专利名称：融合多肽及其在肿瘤与细胞生长异常相关的疾病治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种至少包括两个多肽的融合多肽，一个多肽为抑制细胞生长的多肽，另一个多肽为能穿过细胞膜的多肽片段。这两个多肽可以通过化学共价健直接连接或在细胞中表达成融合多肽。同时，本发明还涉及这一融合多肽在大肠杆菌中的表达和纯化过程、在制备抗肿瘤药物中的用途以及在肿瘤及其它增殖性疾病治疗中的应用，属于医学生物工程领域。
背景技术：
肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病，目前其死亡率在国内已成为仅次于心脑血管疾病的第二位致死病因。临床中主要应用化疗、放疗及手术治疗，这些方法形成了比较成熟的治疗体系，取得了较好的效果。然而，由于这些方法选择性低，难以避免毒副作用强、正常细胞和肿瘤之间治疗窗口小等缺点，因此亟待研发新的有效治疗方法。
近来肿瘤细胞生物学的快速发展，为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中，随着细胞的信号转导途径(Signaling transductionpathways)的阐明，发现了越来越多可用作治疗肿瘤的药靶。有一些已经成功的应用于临床，取得了非常好的效果。比如在许多乳腺癌细胞中ErbB2(一种能促进蛋白磷酸化的上皮生长因子受体)过度表达，并且其蛋白激酶活性也增强，应用一种特异性针对这一蛋白单克隆抗体能有效的抑制ErbB2蛋白激酶活性，阻断这一蛋白介导的信号转导。这一抗体目前已进入临床使用。
细胞生长的信号由细胞内外促进生长的因子经过一系列蛋白参与传递到细胞核，引起细胞周期的许多调节蛋白结构和功能变化而导致细胞分裂。在这些调节细胞生长周期的蛋白中，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一个具有脂磷酸化激酶和蛋白磷酸化激酶活性的酶蛋白，其激酶活性受到许多信号传递分子的影响。由于磷脂酰肌醇-3-激酶在细胞生长调节中的极重要的作用，这一蛋白是目前研究开发治疗肿瘤新药的重要靶标之一。至今为止，已发现多个磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的抑制剂，但由于磷脂酰肌醇-3-激酶的酶活性也是体内一些重要生理功能所必需的(比如胰岛素调节人体内血糖和其它物质和能量代谢过程)，而这些抑制剂在抑制磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的同时，往往也阻断了这些生理功能，具有很强的毒性，所以在治疗疾病中的应用受到较大限制。
2003年，我们发现了细胞生长周期的调节蛋白 视神经母细胞瘤蛋白(Rb)和磷脂酰肌醇-3-激酶的一个调节亚基的相互作用。磷脂酰肌醇-3-激酶由调节亚基和催化亚基组成，催化亚基催化某些脂类及蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的活性是磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白的核心效应组成部分，然而，催化亚基的活性受调节亚基的调控，调控通过以下两个机制实现(1)催化亚基的活性本身受调节亚基影响；(2)调节亚基通过和其他蛋白的相互作用把催化亚基定位于目标蛋白。我们研究发现，视神经母细胞瘤蛋白和磷脂酰肌醇-3-激酶的相互作用是由磷脂酰肌醇-3-激酶中的55千道尔顿的调节亚基(p55PIK)中氨基端1-25号氨基酸(序列为甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)参与的，该多肽片段被称为视神经母细胞瘤蛋白结合功能区(以下称为N25)，它把磷脂酰肌醇-3-激酶和视神经母细胞瘤蛋白相互连接在一起，磷脂酰肌醇-3-激酶的蛋白激酶活性导致了视神经母细胞瘤蛋白的磷酸化，从而引起了细胞分裂。我们进一步的实验结果证明在细胞中表达p55PIK中N25的多肽，这一多肽能有效地结合于视神经母细胞瘤蛋白，竞争性抑制细胞内磷脂酰肌醇-3-激酶和视神经母细胞瘤蛋白的结合，由于这个多肽不具有任何磷酸化蛋白激酶活性，所以多肽结合视神经母细胞瘤蛋白将抑制视神经母细胞瘤蛋白的磷酸化过程，保持视神经母细胞瘤蛋白抑制细胞生长的功能，从而阻止肿瘤细胞分裂。
除视神经母细胞瘤蛋白外，我们新的的实验结果也证实N25多肽在细胞内还能阻止p55PIK和其他细胞周期调节分子的结合，也能有效地抑制细胞的分裂过程。
虽然试验结果证明在细胞中表达的N25多肽能有效抑制细胞生长，但由于N25多肽自身不能穿过细胞膜，导致直接应用N25多肽作为药物的疗效并不理想，另外采用化学合成N25多肽的成本较高，所以N25多肽药物的临床应用受到了一定的限制。
发明内容
本发明的目的提供一种融合多肽，该融合多肽包括抑制细胞生长的多肽和穿透细胞膜的多肽或分子，穿透细胞膜的多肽或分子将抑制细胞生长的多肽带入细胞中，经过实验证明了这一融合多肽具有抑制细胞生长的能力，此外，该融合多肽也能有效地抑制多种肿瘤动物体内生长模型中的肿瘤生长。
融合多肽包括抑制细胞生长的多肽和穿透细胞膜的多肽或分子，抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽或分子通过化学共价健连接，或抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽在细胞中表达成融合多肽。
融合多肽的抑制细胞生长的多肽与纯化融合多肽的标签蛋白连接。
抑制细胞生长的多肽是由磷脂酰肌醇-3-激酶的调节亚基p55PIK中氨基端25个氨基酸残基组成的多肽，其序列为甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸(MDRDDADWREVMMPYSTELIFYIEM)，或是从该多肽氨基端连续或间断地缺失或取代1-12中任意数值个氨基酸残基得到的多肽之一，或是将所述多肽的序列经过一个或几个氨基酸残基的添加得到的具有抑制细胞生长活性的多肽之一。
穿透细胞膜的多肽是衍生于HIV病毒tat蛋白的多肽，其序列为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸(YGRKKRRQRRR)。
用于纯化融合多肽的标签蛋白是寡聚组氨酸标签，其中组氨酸数目为5-10中的任意数值个。
所述的融合多肽相应的核酸编码序列。
所述的融合或融合多肽相应的核酸编码序列多肽在治疗结肠癌、食管癌、胃癌、胃肠道肿瘤、耳鼻喉及头颈部肿瘤、肺癌、肝癌、肉瘤、内分泌活化肿瘤、白血病、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、前列腺癌和泌尿生殖器官肿瘤及细胞生长异常有关的疾病中治疗的用途。
大量实验证实，自然界中存在一些具有穿透细胞膜能力的蛋白。在这些蛋白中的一些片段是蛋白穿过细胞膜必需的，被称为蛋白(多肽)传导功能区(protein/peptide transduction domain)或细胞穿透多肽(cell-penetrating peptides)，人类免疫缺陷病毒(HIV)中的tat蛋白便是具备这种能力的蛋白之一，其穿透细胞膜的功能区是tat蛋白中的一个多肽片段，序列为YGRKKRRQRRR。该片段能把其它自身不能穿透细胞膜的生物大分子带进细胞。在大肠杆菌中把编码相应多肽的核糖核酸片断转化进去后，能够有效地表达重组蛋白。如果在重组蛋白中加入能帮助亲合纯化重组蛋白的标签，将极大地提高多肽产量，降低生产成本。由6个组氨酸组成的多肽(6xHis)是常用的帮助亲合纯化重组蛋白的标签之一，该标签能有效结合镍离子或铜离子，这种结合很稳定，所以采用结合有镍离子或铜离子的琼脂糖凝胶颗粒能有效地结合含有6xHis标签的重组蛋白。
为了提高N25多肽抑制细胞生长的效率，本发明利用分子生物学技术，将N25多肽和一种具有穿过细胞膜作用的HIV病毒tat蛋白中相应的功能区及一种能特异性结合镍或铜离子的寡聚组氨酸标签(6xHis)三个不同功能的多肽连接起来，构建了一种易于生产纯化、且能够穿透细胞膜发挥生物学功能的融合多肽。
我们在几种不同的具有生长分裂能力的培养人类和老鼠肿瘤细胞系中加入包括N25和穿膜多肽的融合蛋白，这些细胞的DNA合成及其他几个证明细胞生长的观察指标都显著降低，证明了这一融合多肽具有抑制细胞生长的能力。此外，该融合多肽也能有效地抑制多种肿瘤动物体内生长模型中的肿瘤生长。
与现有抑制细胞生长的方法相比，本发明有以下特点(1)N25与tat蛋白中的透膜功能区组成的融合多肽能有效地抑制肿瘤生长，证明N25多肽在穿透细胞膜后仍具有抑制细胞生长的生物学效应，也说明除tat蛋白的穿膜功能片段外，其它有类似穿膜功能的多肽或分子也可能用于帮助具有生物学活性N25穿透细胞膜。
(2)N25多肽的序列存在于人类细胞的蛋白质序列中，毒副作用低，抗原性弱，实验结果也表明其对细胞凋亡或死亡没有明显影响，对正常细胞没有明显的杀伤作用。由N25、tat蛋白的穿膜功能多肽和寡聚组氨酸组成的融合多肽加入培养细胞和应用于动物体内，也没有观察到明显的毒性。
(3)融合多肽能有效抑制多种人类和鼠类肿瘤细胞在体内和体外培养系统中的生长，证明该融合多肽在肿瘤等细胞生长异常疾病的治疗方面具有高效、广谱等优点。
(4)利用大肠杆菌表达融合多肽并采用亲合纯化融合蛋白，不仅简化了生产过程，提高了生产效率，而且降低了生产成本，便于大规模生产并直接应用于临床。
图1纯化后的融合多肽。按实施实例2所述的工艺流程，采用螯合有镍离子的琼脂糖凝胶颗粒，结合大肠杆菌表达出来的融合多肽；加入咪唑洗脱、离心、收集上清液得到融和多肽；取5微升洗脱液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果表明，镍离子的琼脂糖凝胶颗粒能够特异性结合6xHis标签并有效地纯化含有这一标签的融合多肽，纯化后融合多肽的纯度可达90％以上。
具体实施例方式
例1在质粒中引入编码寡聚组氨酸标签(6xHis)，TAT穿膜功能区和p55PIK N25组成的融合多肽的cDNA序列。
含有编码寡聚组氨酸标签(6xHis)，TAT穿膜功能区cDNA序列的质粒由美国芝加哥的卢世江博士惠赠。质粒用EcoRI-BamHI(购于美国Promega公司)酶切质粒，酶切后的质粒在琼脂糖胶中分离、纯化，用于以后的连接反应。从胶中回收DNA片段的试剂盒来自德国Qiagen公司(产品目录号为28704)。编码小鼠p55PIK全长蛋白的cDNA来源于小鼠睾丸组织cDNA文库(美国Stratagene公司，目录号为937308)，克隆到pcDNA3(购于Invitrogen公司，目录号为V79020)，用于扩增N25 cDNA的PCR引物序列为引物1TTTTTGGTACCATGGACCGCGATGACGCAGAC引物2TTTTTGAATTCTCAAGGATCCATTTCAATATAAAAPCR条件94℃2分钟；94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟共25个循环；72℃延伸5分钟。
PCR试剂盒来自美国Promega公司(目录号为M1861)，PCR产物经过纯化后(纯化用的试剂盒来自德国Qiagen公司，产品目录号为28704)，用EcoRI-BamHI酶切；再用琼脂糖胶纯化，然后和酶切纯化后的载体进行连接反应(连接试剂盒来自美国Promega公司，目录号为M1801)。转化细菌后(感受态细菌来自美国Promega公司，目录号为L2001)，克隆用常规菌落PCR进行筛选。选出阳性克隆，其cDNA序列的正确性通过核酸序列测定得到证实后，大规模纯化制备质粒(大规模纯化试剂盒来自美国Promega公司，目录号为A7270)，用于以后的实验。这种质粒含有在细菌中受IPTG诱导表达重组蛋白的操纵子，把质粒转移到BL21细菌中(美国Novagen公司，目录号为A7270)后，即可表达一个6xHis标签，TAT穿膜功能区和N25的融合蛋白。该蛋白称为TAT-N25。
例2融合多肽TAT-N25的实验室生产流程及纯化工艺。
用含有表达融合多肽质粒的BL21大肠杆菌细胞培养后，在实验室开始表达纯化TAT-N25融合多肽，具体流程如下(1)、在超净工作台上接种50微升菌种于100毫升的浓度为100微克/毫升含氨苄青霉素的LB细菌培养基中，然后在37℃摇床上以220转/分钟的速度进行培养过夜；(2)、加入700毫升含氨苄青霉素的培养基继续培养2小时；(3)、加入300微升浓度0.2毫摩尔/升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细菌表达融合多肽，培养至次日上午(16小时)；(4)、离心收集细菌，离心是在转速为3600转/分钟、4℃的条件下离心5分钟，倒去上清液，然后先加入20毫升6摩尔/升的尿素到收集的细菌，并将细菌抽提液转移倒50毫升离心管中；(5)、在超声波细胞破碎仪上超声破碎细菌，超声波细胞破碎仪功率300瓦，工作3秒，间隔3秒、冰浴条件下，破碎6分钟，细菌破碎后在摇床上混匀1小时；(6)、离心分离上清液，离心是在转速为10000转/分钟、4℃的条件下离心15分钟，将上清液转移到另一支50毫升离心管中；(7)、在上清液中加入600微升螯合有镍离子的琼脂糖凝胶颗粒，该螯合有镍离子的琼脂糖凝胶颗粒由美国Promega公司提供，混匀并在摇床上混合2小时，然后在3600转/分钟、4℃条件下离心5分钟，除去上清液将琼脂糖凝胶颗粒转移到1.5毫升离心管中；(8)、加入1毫升6摩尔/升的尿素于1.5毫升离心管中在5000转/分钟、常温条件下离心1分钟来离心清洗琼脂糖凝胶颗粒，重复3遍；(9)、加入浓度为200毫摩尔/升咪唑洗脱多肽，在摇床上混匀1小时，然后在5000转/分钟、室温条件下离心1分钟，收集合有洗脱的融和多肽上清液，重复2次；(10)、浓缩纯化将多肽转入截流分子量为3500道尔顿的透析袋，再于6摩尔/升的尿素中透析纯化；(11)、取5微升洗脱液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳检测，提取的多肽保存于冰箱4℃保存。
例3TAT-N25融合多肽影响细胞生长及细胞周期的实验。
用人宫颈癌细胞系，购自美国ATCC，目录号为HTB-22的Hela细胞检测TAT-N25融合多肽对细胞生长的影响。Hela细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5％CO2/95％空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿，将细胞培养至对数生长期后，加入浓度为15微克/毫升多肽，同时培养空白组和尿素组用以对照，培养24小时收取细胞，利用流式细胞仪分析分析这些细胞的细胞周期分布。6M尿素指的是每升水中含有6摩尔尿素，以下都简称为6M尿素。实验结果表明在这一剂量下表达TAT-N25融合多肽对细胞凋亡没有明显影响，增加G0/G1期细胞数，其作用见下表1。
表1TAT-N25对细胞周期的影响
DNA合成是细胞增殖的标志。下一个实验中，我们检测TAT-N25对细胞DNA合成的影响。因为BrdU为胸腺嘧啶类似物，在DNA合成的S期可掺入到DNA中，掺入到DNA的BrdU经过免疫染色后，利用流式细胞仪通过检测荧光强度的变化来分析DNA的合成情况，空白组和尿素组用以对照。结果显示加入TAT-N25多肽后，肿瘤细胞中有DNA合成的S期的细胞数目变化不大，但平均BrdU的掺入量较空白组有明显减小，见表2，这说明融合多肽抑制了DNA的合成，减少了肿瘤细胞的增殖。
表2TAT-N25抑制细胞DNA合成
例4TAT-N25融合多肽抑制小鼠体内腹水瘤生长的实验在小鼠的腹膜内注射鼠恶性肉瘤S180细胞后，将小鼠随机分成三组。注射肿瘤细胞一天之后，向组中的小鼠分别注射0.1毫升的TAT-N25，也就是将2.5毫克TAT-N25溶于6M的尿素中，隔天注射重复三次。两个对照组分别注射0.1毫升生理盐水或6M的尿素，注射次数和时间同多肽试验组。注射肿瘤十天后杀死小鼠并从其腹膜腔内取出腹水进行体积测量和BrdU掺入到DNA的检测。结果显示，与对照组相比，加入TAT-N25治疗的小鼠体内的腹水减少了85％。与之对应，细胞DNA合成也明显减少。见表3。
表3 TAT-N25融合多肽抑制小鼠体内腹水瘤S180的生长
氨基酸和核苷酸序列表<110>夏献民<120>融合多肽及其在肿瘤与细胞生长异常相关的疾病治疗中的用途<160>6<210>1<211>25<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<400>1Met Asp Arg Asp Asp Ala Asp Trp Arg Glu Val Met Met Pro Tyr1 5 10 15Ser Thr Glu Leu Ile Phe Tyr Ile Glu Met20 25<210>2<211>75<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(75)<400>2
ATG GAC CGC GAT GAC GCA GAC TGG AGG GAG 30Met Asp Arg Asp Asp Ala Asp Trp Arg Glu1 5 10GTG ATG ATG CCC TAT TCG ACA GAA CTG ATA 60Val Met Met Pro Tyr Ser Thr Glu Leu Ile15 20TTT TAT ATT GAA ATG 75Phe Tyr Ile Glu Met25<210>3<211>11<212>PRT<213>人类免疫缺陷病毒(HIV)<220>
<400>1Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 510<210>4<211>33<212>DNA<213>人类免疫缺陷病毒(HIV)<220>
<221>CDS<222>(1)...(33)<400>2
TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC 30Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg1 510CGC 33Arg<210>5<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<400>1His His His His His His1 5<210>6<211>18<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(18)<400>2CAT CAT CAT CAT CAT CAT 18His His His His His His1 权利要求
1.融合多肽，包括抑制细胞生长的多肽和穿透细胞膜的多肽或分子，抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽或分子通过化学共价健连接，或抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽在细胞中表达成融合多肽。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于融合多肽的抑制细胞生长的多肽与纯化融合多肽的标签蛋白连接。
3.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于抑制细胞生长的多肽是由磷脂酰肌醇-3-激酶的调节亚基p55PIK中氨基端25个氨基酸残基组成的多肽，其序列为甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸(MDRDDADWREVMMPYSTELIFYIEM)，或是从该多肽氨基端连续或间断地缺失或取代1-12中任意数值个氨基酸残基得到的多肽之一，或是将所述多肽的序列经过一个或几个氨基酸残基的添加得到的具有抑制细胞生长活性的多肽之一。
4.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于穿透细胞膜的多肽是衍生于HIV病毒tat蛋白的多肽，其序列为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸(YGRKKRRQRRR)。
5.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于用于纯化融合多肽的标签蛋白是寡聚组氨酸标签，其中组氨酸数目为5-10中的任意数值个。
6.根据权利要求1或2所述的融合多肽相应的核酸编码序列。
7.根据权利要求1或2所述的融合多肽在治疗结肠癌、食管癌、胃癌、胃肠道肿瘤、耳鼻喉及头颈部肿瘤、肺癌、肝癌、肉瘤、内分泌活化肿瘤、白血病、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、前列腺癌和泌尿生殖器官肿瘤及细胞生长异常有关的疾病中治疗的用途。
8.根据权利要求6所述的融合多肽相应的核酸编码序列在治疗结肠癌、食管癌、胃癌、胃肠道肿瘤、耳鼻喉及头颈部肿瘤、肺癌、肝癌、肉瘤、内分泌活化肿瘤、白血病、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、前列腺癌和泌尿生殖器官肿瘤及细胞生长异常有关的疾病中治疗的用途。
全文摘要
本发明公开一种融合多肽，包括抑制细胞生长的多肽和穿透细胞膜的多肽，抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽通过化学共价健连接或通过基因工程技术在细菌或其他宿主细胞中表达。本发明还提供了融合多肽的构建方法、生产工艺和流程、以及该多肽在治疗多种疾病特别是各种肿瘤疾病中的具体作用。
文档编号A61K38/08GK101016340SQ20071005128
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月18日 优先权日2007年1月18日
发明者夏献民, 程艾武, 胡俊波, 严保罗 申请人:夏献民