专利名称：：甘草皂苷及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种甘草皂苷，同时，本发明还涉及一种甘草皂苷的制备方法及其在药品中的应用。
背景技术：
：甘草皂苷(glycyrrhizin，GL)是甘草中最主要的活性成分，自然界的甘草皂苷有两种立体异构体(18(1—甘草皂苷，化e—甘草皂苷)。18g—甘草皂苷通常称为甘草皂苷，18a—甘草皂苷通常称为异甘草皂苷。甘草中甘草皂苷类化合物以甘草皂苷为主，仅在甘草根茎中含有微量的异甘草皂苷。甘草皂苷具有多种药理活性，临床广泛用于抗炎和保肝解毒，目前市场上应用较多的是18P—甘草皂苷。经临床试验证实使用甘草皂苷注射液，可通过抑制磷脂酶A2的活性，阻断花生四烯酸在起始阶段的代谢水平，使得前列腺素、白三烯等炎性介质无法产生，起到抗炎和强力保护肝细胞膜的作用，还可以抑制核转录因子-一kB的结合活性，阻断各种炎性因子的生成，从而减少组织损伤等作用。甘草皂苷药理作用强，有抗炎、抗补体和免疫调节等作用，而且有毒性小、药效持久的优点。经药代动力学分析，无论通过静脉注射或口服给予甘草皂苷，甘草皂苷需在体内代谢成甘草次酸而发挥作用，这一转化过程依赖肠道正常菌群水解，缓慢进行。但18P—甘草皂苷极性大，在消化道吸收较差，体内生物转化缓慢，不能马上发挥疗效。为克服18e—甘草皂苷起效慢、体内生物转化缓慢、消化道吸收差等问题，开始着手研究180—甘草皂苷的立体异构体18a—甘草皂苷。经光谱分析，18ci一甘草皂苷和180—甘草皂苷之间结构差别仅为在C18位上的H构型不同，分别为反式和顺式。18ci—甘草皂苷的化学名为18ci，20P羧基一ll一氧化正齐墩果烷一12—烯一3e基一2—0—e—D—葡萄吡喃糖甘醛酸基一O—D—葡萄吡喃糖甘醛酸二铵盐，18P—甘草皂苷的化学名为183，羧基-11-氧化-正齐墩果烷-12-烯-3P-基2-0-0-D-葡萄吡喃糖醛酸基-a-D-葡萄吡喃苷醛酸单铵盐。从构象上分析表明18a—甘草皂苷的18a—H与C30上的羧基不在同一平面，而18e—甘草皂苷的H与其处在同一平面。由于位阻效应，18a一甘草皂苷的亲脂性大于18P—甘草皂苷，在体内更易于与受体蛋白结合，具有起效快的优点。且18ci—甘草皂苷结构中D/E环为反式构型，与泼尼松龙相似，易于与类固醇激素的靶细胞受体结合，故其抗炎作用远大于ise—甘草皂苷。虽然18a—甘草皂苷起效快，却存在药效持续时间过短等问题；且目前没有更好药物可妥善地解决这一问题。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服上述
背景技术：
的不足，提供一种甘草皂苷，该甘草皂苷具有使用安全、起效快、药效持续时间长的特点。本发明的另一个目的在于提供一种制备甘草皂苷的制备方法，该方法能够选择性地制备具有上述的两种立体异构体的甘草皂苷，并且该制备方法工艺过程简单、产品收率高。本发明的目的还在于提供一种甘草皂苷为原料制备抗炎、抗过敏、免疫调节、抗肝损害的药物中应用。本发明提供的技术方案是一种甘草皂苷，其特征在于所述甘草皂苷由18a-甘草皂苷和183-甘草皂苷构成，18ct-甘草皂苷是与18位碳相连的氢原子在a位上，18P-甘草皂苷是与18位碳相连的氢原子在3位上，两者的化学结构式如下所示18(1-甘草皂苷与18e-甘草皂苷的摩尔比为14:1。所述的18a-甘草皂苷与18p-甘草皂苷的摩尔比为12:1。所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于按照如下步骤制备1)在浓度为70%80%的天然甘草皂苷中加入碱性溶液，常温常压下加热回流；2)待上述反应物冷却后，加酸性溶液调pH值至2-4，待反应物沉淀完全，过滤干燥；3)将步骤2)制得的反应物，用正已醇溶解，萃取，减压回收正己醇；4)在上述提取液中加入冰乙酸，加热溶解，冷却后过滤、干燥，制得甘草皂苷晶体。所述的碱性溶液为1020%氢氧化钠溶液、1530%氢氧化钾溶液、20-300/^氢氧化钙溶液、含有25%氢氧化钠的乙二醇溶液、含有46%氢氧化钾的乙二醇溶液中的任意一种。所述的天然甘草皂苷与氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液反应的摩尔比为1:718，反应后加热回流13小时。所述的天然甘草皂苷与含氢氧化钠的乙二醇溶液反应的摩尔比为1:14，反应后加热回流1020分钟。所述的正已醇加入量为1摩尔天然甘草皂苷中加入1.52.5L的正已醇。所述的冰乙酸加入量为1摩尔天然甘草皂苷中加入1.52.5L的冰乙酸。本发明提供的药剂可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂，其他液体制剂如糖浆、合剂；用于肠胃外给药时，可将制成注射用的溶液、粉剂、水或油性悬浮剂等。本发明优选的形式是注射粉剂、注射水剂、片剂、口服液、颗粒剂、散剂、或外用膏剂。本发明的另一目的在于提供甘草皂苷在制药中的应用。所述的甘草皂苷作为制备抗炎药中应用。所述的甘草皂苷作为制备抗过敏药中应用。所述的甘草皂苷作为制备抗肝损害药中应用。所述的甘草皂苷作为制备免疫调节药中应用。本发明的制备方法均在常温常压下进行。本发明提供的甘草皂苷由起效快的18ci—甘草皂苷和药效持续时间长的183—甘草皂苷构成，通过大鼠或小鼠的腹部注射毒性试验，证实甘草皂苷对大鼠急性肝损伤具有保护作用；可增强细胞免疫功能，促进抗体产生，从而减轻组织损害；且具有抗炎作用。18ct—甘草皂苷与183—甘草皂苷结合对抗炎、免疫调节、抗肝损伤的保护作用等均优于单一立体异构体，说明两立体异构体间能显示药理活性的合理互补。本发明所提供的制备甘草皂苷的方法，工艺简单、经济实用，可在特定的反应物和溶剂的作用下，产生具有特定比例的18a-甘草皂苷和180-甘草皂苷化合物，从大量的药理、生化及实验分析证明，该具有特定比例的甘草皂苷具有最佳的药效。经本发明提供制备方法制得的甘草皂苷可用于抗炎、免疫调节、抗肝损害的药物中应用。具体实施例方式通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明的限定。在这些实施例中，除反应溶剂外，所有百分数均为摩尔百分比。正已醇与冰乙酸试剂均为分析纯，酸性溶液可选用盐酸或硫酸，优选高浓度酸。实施例1称取浓度为75%的天然甘草皂苷200g(Q.24mo1)，溶于1000ml、4mol/L氢氧化镁溶液中，经常压加热回流2小时，待反应物冷却后，加37%的浓盐酸调至pH为3。待反应沉淀完全后，过滤、干燥；将经过预处理的甘草皂苷用500ml浓度为99.9%的正已醇溶解，由于甘草皂苷在正已醇的溶解度很高，甘草皂苷经正已醇萃取后，分离出杂质。将萃取后的甘草皂苷正已醇溶液进行减压处理，回收正己醇；得到半固体状态的甘草皂苷。在该半固体状态的甘草皂苷中加入500ml浓度为99.5y。的冰乙酸溶液，加热至150。C溶解，反应后冷却过滤、干燥，制得170g含18ct-甘草皂苷、18e-甘草皂苷的甘草皂苷晶体，产品收率为85%。检测指标如下表一甘草皂苷元素分析元素分析测定值(％)计算值(％)C61.3061.10表二甘草皂苷中立体异构体比例18H-P位71.2mol%18H-a位28.8mol%反应中，其他数据如下熔点206208°C(分解)，+18.0°(50%C2H50H，1%)，Elc132.0(50%C2H5OH，1%)。经实验证明常温常压加热回流时间越长，18ot-甘草皂苷的比值越大。实施例2称取浓度为80%的天然甘草皂苷200g(0.24mol)，溶于800ml、含lmol/L氢氧化钠的乙二醇溶液中，经常压加热回流15分钟后，减压去除乙二醇。残留物加300500ML水溶解后，加98%的浓硫酸调至pH为2.5。待反应沉淀完全后，过滤、干燥，将经过预处理的甘草皂苷用500ml浓度为99.9%的正已醇溶解，由于甘草皂苷在正已醇的溶解度很高，甘草皂苷经正已醇萃取后，分离出杂质。将萃取后的甘草皂苷正已醇溶液先水洗、再减压处理，回收正己醇；得到半固体状态的甘草皂苷。在该半固体状态的甘草皂苷中加入500ml浓度为99.5%的冰乙酸溶液，加热至120。C溶解，反应后冷却过滤、干燥，制得165g含18a-甘草皂苷、lSe-甘草皂苷的甘草皂苷晶体，产品收率为82.5%。检测指标如下-表一甘草皂苷元素分析元素分析测定值(％)计算值(％)—C61.2061.10表二甘草皂苷中立体异构体比例18H-P位65.2mol%18H-a位34.8mol%反应中，其他数据如下熔点205207°C(分解)，+19.0°(50%C2H5OH1%)，Elc133.6(50%C2H5OH1%)。经实验证明常温常压加热回流时间越长，18ci-甘草皂苷的比值越大。以下通过甘草皂苷的动物药效实验来进一步说明本发明的有益效果。试验一甘草皂苷对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用1.材料1.1药品与试剂实验室精制的18a-甘草皂苷和18P-甘草皂苷，角叉菜胶(sigma公司，批号为0710);氢化可的松注射液(5ml:25mg，天津金耀氨基酸有限公司，批号为0608221);大鼠白介素-6(IL-6ELISA)96TELISA试剂盒(美国ADL原装进口)，二甲苯、四氯化碳等试剂均为分析纯。角叉菜胶临用前一天用生理盐水配制成1%浓度，放置冰箱过夜；四氯化碳用橄榄油配制成为6%浓度。1.2仪器全自动微孔洗涤机(EGATE2310，上海新波生物)；全自动定量酶标仪(Anthos2010，奥地利)1.3实验动物雄性昆明种小鼠，22-26g，由浙江大学动物试验中心提供。2.小鼠耳肿胀实验将小鼠随机分为12组，每组5只空白组(磷酸盐缓冲液)、ct-甘草皂苷组、甘草皂苷组及不同配比的ci-甘草皂苷和e-甘草皂苷的混合物组，比例为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9。小鼠甘草皂苷给药剂量为300mg/kg，用磷酸盐缓冲液配制成相应的溶液。每天腹腔注射和耳部涂抹给药一次，连续给药4天。末次给药l小时后，用湿棉球擦净小鼠右耳，待干燥后，小鼠右耳给予二甲苯0.03ml，左耳不作处理，作为自身对照。致炎2小时后将小鼠脱颈处死，用直径为8mm的打孔器分别在左右耳同一部位打下圆耳片，立即称重。左右耳片重量差即为肿胀度，计算肿胀抑制率，比较各组药物的抗炎作用。肿胀抑制率(％)=(对照组肿胀抑制度-给药组肿胀抑制度)/对照组肿胀抑制度X1000/0表l不同配比甘草皂苷对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响组别肿胀度(mg)平均抑制率(％)正常对照组a-甘草皂苷组e-甘草皂苷组a:P=9:1a:0=8:2a:0=7:39.78±4.248.83±5.847.85±3.165.95±4.019.06±3.737.32±4.519.7619.7339.167.3625.15a:P=6:46.10±2.6137.63a:0=5:55.82±3.2440.49a:P=4:65.30±3.4045.81a:P=3:72.60±2.2773.42a:P=2:85.85±4.6240.18a:99.04±3.777.57实验表明在抑制二甲苯引起的耳部炎症反应中，183-甘草皂苷略优于lSa-甘草皂苷，并且比例不同所表现出来的抗炎能力也不同(见表l)。当a-甘草皂苷和e-甘草皂苷比例为3:7时，抗炎效果最佳，与对照组相比有差异(P<0.05)。试验二甘草皂苷对对角叉菜胶诱发大鼠足爪肿胀的抑制作用。1.材料1.1药品与试剂实验室精制的18d-甘草皂苷和18P-甘草皂苷，角叉菜胶(sigma公司，批号为0710);氢化可的松注射液(5ml:25mg,天津金耀氨基酸有限公司，批号为0608221);大鼠白介素-6(IL-6ELISA)96TELISA试剂盒(美国ADL原装进口)，二甲苯、四氯化碳等试剂均为分析纯。角叉菜胶临用前一天用生理盐水配制成1%浓度，放置冰箱过夜；四氯化碳用橄榄油配制成为6%浓度。1.2仪器全自动微孔洗涤机(EGATE2310,上海新波生物)；全自动定量酶标仪(Anthos2010,奥地利)1.3实验动物雄性SD大鼠，180-220g，由浙江省药品检验所提供。132.大鼠足肿胀实验将大鼠随机分为7组，每组8只空白组(磷酸盐缓冲液)、阳性对照组(采用氢化可的松，剂量为12.5mg/kg)、a-甘草皂苷组、^-甘草皂苷组、三个不同配比的甘草皂苷组(d-甘草皂苷3-甘草皂苷为3:7、4:6禾B5:5)。大鼠给药剂量和溶液配制参照2.1。每天腹腔注射给药一次，连续给药4天。末次给药1小时后，在大鼠的右后足跖中部皮下注射1%角叉菜胶0.lmL致炎。测定致炎前和致炎后30min、lh、1.5h、2h、4h、6h时每鼠右后足周长，观察足肿胀高峰时间和消退时间。以致炎前后足周长差为肿胀度，按抑制率公式计算肿胀抑制率，比较给药组和对照组的差异。表2不同配比甘草皂苷对角叉菜诱发大鼠足肿胀的影响组别足肿胀度(mm)0.5hlh1.5h2h4h6h正常对照组2.38±1.063.88±0.834.06±0.943.25±1.143.06±1.562.19±1.28氢化可的松组1.93±1.062.35±1.14"2.64土0.90"2.85±1.031.78土1.C4'1.00土1.08"a-甘草卓苷组2.19±1.513.06±1.323.12±0.793.00±0.812.12±0.692.18±0.59e-甘草皂苷组2.56±0.982.69±1.44*2.81士0.99'2.56±0.782.13±1.551.44±1.01a:0=5:51.75±0.932.13土1.13"2.44士1.02"2.63±1,241.31士0.99"0.75士0.84"a:p=4:60.67±0.750.75土0.88"0.92土1.06"1.67±0.610.75士0.75神0.5土0.83"a:e=3:70.5±0,38*1.44土0.73"1.63土0.64"1.31±0.53*0.94士0.56"0.56士0.78"实验表明与对照组在相同时间点的比较，P<0.05;PW.01，差异有统计学意义。不同比例的异构体对角叉菜胶诱发大鼠足爪肿胀均呈抑制作用，其中以3040molQ/。a-构型和7060mol%P-构型的组成物的抑制水肿作用最强。水肿初期主要由组胺和5-HT释放所致，水肿后期由PGE介导，说明上述比例组成的异构体能显示良好的抗炎作用。试验三甘草皂苷对四氯化碳肝损伤大鼠血清ALT的影响1.材料1.1药品与试剂实验室精制的18a-甘草皂苷和180-甘草皂苷，大鼠肝匀浆SOD和MDA试剂盒(购自南京建成公司)，四氯化碳试剂为分析纯，四氯化碳用橄榄油配制成为6%浓度。1.2仪器全自动生化检测仪(日立，日本)1.3实验动物雄性SD大鼠，180-220g，由浙江省药品检验所提供。2.方法2.1分组及给药大鼠随机分为7组，每组14只正常组、模型对照组(肝损组)、a-甘草皂苷组、P-甘草皂苷组、三个不同配比的甘草皂苷组(a-甘草皂苷与3-甘草皂苷的摩尔比分别为2:8、3:7和4:6)。甘草皂苷给药剂量为300mg/kg，溶液用磷酸盐缓冲液(PH8.0)配制成相应浓度。药物组每天腹腔注射给药一次，模型对照组和正常组注射磷酸盐缓冲液。连续给药4次后，模型对照组和给药组大鼠各腹腔注射6%四氯化碳橄榄油溶液0.5ml造成急性肝脏损害，正常组给予相同体积(0.5ml)的橄榄油；肝损伤后2h、22h和46h再次给药。肝损24h后将各组一半的大鼠麻醉并腹主静脉采血，离心取血清，并立即将肝脏冰冻在-2(TC条件下。48h后麻醉剩余大鼠，以相同的方式取血和肝组织。2.2检测项目用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)。表3甘草皂苷对四氯化碳肝损伤大鼠血清ALT的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>型对照组大鼠血清中ALT明显高于正常组(P〈0.05，或P〈0.01)，而48小时模型组血清指标ALT明显高于正常组，ALT升高幅度大于24小时测定值，提示肝功能进一步受损，模型复制成功。a与p甘草皂苷比例为4:6、3:7和2:8，给药组大鼠血清ALT与AST水平低于肝损组；肝损48小时后，各给药组的ALT水平高于24小时，与模型组情况一致。a与p甘草皂苷比例为3:7时相对于模型组能明显降低48小时ALT水平。试验四甘草皂苷对四氯化碳肝损伤大鼠的影响1.材料1.1药品与试剂实验室精制的18a-甘草皂苷和183-甘草皂苷，四氯化碳试剂为分析纯，四氯化碳用橄榄油配制成为6%浓度。1.2实验动物雄性SD大鼠，180-220g，由浙江省药品检验所提供。2.方法试验方法同试验三。2.2检测项目甘草皂苷对四氯化碳肝损伤大鼠的影响。表4甘草皂苷对四氯化碳肝损伤大鼠的影响实验组比例(mol%)动物数(只)不同等级肝病变动物数—++++++++++正常对照生理盐水1091模型对照1000325a-构型10010144101001024310ae-构型4:61025210ae-构型3:710361002:81025300实验表明不同比例的立体异构体均能明显改善肝组织病变，其中以3040mol%18a-构型和7060mol%18P-构型的组成物的抗肝损伤效果最为明显。不同等级肝病变动物数的评分标准如附表附表1肝细胞气球样变:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>试验五甘草皂苷对四氯化碳致小鼠和大鼠急性肝损伤后血清中白介素-2(IL-2)的影响1.材料1.1药品与试剂实验室精制的18a-甘草皂苷和183-甘草皂苷，四氯化碳试剂为分析纯，四氯化碳用橄榄油配制成为6%浓度。1.2实验动物雄性SD大鼠，180-220g，由浙江省药品检验所提供。2方法试验方法同试验三。甘草皂苷对四氯化碳致小鼠和大鼠急性肝损伤后血清中白介素-2(IL-2)的影响。表5甘草皂苷对四氯化碳致小鼠和大鼠急性肝损伤后血清中白介素-2的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实验表明不同比例的a，e-立体异构体均能上调小鼠血清白介素-2(IL-2)，其中以3040moiy。a-构型和7060mol%0-构型的组成物最明显，说明两个异构体的最佳比例能增强细胞免疫功能，促进抗体产生，从而减轻组织损害。试验六甘草皂苷对四氯化碳致小鼠和大鼠急性肝损伤后血清中白介素-6(IL-6)的影响1.材料1.1药品与试剂实验室精制的18a-甘草皂苷和18e-甘草皂苷，四氯化碳试剂为分析纯，四氯化碳用橄榄油配制成为6%浓度。1.2实验动物雄性SD大鼠，180-220g，由浙江省药品检验所提供。2方法试验方法同试验三。2.2检测项目甘草皂苷对四氯化碳致小鼠和大鼠急性肝损伤后血清中白介素-6(IL-6)的影响表6甘草皂苷对四氯化碳致小鼠和大鼠急性肝损伤后血清中白介素-6的影响实验组比例(mol%)动物数(只)IL-6(pg/ml)正常对照生理盐水10228.2±28.3模型对照10116.1±30.3a-构型10010147.7±39.2e-构型10010175.3±47.3a构型4:610194.1±53.9a0-构型3:710170.6±38.2ae-构型2:810166.8±52.6实验表明不同比例的a，e-立体异构体均能上调小鼠血清白介素-6(IL-6)，其中以3040mol9U-构型和7060mol%P-构型的组成物最明显，说明两个异构体的最佳比例能增强细胞免疫功能，促进抗体产生，从而减轻组织损害。权利要求1、一种甘草皂苷，其特征在于所述甘草皂苷由18α-甘草皂苷和18β-甘草皂苷构成，18α-甘草皂苷是与18位碳相连的氢原子在α位上，18β-甘草皂苷是与18位碳相连的氢原子在β位上，两者的化学结构式分别如下所示18α-甘草皂苷与18β-甘草皂苷的摩尔比为1～41。2、根据权利要求1所述的甘草皂苷，其特征在于18d-甘草皂苷与18P-甘草皂苷的摩尔比为12:1。3、权利要求1所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于按照如下步骤制备1)在浓度为70%80%的天然甘草皂苷中加入碱性溶液，常温常压下加热回流；2)待上述反应物冷却后，加酸性溶液调pH值至2-4，待反应物沉淀完全，过滤干燥；3)将步骤2)制得的反应物，用正已醇溶解，萃取，减压回收正己醇；4)在上述提取液中加入冰乙酸，加热溶解，冷却后过滤、干燥，制得甘草皂苷晶体。4、根据权利要求3所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于所述的碱性溶液为1020%氢氧化钠溶液、1530%氢氧化钾溶液、20-30%氢氧化钙溶液、含有25%氢氧化钠的乙二醇溶液、含有46%氢氧化钾的乙二醇溶液中的任意一种。5、根据权利要求4所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于所述的天然甘草皂苷与氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液反应的摩尔比为h718，反应后加热回流13小时。6、根据权利要求5所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于所述的天然甘草皂苷与含氢氧化钠的乙二醇溶液反应的摩尔比为1:14，反应后加热回流1020分钟。7、根据权利要求6所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于所述的正已醇加入量为1摩尔天然甘草皂苷中加入1.52.5L的正已醇。8、根据权利要求7所述的甘草皂苷的制备方法，其特征在于所述的冰乙酸加入量为1摩尔天然甘草皂苷中加入1.52.5L的冰乙酸。9、根据权利要求1或2所述的甘草皂苷，其特征在于所述的制剂形式为口服液、颗粒剂、片剂、粉剂、散剂、注射剂或外用膏剂。10、权利要求1所述的甘草皂苷在制备抗炎、抗过敏、免疫调节、抗肝损害的药物中应用。全文摘要本发明涉及一种甘草皂苷及甘草皂苷的制备方法和其在药品中的应用。目的是提供的甘草皂苷具有使用安全、起效快、药效持续时间长的特点，甘草皂苷的制备方法工艺过程简单、产品收率高。提供一种甘草皂苷为原料制备抗炎、抗过敏、免疫调节、抗肝损害的药物中应用。技术方案是所述甘草皂苷由18α-甘草皂苷和18β-甘草皂苷构成，18α-甘草皂苷与18β-甘草皂苷的摩尔比为1～4∶1。文档编号A61P29/00GK101440116SQ20081012132公开日2009年5月27日申请日期2008年9月25日优先权日2008年9月25日发明者吴锡铭,娄国强,梁伟峰,茹仁萍申请人:杭州市第六人民医院