专利名称：人l型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体及构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物感染免疫。在国内外首次涉及利用分子生物学技术克隆并制备一种能在体内增强宿主抗胞内菌感染，如伤寒沙门氏菌鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)，并刺激γ-干扰素产生的新型的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白(L-ficolin)cDNA的真核质粒表达载体，其可作为一种新型人体自身的免疫制剂，能增强固有免疫能力。
背景技术：
补体系统是机体固有免疫的重要组成成分。目前所知补体系统可通过三种途径激活经典激活途径，替代激活途径，凝集素激活途径即MBL/ficolin激活途径。在机体抗感染的过程中，人甘露糖凝集素(human mannose-binding lectin，MBL)和补体凝集素纤维胶凝蛋白(ficolin)蛋白参与了对病原微生物的识别，它们可以识别病原微生物表面保守的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)，并进而与MBL相关丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases，MASPs)结合而启动补体凝集素激活途径(Fujita，T.，M.Matsushita，and Y.Endo.2004.The lectin-complement pathway-its role in innateimmunity and evolution.Immunol.Rev.198185-202)。
目前，已发现了三种类型的人类ficolin蛋白分子，分别是人L-ficolin(又称L-ficolin/P35或FCN2)，M-ficolin(又称FCN1)，以及H-ficolin/Hakata抗原(又称FCN3)。这三种人类ficolin蛋白分子均可识别病原微生物的PAMPs，激活补体发挥生物学效应。目前所知，ficolin蛋白分子可以识别细菌和真菌，它们识别的配体类型包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、脂多糖(lipopolysaccharide)、脂膜酸(lipoteichoic acid)。
ficolin蛋白分子含有两个结构区域，它们分别是纤维蛋白原样区和胶原样区。在补体的凝集素激活途径中，ficolin蛋白分子通过纤维蛋白原样区识别病原微生物并通过胶原样区结合MASPs蛋白。
L-ficolin蛋白分子是由分子量为35-kDa的亚单位构成的多聚蛋白分子，其结构与MBL分子类似，首先3个35-kDa的亚单位构成三聚体的结构，然后4个3聚体彼此连接构成一个完整的L-ficolin蛋白分子。在人体内，L-ficolin蛋白分子可与三种类型的MASPs结合即MASP-1，MASP-2和MASP-3；此外L-ficolin蛋白分子还可与小分子MBL相关丝氨酸蛋白酶(small MBL-associated protein，sMAP)结合。L-ficolin蛋白分子与MASPs或sMAP的结合启动补体凝集素途径或者介导了吞噬细胞的调理吞噬作用。L-ficolin蛋白分子对1，3-β-D葡聚糖，N-乙酰葡糖胺以及多种乙酰化的分子均有凝集素样的活性；但L-ficolin蛋白分子与MBL分子不同，它不结合甘露糖。近来的研究表明，L-ficolin蛋白分子可在体外特异性结合临床常见的一些重要的病原菌，比如说鼠伤寒杆菌、肺炎链球菌以及金黄色葡萄球菌。
但是目前L-ficolin蛋白在体内功能还不清楚。在国内外L-ficolin能否在体内抵抗胞内菌感染，并刺激γ-干扰素产生还未见报道。在国内L-ficolin的克隆和表达载体的构建也未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能在体内增强宿主抗胞内菌感染(如鼠伤寒杆菌感染)并刺激γ-干扰素产生的新型的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin的真核质粒表达载体的免疫制剂，以便制备L-ficolin蛋白分子，为阐明机体固有免疫系统在抗感染中发挥的作用提供帮助，为临床感染性疾病的治疗(尤其是沙门氏菌感染的治疗)提供新的解决途径，并提供一种新型人的免疫制剂，增强固有免疫能力。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案本发明提供的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的939个碱基。
本发明提供的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，其构建的步骤包括(1)真核质粒表达载体的构建根据GenBank Acc.NoD49353，通过PCR扩增，获得人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的cDNA(Endo，Y.，Y.Sato，M.Matsushita，and T.Fujita.1996.Cloning andcharacterization of the human lectin P35 gene and its related gene.Genomics 36515-521)，获得的PCR产物用DNA限制性内切酶EcoR I和HindIII消化后连于真核表达质粒pCDNA3.1(-)/Myc-His A上；其中PCR所用的引物序列为上游引物p1(5′-TGGAATTCATGGAGCTGGACAGAG-3′)和下游引物p2(5′-ATAAGCTTGGCAGGTCGCACCTTCA-3′)；在引物序列中划线的部分为EcoRI和HindIII的酶切位点。
(2)真核质粒表达载体阳性克隆的筛选和鉴定将已连接了人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的编码基因的真核表达质粒转化到大肠杆菌DH5α中，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落，提取质粒；用DNA限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切提取质粒进行初步鉴定，酶切结果正确的质粒进行DNA测序，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明提供的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，可应用于人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的制备；可应用于制备用于人体自身的免疫制剂药物；还可应用于制备临床药物来治疗感染性疾病，例如制备抗沙门氏菌感染的药物。
本发明获得了人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin真核质粒表达载体，该载体能在体内增强宿主抗胞内菌如鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)感染并刺激γ-干扰素的产生。因此与现有技术相比，具有以下的主要优点其一.获得了人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin的基因，并将该基因克隆到了真核表达载体上。由于L-ficolin在补体系统以及固有免疫中发挥着重要的作用，L-ficolin真核质粒表达载体的构建将为阐明机体固有免疫系统在抗感染中发挥的作用提供帮助，也为临床上感染性疾病的治疗提供了新的思路。
其二.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin真核质粒表达载体具有抗胞内菌(如鼠伤寒杆菌)的作用。如图1、图2和图3所示，转染了L-ficolin真核质粒表达载体的STO细胞或CT26细胞以及用电转仪注射了L-ficolin真核质粒的小鼠肌肉和脾脏组织中均可检测到L-ficolin蛋白的表达。用L-ficolin真核质粒表达载体处理鼠伤寒杆菌感染小鼠，小鼠的生存时间明显延长。如图4所见，当感染了致死剂量的鼠伤寒杆菌20天后，L-ficolin真核质粒表达载体处理的小鼠生存率最高约有40％的小鼠存活下来，说明该载体能在体内增强宿主抗胞内菌鼠伤寒杆菌的感染。并且用亚致死剂量的鼠伤寒杆菌感染小鼠后，用L-ficolin真核质粒表达载体处理的小鼠其脏器(脾脏和肝脏)内感染的细菌数量显著小于其它的处理组(见表1和表2)。表1中的数据是用Student’s tests统计方法进行分析，将L-ficolin真核质粒表达载体处理组与生理盐水对照组和空载质粒对照组进行比较*p＜0.05。表2中的数据是用Student’s tests统计方法进行分析，将L-ficolin真核质粒表达载体处理组与生理盐水对照组和空载质粒对照组进行比较*p＜0.05。
其三.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin真核质粒表达载体在抗胞内菌(如鼠伤寒杆菌)的同时，也刺激了γ-干扰素的产生。γ-干扰素在宿主抗胞内菌，以及抗病毒的过程中，均发挥着十分重要的作用。因而有理由认为人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin真核质粒表达载体，是颇具潜力的抗胞内菌感染甚至抗病毒感染的生物制剂。此外，该质粒已转化到大肠杆菌DH5α中，可直接用该菌株进行大规模生产制备。如图5所示，感染后第7天用L-ficolin真核质粒表达载体处理的小鼠脾脏中γ-干扰素分泌水平显著高于生理盐水对照组和空载质粒对照组。
图1和图2分别显示Western blot分析L-ficolin蛋白分子在注射质粒小鼠的肌肉和脾脏的表达。其中第1、2和3泳道分别为质粒注射第4、7和10天后相应组织内L-ficolin蛋白分子的表达；第4泳道为pcDNA3.1空载质粒对照组。
图3显示CT26转染细胞上L-ficolin蛋白分子的表达。其中第1泳道为pcDNA3.1空载质粒对照组，第2泳道为转染L-ficolin真核质粒表达载体的STO细胞或CT26细胞中L-ficolin蛋白分子的表达。
图4显示用不同方法处理鼠伤寒杆菌感染小鼠后的生存时间比较曲线。由图可见，用L-ficolin真核质粒表达载体处理鼠伤寒杆菌感染小鼠，小鼠的生存时间明显延长。其中L-ficolin真核质粒表达载体注射组与pcDNA3.1空载质粒对照组，以及生理盐水对照组相比具有显著统计学意义，*p＜0.05。
图5为γ-干扰素在L-ficolin真核质粒表达载体处理的鼠伤寒杆菌小鼠的脾脏细胞中的分泌情况。
具体实施例方式
一.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体的序列能在体内增强宿主抗胞内菌伤寒杆菌感染并刺激γ-干扰素产生的新型的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白L-ficolin真核质粒表达载体，其克隆在真核质粒表达载体上的L-ficolin编码基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。请见下述文章末尾的序列表，该序列含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的939个碱基。
二.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体的构建采用以下步骤，包括(1)真核质粒表达载体的构建根据GenBank Acc.NoD49353，将人L-ficolin蛋白分子的全长cDNA(包含有分泌信号(signal peptide)的编码基因)进行PCR扩增，获得的PCR产物用DNA限制性内切酶EcoR I和HindIII消化后连于真核表达质粒pCDNA3.1(-)/Myc-His A(购于美国Invitrogen公司)上。其中，PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分别具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，即上游引物p15′-TGGAATTCATGGAGCTGGACAGAG-3′下游引物p25′-ATAAGCTTGGCAGGTCGCACCTTCA-3′上述引物序列中划线的部分为EcoRI和HindIII的酶切位点。
(2)真核质粒表达载体阳性克隆的筛选和鉴定将已连接了L-ficolin编码基因的真核表达质粒转化到大肠杆菌DH5α中，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落，提取质粒。
用DNA限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切提取质粒进行初步鉴定，酶切结果正确的质粒进行DNA测序。其中DNA测序结果显示，克隆在真核质粒表达载体上的L-ficolin编码基因序列为939个碱基。
三.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达、制备和应用1.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达和制备；利用L-ficolin的真核质粒表达载体制备L-ficolin分子的方法是(1)在L-ficolin的真核质粒表达载体转染前24小时，将1×106个小鼠胚成纤维细胞STO(中国典型培养物保藏中心CCTCC GDC013)或结肠癌细胞CT26置于60mm的培养板孔中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5％CO2环境中培养；(2)用lipofectamineTM2000(购于美国Invitrogen)转染试剂转染L-ficolin的真核质粒表达载体到STO细胞或CT26细胞中，每一个60mm的培养板孔中转染8μg的质粒；(3)将转染细胞培养48小时后，收获细胞并将细胞重悬于细胞裂解液中，37℃温育30分钟。
细胞裂解液配方为磷酸盐缓冲液中含有50mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，0.02％NaN3，0.5％NP-40，1％Triton X-100，1μg/ml胰蛋白酶抑制剂，100μg/ml苯甲基磺酰氟化物。
上述细胞裂解液中即含有L-ficolin蛋白分子(见图3)，可进一步纯化，也可直接进行SDS-PAGE分析和Western blot分析(见下述内容)。
(4)Western blot分析将上述的细胞裂解液直接进行12％SDS-PAGE电泳，使裂解液中的蛋白在电泳的聚丙稀酰氨凝胶上分离开。电泳完毕后，将凝胶中的蛋白电转印到硝酸纤维滤膜上，加入质量体积比浓度10％的脱脂奶粉进行封闭。随后将抗L-ficolin蛋白的兔血清(由Teizo Fujita教授馈赠)用含3％胎牛血清的TBST缓冲液稀释100倍后，加到已封闭的硝酸纤维滤膜上，室温下反应1小时。将硝酸纤维滤膜取出，并反复洗涤，然后加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗，最后用四唑氮蓝(Nitroblue-tetrazolium)和磷酸溴氯哚吲(Bromo-chloro-indolyl-phosphate)显色。
2.利用人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体注射入动物体内，使人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白在注射的动物体内表达，具体方法是用电转仪注射人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒到BALB/c小鼠(购于武汉大学实验动物中心)肌肉第4、7、10天后，小鼠肌肉和脾脏组织中均可检测到纤维胶凝蛋白的表达(见图2和图3)。
3.L-ficolin质粒真核表达载体在抵抗小鼠体内伤寒感染中的应用。
(1)分别用生理盐水(阴性对照组)、pcDNA3.1空载质粒(购于美国Invitrogen公司)和L-ficolin的真核质粒表达载体(pcDNA3.1-L-ficolin)处理小鼠，并检测小鼠肌肉和脾脏中L-ficolin蛋白的表达。其处理方法如下用100μl生理盐水或100μl含有100μg DNA质粒(pcDNA3.1空载质粒或pcDNA3.1-L-ficolin)的生理盐水与25μl普鲁卡因溶液混合，随后用电转仪基因枪注射到小鼠的左腿大腿肌处。在注射后的第4、7、10天分别取出小鼠的左腿大腿肌和脾脏，并用组织裂解液研磨脏器，将研磨液上清按步骤1中的(4)做Western blot分析。
(2)将18-22g的雌性BALB/C随机分为两组，分别为组1和组2，并通过灌胃感染鼠伤寒杆菌S.typhimurium C5(该菌株由本实验室保存，并见发表的文章Xiao-Lian Zhang(章晓联)，Christina Morris，Jim Hackett.Molecular cloning，nucleotide sequence，andfunction of a site-specifc recombinase encoded in the major‘pathogenicity island’ofSalmonella typhi，Gene 1997，202139-146.)。组1每只小鼠感染浓度为5×106CFU/ml致死剂量的S.typhimurium C5菌液0.2ml，组2每只小鼠感染浓度为5×105CFU/ml亚致死剂量的S.typhimurium C5菌液0.2ml。在以上感染的小鼠中，每一组又进一步划分为3个小组，感染当天，分别用生理盐水(阴性对照组)、pcDNA3.1空载质粒和L-ficolin的真核质粒表达载体(pcDNA3.1-L-ficolin)处理感染小鼠，其处理方法如下用100μl生理盐水或100μl含有100μg DNA质粒(pcDNA3.1空载质粒或pcDNA3.1-L-ficolin)的生理盐水与25μl普鲁卡因溶液混合，随后用电转仪基因枪注射到小鼠的左腿大腿肌处；随后，观察组1小鼠的生存情况，组2小鼠的脏器感染以及细胞因子分泌情况。
(3)感染器官中鼠伤寒杆菌的计数。将感染剂量为5×105CFU/ml S.typhimurium C5的组2小鼠，分别于感染后第4、7和10天处死，并将小鼠的脾和肝脏取出称重，每0.1g脾或肝脏中加入1ml生理盐水研磨脏器。研磨后，将研磨液离心，取100μl研磨液上清，加入固体琼脂培养基上，37℃培养过夜。剩下的研磨液上清液存于-80℃以检测细胞因子分泌情况。
(4)感染小鼠细胞因子分泌的检测。用eBIOSCIENCE公司的ELISA试剂盒直接检测步骤(3)中研磨液上清中IFN-γ细胞因子的分泌水平。IFN-γ细胞因子在研磨液上清液中的含量最后通过检测样品450nm处的吸光度并参照标准曲线计算得到。
附表表1.感染小鼠脾脏中鼠伤寒杆菌S.typhimurium C5的培养计数(CFU/ml)
表2.感染小鼠肝脏中鼠伤寒杆菌S.typhimurium C5的培养计数(CFU/ml)
<110>武汉大学<120>人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体及构建和应用<140>
<141>
<160>1<170>
<210>1<211>939<212>DNA<213>人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白(L-ficolin)<220>
<221>CDS<222>(1)...(939)<223>
<400>11 atggagctgg acagagctgt gggggtcctg ggcgctgcca ccctgctgct ctctttcctg61ggcatggcct gggctctcca ggcggcagac acctgtccag aggtgaagat ggtgggcctg121 gagggctctg acaagctcac cattctccga ggctgtccgg ggctgcctgg ggcccctggc181 gacaagggag aggcaggcac caatggaaag agaggagaac gtggcccccc tggacctcct241 gggaaggcag gaccacctgg gcccaacgga gcacctgggg agccccagcc gtgcctgaca301 ggcccgcgta cctgcaagga cctgctagac cgagggcact tcctgagcgg ctggcacacc361 atctacctgc ccgactgccg gcccctgact gtgctctgtg acatggacac ggacggaggg421 ggctggaccg ttttccagcg gagggtggat ggctctgtgg acttctaccg ggactgggcc481 acgtacaagc agggcttcgg cagtcggctg ggggagttctggctggggaa tgacaacatc541 cacgccctga ccgcccaggg aaccagcgag ctccgtgtag acctggtgga ctttgaggac601 aactaccagt ttgctaagta cagatcattc aaggtggccg acgaggcgga gaagtacaat661 ctggtcctgg gggccttcgt ggagggcagt gcgggagatt ccctgacgtt ccacaacaac721 cagtccttct ccaccaaaga ccaggacaat gatcttaaca ccggaaattg tgctgtgatg781 tttcagggag cttggtggta caaaaactgc catgtgtcaa acctgaatgg tcgctacctc841 agggggactc atggcagctt tgcaaatggc atcaactgga agtcggggaa aggatacaat901 tatagctaca aggtgtcaga gatgaaggtg cgacctgcc
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<221>
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<221>
<222>(1)...(25)<223>PCR下游引物(p2)<400>31 ataagcttgg caggtcgcac cttca
权利要求
1.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的939个碱基。
2.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体的构建，其特征是采用以下步骤，包括(1)真核质粒表达载体的构建根据GenBank Acc.NoD49353，通过PCR扩增，获得人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的cDNA，获得的PCR产物用DNA限制性内切酶EcoRI和HindIII消化后连于真核表达质粒pCDNA3.1(-)/Myc-His A上，其中，PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分别具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，即上游引物p15′-TGGAATTCATGGAGCTGGACAGAG-3′下游引物p25′-ATAAGCTTGGCAGGTCGCACCTTCA-3′在引物序列中划线的部分为EcoRI和HindIII的酶切位点；(2)真核质粒表达载体阳性克隆的筛选和鉴定将已连接了人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白编码基因的真核表达质粒转化到大肠杆菌DH5α中，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落，提取质粒，用DNA限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切提取质粒进行初步鉴定，酶切结果正确的质粒进行DNA测序，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体在制备纤维胶凝蛋白分子中的应用，其特征是利用人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白真核表达载体和体外培养细胞制备人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子，方法是(1)在人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体转染前24小时，将1×106个小鼠成纤维细胞STO细胞或结肠癌细胞CT26置于60mm的培养板孔中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5％CO2环境中培养；(2)用lipofectamineTM2000(Invitrogen)转染试剂转染人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体到CT26细胞中，每一个60mm的培养板孔中转染8μg的质粒；(3)将转染细胞培养48小时后，收获细胞并将细胞重悬于细胞裂解液中，37℃温育30分钟，细胞裂解液中即含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子，细胞裂解液配方为磷酸盐缓冲液中含有50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.02％NaN3，0.5％NP-40，1％Triton X-100，1μg/ml胰蛋白酶抑制剂，100μg/ml苯甲基磺酰氟化物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是直接将人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体注射入动物体内，使人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白在注射的动物体内表达，具体方法是用电转仪注射人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒到小鼠肌肉第4、7、10天后，小鼠肌肉和脾脏组织中均可检测到纤维胶凝蛋白的表达。
5.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体在制备用于人体自身的免疫制剂药物中的应用。
6.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体在制备用于人体临床感染性疾病药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体用于沙门氏菌感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的939个碱基；其构建步骤包括真核质粒表达载体的构建、真核质粒表达载体阳性克隆的筛选和鉴定；其可应用于人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的制备，以及在制备用于人体自身的免疫制剂药物、人体临床感染性疾病药物中的应用。本发明提供的人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，为阐明机体固有免疫系统在抗感染中发挥的作用提供帮助，也为临床上感染性疾病的治疗提供了新的思路，并可作为一种新型人体自身的免疫制剂，能增强天然(固有)免疫能力。
文档编号A61P37/00GK101089186SQ20071005154
公开日2007年12月19日 申请日期2007年2月13日 优先权日2007年2月13日
发明者章晓联, 潘勤, 马运峰, 向田 申请人:武汉大学