专利名称：去酰基化头孢菌素的发酵生产的方法
技术领域：
本发明涉及N-去酰基化头孢菌素类化合物如7-ADCA的发酵生产的领域发明背景β-内酰胺类抗生素是抗生素类化合物中最重要的一组，具有很长的临床应用史。该组中杰出的代表是青霉素类和头孢菌素类。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和Acremoniumchrysogenum天然产生。
通过经典性菌株改良技术，在过去的数十年中产黄青霉和Acremonium chrysogenum中的抗生素生产水平大大提高。随着对青霉素类和头孢菌素类的生物合成途径知识的不断增加以及重组DNA技术的出现，出现了用于提高菌株产量和化合物体内衍生化的新工具。
参与β-内酰胺生物合成的大多数酶已经被鉴别，且其相应的基因已经被克隆。如Ingolia与Queener在医学研究综述(Medd.Res.Rev.)9(1989),245-264(生物合成路线和酶)，以及Aharonowitz,Cohen与Martin在Ann.Rev.Microbiol.46(1992),461-495(基因克隆)中所述。
在产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是三个氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A),L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合形成一个三肽LLD-ACV，接着该三肽环化形成异青霉素N。此化合物含有典型的β-内酰胺结构。
青霉素生物合成的头两步在生产青霉素、头霉素和头孢菌素的真菌及细菌中是相同的。
第三步涉及异青霉素N的亲水性D-α-氨基己二酸侧链通过酰基转移酶(AT)的作用与L-5-氨基-5-羧基戊酸交换。通过AT调节的酶促交换反应发生在细胞的细胞器微体中，如EP-A-0448180中所述。
在产头孢菌素的生物中，第三步是异青霉素N在差向异构酶作用下异构化形成青霉素N，于是，青霉素类特征性的五元环结构通过扩环酶(expandase)的作用形成了头孢菌素类特征性的六元环结构。
仅通过直接发酵生产的具有工业意义的青霉素是青霉素V和青霉素G，它们分别是通过在产黄青霉发酵过程中添加疏水性侧链前体物质苯氧乙酸或苯乙酸而得到的，藉此由苯氧乙酸或苯乙酸取代了天然β-内酰胺类的侧链。
头孢菌素类比青霉素类要贵许多。一个原因就是一些头孢菌素(如头孢氨苄)是通过大量的化学转化由青霉素衍生而来的。至今在这方面仍是最重要的起始原料的头孢菌素C在任何pH条件下均易溶于水，这暗示着要应用繁重而昂贵的柱层析技术来进行时间更长、成本更高的分离过程。以这种方式获得的头孢菌素C又不得不通过大量的化学和酶学转化而形成具有治疗价值的其它头孢菌素。
目前通过青霉素G的化学衍生化生产头孢菌素的中间体7-ADCA。这个必需的生产7-ADCA的化学步骤包括了由青霉素五元环结构向头孢菌素六元环结构转化的扩环。
近来，已公开了获得7-ADCA的发酵方法。
在EP-A-0532341中己二酸(5-羧基戊酸)原料的应用表明可以形成一种带己二酰基侧链的青霉素衍生物，即己二酰基-6-氨基青霉烷酸。这种整合是由于酰基转移酶已被证实了的具有广泛的底物特异性(Behrens等人，生物化学杂志(J.Bio.chem.)175(1948),751-809；Cole，生物化学方法(Process Biochem.)1(1966),334-338；Ballio等人，自然(Nature)185(1960),97-99)。另外，当己二酸被加入到一种表达一种扩环酶的重组产黄青霉菌株中时，己二酰基-6-APA被扩环形成了其相应的头孢菌素衍生物。最终，建议将己二酰侧链消除，产生作为终产物的7-ADCA。
专利申请EP-A-0540210描述了一种相似的制备7-ACA的方法，包括将ADCA环的3-甲基基团转化成为ACA的3-乙酸基甲基基团的额外的步骤。
WO95/04148和WO95/04149公开了加入一种特定的含硫基团的二羧酸原料到表达扩环酶的产黄青霉菌株中，使得这些前体物质被整合到青霉素骨架上并随后扩环形成了相应的7-ADCA衍生物。
然而，我们通常认为，在青霉素N和头孢菌素生物合成过程中提供至关重要的纽带的扩环酶应具有窄的特异性(Maea，等人，酶和微生物技术(Enyme and Micoobiol.Technology)(1995)17:231-234；Baldwin等人，J.Chem.Soc.Chem.Commu.374-375,1987)，这样可以防止用非天然侧链催化青霉素N氧化性扩环的可能性。
本发明公开了一种使用新型侧链前体物质发酵生产头孢菌素类化合物的方法，该方法较现有的上述方法就产量和副产物水平的减少而言具有诸多优点。
发明概述本发明公开了一种生产N-去酰基化头孢菌素化合物的方法，其包括下述步骤*发酵一种微生物菌株，该菌株能产生β-内酰胺并表达酰基转移酶及扩环酶活性、且选择性地表达乙酰基转移酶和/或羟化酶活性，在如下述分子式(1)的侧链前体物质存在下HOOC-X-COOH(1)其中X是(CH2)m-CH=A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中m和n各自独立地是0、1、2或3，且m+n=2或3，且A是CH或N，或者X是(CH2)p-CH=CH-CH=C-(CH2)q，其中p和q各自独立地是0或1，且p+q=0或1，或在该前体物质以此分子的一种盐、酯或酰胺的形式存在下，该侧链前体物质产生整合有该前体物质的酰基-6-APA衍生物，该酰基-6-APA衍生物在原位扩环形成相应的酰基-7-ADCA衍生物，由此进一步选择性地反应形成酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物，并且*从发酵培养基中回收酰基-7-头孢菌素衍生物*将该酰基-7-头孢菌素衍生物进行去酰基化处理，并且*回收结晶的N-去酰基化头孢菌素化合物。
发明详述本发明公开了一种通过对N-去酰基化头孢菌素衍生物(7-ADCA,7-ADAC或7-ACA)的N-酰基化对应物进行发酵生产而制备N-去酰基化头孢菌素衍生物的方法，该方法应用了一种新型侧链前体物质原料。通过使用这些前体物质，形成了新型N-酰基化头孢菌素衍生物。
根据本发明，在具有1或2个不饱和键的二羧酸存在下，能产生β-内酰胺、表达酰基转移酶和扩环酶活性、并选择性地表达羟化酶或羟化酶以及乙酰基转移酶活性的微生物菌株的发酵，能使该侧链前体物质被更好地整合到头孢菌素骨架中。因此，在本发明的方法中只检测到少量非预期的酰基-6-APA衍生物。另外，与基于己二酸的产量相比，基于不饱和前体物质的本发明可以获得更高产量的N-酰基化头孢菌素衍生物。
根据本发明，该侧链前体物质结构如下述分子式(1)HOOC-X-COOH (1)其中X是(CH2)m-CH=A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中m和n各自独立地是0、1、2或3，且m+n=2或3，同时A是CH或N，或者X是(CH2)p-CH=CH-CH=C-(CH2)q，其中p和q各自独立地是0或1，且p+q=0或1。
根据本发明，在如分子式(1)所示的不饱和前体物质或其盐、酯或酰胺形式存在时，发酵可产生整合了该前体物质的酰基-6-APA衍生物。该酰基-6-APA衍生物随后便在原位扩环形成了相应的酰基-7-ADCA衍生物。
特别地，本发明公开了已整合有本发明所用前体物质的酰基-6-APA化合物在随后的扩环反应中是一种有效的底物。本发明方法中所形成的酰基-6-APA的数量大大低于利用己二酸侧链前体物质生产己二酰基-7-ADCA的方法所产生的副产物己二酰基-6-APA的数量。
在本发明优选的实施方案中，一种如分子式(1)的化合物被用作侧链前体物质，其中m和n均是1且A是CH。更优选的，如分子式(1)的化合物是反式-β-氢化己二烯二酸。本发明显示含有一个反式-β-氢化己二烯二酰基侧链的酰基-6-APA化合物可以非常有效地扩环形成相应的7-ADCA衍生物，因为没有或仅有少量的6-APA衍生物可检测到。另外，与基于己二酸为前体物质的产量相比，基于此前体物质的N-酰基化头孢菌素的产量得以提高。
在本发明方法中适用的微生物菌株是那些可以产生β-内酰胺且表达酰基转移酶和扩环酶活性的菌株。另外，该类微生物菌株也选择性地表达出羟化酶或羟化酶加上乙酰基转移酶的活性。前一种菌株能产生酰基-7-ADCA衍生物，而后一种菌株能产生酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物。
这样的微生物菌株实例包括带有可提供扩环酶表达的表达盒的产青霉素菌株和带有可提供酰基转移酶表达的表达盒的产头孢菌素菌株。
易于应用的扩环酶基因可来源于Acremonium chrysogenum，带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)，抗生链霉菌(Streptomycesantibioticos)或Nocardia lactamdurans。酰基转移酶基因可来源于产黄青霉，纳地青霉(P.nalgiovense)或无冠构巢曲霉(A.nidulans)。
在一个优选的实施方案中，使用一种重组地表达扩环酶的产青霉素真菌菌株。更优选地，使用黑曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)的真菌。最优选地，使用一种产黄青霉菌株。产黄霉菌株Panlabs P14-B10,DS18541(保藏于CBS，保藏号为455.957)是一种适合扩环酶表达的宿主的实例。
重组表达扩环酶的菌株的构建在本领域技术人员知识范围之中。一些可用于重组表达扩环酶的真菌菌株构建的表达盒的实例被Crawford等人公开在EP-A-0532341(生物技术(Biotechnol.)13(1995),58-62)和WO95/04148。在选择转化子的菌株时应注意选择一种扩环酶表达水平足够高的菌株。例如，这样的转化子可通过测试它们产生己二酰基-7-ADCA的能力来选择，如Crowford等人(出处同前)所述。
在另一个实施方案中，使用了一种重组地表达酰基转移酶的产头孢菌素的菌株，例如一种产酰基转移酶的A.chrysogenum菌株。因此，一种重组地表达酰基转移酶的A.chrysogenum菌株可产生一种酰基-7-ACA衍生物，这是因为这种菌株自身就可表达羟化酶和乙酰基转移酶。
这些优选的实施方案将会对减少青霉素副产物的数量作出巨大贡献，否则注册官员是不能接受那样的7-ADCA终产物的。
本发明还描述了一种使用特异性溶剂从根据本发明的微生物发酵培养基中回收酰基-7-头孢菌素衍生物的方法，例如，从表达扩环酶的产黄青霉菌株的发酵培养基中回收酰基-7-ADCA衍生物。
特别地，对发酵培养基滤液先用与水不混溶的有机溶剂在pH低于约4.5时进行萃取操作，再用pH界于4～10之间的水对该有机相进行反萃取，从发酵培养基中回收酰基-7-头孢菌素衍生物。
培养基过滤后，将与水不混溶的有机溶剂加入到滤液中。为了从水层萃取酰基-7-头孢菌素衍生物，调整该滤液的pH值。pH值范围必须低于4.5，优选为4～1之间，更优选的在2～1之间。这样，酰基-7-头孢菌素衍生物便可从发酵培养基中的许多其它杂质里分离出来。优选的应用体积较小的有机溶剂，例如相当于水层体积一半的溶剂体积，从而得到酰基-7-头孢菌素衍生物的浓溶液，以使体积流率减少。另一种可能是在pH为4或更低时对整个培养基在进行萃取。优选地用与水不混溶的有机溶剂在pH范围4～1之间萃取培养基。
任何不影响头孢菌素分子的溶剂均可应用。合适的溶剂是例如乙酸丁酯，乙酸乙酯，甲基异丁基酮，醇类如丁醇等。优选地使用正丁醇或异丁醇。
由此，酰基-7-头孢菌素衍生物可以再用pH界于4～10之间优选为pH6～9之间的水反萃取。最终体积被再次减少。回收可在0～50℃之间的温度下进行，优选地为室温。
由本发明方法生产的酰基-7-头孢菌素衍生物在半合成头孢菌素类的化学合成中可方便地用作中间体，因为，7-氨基基团由于恰当的酰基侧链的存在而被充分保护。
此外，酰基-7-头孢菌素衍生物可用合适的酶如假单胞菌(Pseudomonas)SE83酰基转移酶在一步酶法中被去酰基化。
优选地使用固定化酶以重复使用。这种颗粒的制备和酶的固定化的方法学已在EP-A-0222462中详尽说明。水溶液具有如pH4～9的pH值，这样可以减少头孢菌素的降解反应并且适于期望的酶促转化。于是，当头孢菌素水溶液pH维持在合适的水平时加入该酶，pH值的维持可以通过例如加入一种无机碱，如KOH溶液，或应用一种阳离子交换树脂来实现。反应结束后固定化酶可通过过滤移去。另一种可能是在一种固定或流化床柱中应用固定化酶，或在溶液中使用固定化酶，且通过膜过滤移走产物，随后，在与水不混溶的有机溶剂存在下将反应混合物酸化。pH调整为约0.1～1.5后，分离两相，水层的pH再调整为2-5。头孢菌素化合物的结晶便可过滤出来。
去酰基化也可用如已知的先有技术的化学方法进行，例如通过在低于10℃的温度下加入五氯化磷，随后在室温或更低温度下加入异丁醇而形成偕氯代亚胺侧链。
实施例1重组产黄青霉的发酵产黄青霉菌株Panlabs P14-B10(保藏于CBS，保藏号455.95)用作扩环酶表达盒构建体的宿主菌株。
所用的表达盒含有由产黄青霉IPNS基因转录和翻译调控信号所调控的扩环酶基因，如Crawford等人(出处同前)所述。转化和培养条件如Crawford等人(出处同前)所述。纯化转化子，且通过测试它们产生己二酰基-7-ADCA的能力分析扩环酶的表达，如Crawford等人(出处同前)所述。
产酰基-7-ADCA的转化子以2×106个分子孢子/ml的浓度接种到一种种子培养基上，该培养基含有以下物质(g/l)葡萄糖，30；Pharmamedia(棉籽粉)，10；玉米浸液，20；(NH4)2SO4,20；CaCO3,5；KH2PO4,0.5；乳糖，10；酵母提取物，10；灭菌处理前培养基pH为5.6。
该种子培养基(20ml，在250ml带棉花塞的Erlemeyer瓶中)在25℃，以220转/分的速度进行培养。48小时后，取1ml接种于15ml的生产培养基，该培养基含有以下物质(g/l)KH2PO4,0.5；K2SO4,5；(NH4)2SO4,17.5；乳糖，140；Pharmamedia,20；CaCO3,10；猪油，10；灭菌处理前培养基pH为6.6。
接种了种子培养基后，生产培养基中加入浓度为20％的所选前体物质的贮备溶液，(该液体的pH已用KOH调整为6.5)，使其终浓度为0.5％～2％。
生产培养物在一种250ml以牛奶过滤器封口的Elemeyer瓶中在25℃以220转/分培养168小时，每隔一天补充蒸发掉的水。
发酵生产结束时，通过离心或过滤除去菌丝体并应用HPLC对酰基-6-APA和酰基-7-ADCA进行分析。
实施例2发酵产物的分析应用高效液相色谱(HPLC)对来自经转化的青霉菌属菌株的发酵产物进行分析。该HPLC系统由下述成分组成P1000溶剂输送系统(TSP)，基本马拉松式(basic marathon)自动进样器(SparkHolland)(注射体积3)，UV150(TSP)可变波长检测器(设定为260nm)和一个PC1000数据系统(TSP)。固定相是YMC Pack ODSAQ柱(150×4.6mm)。流动相由下述物质组成加入了0.17％硫酸氢四丁基铵的pH6.0的84％磷酸盐缓冲液和16％的乙腈。通过与预期的酰基-7-ADCA的标准曲线比较可定量发酵产物。
实施例3N-酰基化青霉素和头孢菌素衍生物的生产在不同浓度的己二酸(AA)或反式-β-氢化己二烯二酸(THMA)存在下，根据实施例1进行产黄青霉发酵。按实施例2用HPLC分析N-酰基化β-内酰胺化合物。
HPLC分析表明在前体物质THMA存在时经过发酵，THMA可被整合到头孢菌素骨架中，即形成了反式-β-氢化己二烯二酰基-7-ADCA。
表1-所述的结果还显示在THMA存在下进行发酵时，检测不到反式-β-氢化己二烯二酰基-6-APA。另外，与己二酰基-7-ADCA相比，反式-β-氢化己二烯二酰基-7-ADCA的产量提高，特别是当应用高浓度的前体物质时。
表1．施以不同浓度AA和THMA时形成酰基-6-APA和酰基-7-ADCA的量
*结果以与施用0.5％己二酸时形成的酰基-7-ADCA的量的相对值来表示，该产量值设为100％。
nd=未检测到
权利要求
1．一种生产N-去酰基化头孢菌素化合物的方法，其包括下述步骤*发酵一种微生物菌株，该菌株能产生β-内酰胺并表达酰基转移酶和扩环酶活性、且选择性地表达乙酰基转移酶和/或羟化酶活性，在如下述分子式(1)的侧链前体物质存在下HOOC-X-COOH(1)其中X是(CH2)m-CH=A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中m和n各自独立地是0、1、2或3，且m+n=2或3，并且A是CH或N，或者X是(CH2)p-CH=CH-CH=C-(CH2)q，其中p和q各自独立地是0或1，且p+q=0或1，或者在该前体物质以此分子的一种盐、酯或酰胺的形式存在下，该侧链前体物质产生整合有该前体物质的酰基-6-APA衍生物，该酰基-6-APA衍生物在原位扩环形成相应的酰基-7-ADCA衍生物，由此进一步选择性地反应形成酰基-7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物，并且*从发酵培养基中回收酰基-7-头孢菌素衍生物*将该酰基-7-头孢菌素衍生物进行去酰基化处理，并且*回收结晶的N-去酰基化头孢菌素化合物。
2．权利要求1的方法，其中使用分子式(1)的一种不饱和侧链前体物质，该物质的m和n是1且A是CH。
3．权利要求2的方法，其中该不饱和侧链前体物质是反式-β-氢化己二烯二酸。
4．权利要求1～3中任一项的方法，其中微生物菌株是一种带有可提供扩环酶表达的表达盒的产青霉素菌株。
5．权利要求4的方法，其中产青霉素菌株是产黄青霉。
6．权利要求4或5的方法，其中结晶的头孢菌素化合物是7-ADCA。
7．权利要求1～3中任一项的方法，其中微生物菌株是一种带有可提供酰基转移酶表达的表达盒的产头孢菌素菌株。
8．权利要求7的方法，其中产头孢菌素菌株是Acremoniumchrysogenum。
9．权利要求7或8的方法，其中结晶的头孢菌素化合物是7-ADAC或7-ACA。
全文摘要
本发明公开了一种通过对N－去酰基化头孢菌素类化合物的7－酰基化对应物进行发酵生产而制备N－去酰基化头孢菌素类化合物的方法。
文档编号C12N1/19GK1224469SQ98800524
公开日1999年7月28日 申请日期1998年4月22日 优先权日1997年4月22日
发明者M·尼博尔, E·德弗鲁姆, J·卢格特布格, D·希珀, A·W·H·沃勒里特, R·A·L·伯韦比格 申请人:吉斯特-布罗卡迪斯有限公司