注射用制剂。
例9在无菌操作下，将15mg R1、R2取代基为4的鹅掌草皂苷和多乙氧基醚(polysorbit 80)的溶液灌入无菌小瓶，除去水分后，得到注射用制剂。
例10在无菌操作下，将15mg R1、R2取代基为5的鹅掌草皂苷和多乙氧基醚(polysorbit 80)的溶液灌入无菌小瓶，除去水分后，得到注射用制剂。
本申请人作了鹅掌草皂苷抗肿瘤试验实验1、鹅掌草皂苷对人宫颈癌细胞株HeLa的抗肿瘤活性a.实验方法本实验采用人宫颈癌细胞株HeLa，取对数期细胞制成细胞悬液，稀释至浓度为2.5×103-50×103/mL，接种于96孔培养板内，每孔200μL，24h后倾出培养液，加入含不同浓度R1、R2取代基为1-5的鹅掌草皂苷的培养液，终浓度为50，20，5，0.5μmol/L，加PBS于培养液中为空白对照，每样品均设4孔。对照孔及调零孔加200μL培养液。在加药后24h加入MTT溶液20μL，继续培养，小心倒去培养液，加入200μLDMSO，在酶标仪上测定各孔A值，测定波长为570nm。按公式抑制率(IR)IR(％)＝(1-给药孔平均A值/对照孔平均A值)×100％计算抑制率。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线，由此计算出IC50值。表1显示了实验结果表1
a评价强活性(IC50＜0.1μmolL-1)， 活性(0.1μmolL-1＜IC50＜1μmolL-1)，弱活性(1μmolL-1＜IC50＜20μmolL-1)， 无活性(IC50＞20μmolL-1)，取代基R1、R2为5的鹅掌草皂苷对细胞凋亡的影响最大，其次为R1、R2取代基为4、3、1、2的鹅掌草皂苷。
实验2，流式细胞仪检测R1、R2取代基为1-5的鹅掌草皂苷对细胞凋亡的影响a.实验方法传代培养的人宫颈癌HeLa细胞生长24h以后，分别加入R1、R2取代基为1-5的鹅掌草皂苷继续培养12h，终浓度为0.05mg/mL，阴性对照组加入等量溶剂。然后取出细胞经PBS清洗后，用70％的冰乙醇固定。检测前离心，用PBS清洗后，弃上清液。后加入1mL染色液(含PI 0.1mg/mL，RNase 0.1mg/mL，PBS配制)，室温避光20min，过300目尼龙网后上机，用CELLQuest软件分析，测定凋亡细胞的比例。
b.实验结果见表2及图2，表2
实验结果揭示各皂苷显示诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用，是其抗肿瘤活性的作用机制。
图2显示鹅掌草皂苷对人宫颈癌细胞HeLa凋亡作用大小依次为R1、R2取代基5(F)、4(E)，、3(D)、1(B)、2(C)。
实验例3，鹅掌草皂苷对人宫颈癌细胞Caspase-3表达的影响a.实验方法细胞爬片制备Hela细胞长满培养瓶80％时，用PBS清洗，再用0.25％胰蛋白酶室温消化2-3min，用吸管轻柔反复吹打，将细胞吹散，接种于预置盖玻片的6孔板中，贴壁后加入细胞终浓度为50μg/mL的皂苷1-5，阴性对照组加入等量溶剂，常规培养24h后取出盖玻片，用4％聚乙二醇固定，进行细胞免疫，组化染色，检测caspase-3蛋白的表达。
具体步骤取已固定的细胞爬片，用PBS洗2次，冷风吹干；0.1％Triton-X100孵育1次，后用PBS洗涤3次；3％H2O2孵育以阻断内源性过氧化物酶，之后PBS振洗3次，；滴加正常山羊血清封闭液，在湿盒内，37℃保温，以消除非特异性染色，弃去多余液体，不洗；滴加1∶100稀释的一抗(caspase-3大鼠IgG)，在湿盒内，4℃过夜，PBS振洗3次，每次3min；滴加生物素化山羊抗IgG，在湿盒内，37℃保温，PBS振洗3次；滴加试剂SABC，在湿盒内，37℃保温，PBS振洗3次；DAB染色使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至盖玻片，室温显色，镜下控制反应，后蒸馏水洗2次；苏木素复染(细胞核衬染)浸入苏木精染色液，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液以分化复蓝，水洗；逐级脱水过75％、95％、100％无水乙醇；透明过二甲苯溶液3次；封片将有细胞的一面朝下，用中性树脂封片。
显微镜下观察每张涂片随机取10个视野，每个视野计数300～500个细胞。分别计数Caspase-3免疫阳性细胞数目和阴性细胞数目，进行统计分析。在细胞膜和细胞浆出现棕黄色或褐色为Caspase-3表达阳性，细胞核染成兰色。
b.实验结果见表3及图3所示，实验结果揭示各皂苷显示诱导人宫颈癌HeLa细胞caspase-3高表达，进一步确证是其抗肿瘤活性的作用机制为诱导凋亡作用。
表3
图3.鹅掌草皂苷对人宫颈癌HeLa细胞中Caspase-3表达活性影响次序大小依次为R1、R2取代基5(F)、4(E)、3(D)、1(B)、2(C)。放大倍数×400。
从上述结果可以看到，取代基R1、R2为1-5的鹅掌草皂苷具有抗肿瘤作用，包括抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡及提高肿瘤细胞中Caspase-3表达作用。
在用大鼠和小鼠的一些实验中，R1、R2取代基为1-5的鹅掌草皂苷的毒性近于可忽略，每个配方实施例的制剂的稳定性是合格的。
权利要求
1.鹅掌草皂苷的抗癌作用，其特征在于化学结构式为 的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物，如3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C54H86O23；3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C48H76O19；3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-葡萄糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C58H94O25；3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)α-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C59H96O25；3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)β-D-吡喃木糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式C59H96O23能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞有抑制作用。
2.权利要求1所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于化学结构式为 的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物与固体或液体形式的剂型赋形剂一起制备抗癌剂，抗癌剂中的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物成人口服剂量为1-50mg/60kg体重。
3.根据权利要求2所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于剂型有口服剂型、注射剂或局部给药剂型，
4.根据权利要求3所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于口服剂型有粉剂、片剂、悬浮液、乳剂、胶囊剂、颗粒剂、锭剂、丸剂、醑剂、糖浆剂或柠檬水剂。
5.根据权利要求3所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于局部给药剂型有软膏、固体、悬浮液、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、搽剂、洗剂、灌肠剂或乳剂。
6.根据权利要求2所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于粉剂和其它口服粉剂的赋形剂有乳糖、结晶纤维素、淀粉、糊精、磷酸钙、碳酸钙、合成的和天然的二氧化铝、氧化镁、干燥氢氧化铝、硬脂酸镁、碳酸氢钠中的一种或几种；
7.根据权利要求2所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于局部给药粉剂中的赋形剂有氧化锌、滑石粉、淀粉、高岭土、硼酸盐粉、硬脂酸锌、硬脂酸镁、碳酸镁、沉淀碳酸钙、碱式没食子酸铋、硫酸钾铝粉中的一种或几种；
8.根据权利要求2所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于液体药剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、甜味糖浆、乙醇、脂肪油、聚乙二醇、山梨醇中的一种或几种。
9.根据权利要求2所述的鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，其特征在于软膏的赋形剂有经混合脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜡、日本腊、石蜡、硫酸石蜡、树脂、高级醇、塑料、乙二醇类、水或表面活性剂而制成的疏水或亲水性基质，包括油溶基、水溶基和悬浮基。
全文摘要
鹅掌草皂苷的抗癌作用及其在制备抗癌剂中的应用，涉及鹅掌草皂苷的抗癌作用及其应用。鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞有抑制作用。鹅掌草皂苷在制备抗癌剂中的应用，鹅掌草皂苷及取代基R1、R2不同的皂苷类化合物与固体或液体形式的剂型赋形剂一起制备抗癌剂，抗癌剂中的鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物成人口服剂量为1－50mg/60kg体重，每天一次或几次，较佳为3－15mg/天/60kg体重。剂型有口服剂型、注射剂、局部给药剂型。试验证明鹅掌草皂苷中R1、R2取代基不同的皂苷类化合物具有抗肿瘤作用，包括抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡及提高肿瘤细胞中Caspase－3表达作用，所制备的抗癌剂制剂的稳定性合格。
文档编号A61K9/02GK101028277SQ200710051898
公开日2007年9月5日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者韩林涛, 黄俊英, 郑启兵 申请人:韩林涛, 黄俊英, 郑启兵