酰基氨基酸的产生的制作方法
【专利说明】醜基氨基酸的产生 巧001]相关申请的交叉引用
[0002] 本申请案要求2013年3月15日提交的美国临时申请案第号的权利，其内容W全文 引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0003] 酷基氨基酸是商业上重要的化合物。许多酷基氨基酸具有有利特征并且作为表面 活性剂、抗生素、抗昆虫剂和作为许多其它重要试剂出售。
[0004] 传统上，W化学方式制造酷基氨基酸。运类化学制造方法受到多种缺点阻碍，包括 获得和储存起始物质的简易性、在制造过程中必须使用苛刻并且有时危险的化学反应剂、 合成本身的困难和效率、处理化学副产物的经济和环境成本等。因此，用于酷基氨基酸的有 效和有成本效益的合成W及商业规模制造的新组合物和方法将是有利的。
[000引最近，已研发重要技术，其允许通过经工程改造的肤合成酶多肤来制备酷基氨基 酸(参见美国专利第7981685号，其于2011年7月19日颁布并且W全文引用的方式并入本文 中）。运类技术的改进和/或补充将是合乎需要和有利的。
【发明内容】
[0006] 在某些实施例中，本发明包含适用于产生酷基氨基酸的组合物和方法。在某些实 施例中，本发明提供经工程改造的多肤，其包含肤合成酶结构域;在一些运类实施例中，经 工程改造的多肤仅包含单个肤合成酶结构域。在一些实施例中，本发明提供经工程改造的 肤合成酶，其实质上不含硫醋酶结构域和/或还原酶结构域。
[0007] 在某些实施例中，本发明提供酷基氨基酸组合物，其包含酷基氨基酸的多种不同 形式。在一些运类组合物中，组合物内基本上所有的酷基氨基酸含有相同氨基酸部分并且 在酷基部分方面不同。我们还描述其中脂肪酸是例如95% -个长度(C14,肉豆違酸)的群。
[0008] 在一些实施例中，本发明提供通过使经工程改造的肤合成酶与经工程改造的肤合 成酶的氨基酸底物和酷基实体底物在足W制得酷基氨基酸组合物的条件和时间下接触来 制造酷基氨基酸组合物的方法。在一些实施例中，所述方法包含提供经工程改造 W表达经 工程改造的肤合成酶的细胞。在一些实施例中，经工程改造的肤合成酶不包括硫醋酶结构 域;在一些实施例中，经工程改造的肤合成酶不包括还原酶结构域;在一些实施例中，经工 程改造的肤合成酶不包括硫醋酶结构域和还原酶结构域。
[0009] 在一些实施例中，氨基酸底物是或包含如本文中阐述的氨基酸。
[0010] 在一些实施例中，酷基实体底物是或包含脂肪酸部分。在一些实施例中，酷基实体 底物是或包含脂肪酸。
[0011] 本发明提供经工程改造 W表达至少一个经工程改造的肤合成酶的细胞，所述经工 程改造的肤合成酶可合成酷基氨基酸。
[0012] 在一些实施例中，本发明包含通过经工程改造的肤合成酶产生的酷基氨基酸组合 物。
[0013] 本发明提供制备一种产物的方法，其包含:提供或获得在经工程改造的宿主(例如 微生物)细胞中制备的酷基氨基酸组合物;任选地使酷基氨基酸组合物富集特定酷基氨基 酸;和在一些实施例中，组合经富集的酷基氨基酸组合物与至少一种其它组分W产生产物。
[0014] 在一些实施例中，本发明提供一种方法，其包含W下步骤:使经工程改造的肤合成 酶多肤(其包含单个肤合成酶结构域并且不含硫醋酶结构域和/或还原酶结构域)与W下各 者接触：（i)肤合成酶多肤的氨基酸;和（ii)肤合成酶多肤的酷基部分底物，所述接触在足 W使经工程改造的肤合成酶多肤将来自酷基部分底物的酷基部分共价连接到氨基酸，使得 产生酷基氨基酸的条件和时间下进行。
【具体实施方式】
[0015] 室义
[0016] ?氨基酸:如本文所使用的术语"酷基氨基酸"是指共价连接于脂肪酸部分的氨 基酸。在一些实施例中，氨基酸和脂肪酸通过脂肪酸的簇酸基与氨基酸的氨基之间形成的 酷胺键共价连接。在一些实施例中，酷基氨基酸中使用或包括的脂肪酸部分或实体包括0-径基;在一些实施例中，酷基氨基酸中使用或包括的脂肪酸部分或实体不包括β-径基。在一 些实施例中，酷基氨基酸中使用或包括的脂肪酸部分包括β-氨基;在一些实施例中，酷基氨 基酸中使用或包括的脂肪酸部分不包括0-氨基。在一些实施例中，酷基氨基酸中使用或包 括的脂肪酸部分在β位置处未经修饰。
[0017] 氨基酸:如本文中所使用，术语"氨基酸"在其最广泛意义上是指可用于肤合成(例 如核糖体或非核糖体合成）中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸是任何可 并入多肤链(例如通过一或多个肤键的形成）的化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸 是任何作为肤合成酶的底物的化合物和/或物质;在一些运类实施例中，氨基酸是肤合成酶 可在上面连接酷基实体(例如通过酷胺键的形成）的任何化合物和/或物质。在一些实施例 中，氨基酸具有通式结构此N-"H)(R)-C00H。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基 酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸;在一些实施例中，氨基酸是D-氨基酸;在一些实 施例中，氨基酸是k氨基酸。"标准氨基酸"是指天然存在的肤中常见的二十种标准k氨基 酸中的任一种。"非标准氨基酸"是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，不考虑其是W合成方 式制备还是从天然来源获得。在一些实施例中，氨基酸(包括多肤中簇基和/或氨基封端氨 基酸)与W上通式结构相比可含有结构变化。举例来说，在一些实施例中，氨基酸与通式结 构相比可通过甲基化、酷胺化、乙酷化和/或取代而经修饰。在一些实施例中，与含有在其它 方面相同的未经修饰的氨基酸的多肤相比，运类修饰可例如改变含有经修饰氨基酸的多肤 的循环半衰期。在一些实施例中，与含有在其它方面相同的未经修饰的氨基酸的多肤相比， 运类修饰不显著改变含有经修饰氨基酸的多肤的相关活性。如可从上下文知晓，在一些实 施例中，术语"氨基酸"用于指自由氨基酸;在一些实施例中，其用于指多肤的氨基酸残基。 在一些实施例中，"天然存在的"氨基酸是二十种氨基酸的标准群组中的一种，其是大部分 生物体中的多肤的构筑嵌段，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酷胺、天冬氨酸、半脫氨酸、谷氨酸、 谷酷胺、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、白氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和鄉氨酸。在某些实施例中，"天然存在的"氨基酸可W是太不常用 的并且通常不包括于运二十种氨基酸的标准群组中的氨基酸中的一种，但其仍然由一种或 多种生物体使用并且并入某些多肤。举例来说，密码子UAG和UGA通常编码大部分生物体中 的终止密码子。然而，在一些生物体中，密码子UAG和UGA编码氨基酸砸代半脫氨酸和化咯赖 氨酸。因此，在某些实施例中，砸代半脫氨酸和化咯赖氨酸是天然存在的氨基酸。
[0018]关联性：如果一个事件或实体的存在、程度和/或形式与另一个事件或实体相关 联，那么运两个事件或实体彼此"相关联"，如运一术语在本文中使用。举例来说，如果特定 实体(例如多肤）的存在、程度和/或形式与疾病、病症或病况的发病率和/或敏感性相关联 (例如在相关群体中），那么其(例如多肤)视为与所述特定疾病、病症或病况相关联。在一些 实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接相互作用，使得其彼此具有并且保持物理接 近性，那么其彼此W物理方式"相关联"。在一些实施例中，W物理方式彼此相关联的两个或 更多个实体彼此共价连接;在一些实施例中，W物理方式彼此相关联的两个或更多个实体 不彼此共价连接，而是W非共价形式相关联，例如借助于氨键、凡得瓦尔力相互相用（van der Waals interaction)、疏水性相互作用、磁性和其组合。
[0019] β-径基脂肪酸键结构域:如本文所使用的术语巧-径基脂肪酸键结构躁'是指将β-径基脂肪酸共价连接到氨基酸W形成酷基氨基酸的多肤结构域。所属领域的技术人员已知 多种β-径基脂肪酸键结构域。然而，不同β-径基脂肪酸键结构域通常对一种或多种β-径基 脂肪酸呈现特异性。作为一个非限制性实例，来自表面活性素合成酶的β-径基脂肪酸键结 构域对β-径基肉豆違酸(其在脂肪酸链中含有13到15个碳)具有特异性。因此，来自表面活 性素合成酶的0-径基脂肪酸键结构域可根据本发明用于构筑经工程改造的多肤，其适用于 产生包含脂肪酸β-径基肉豆違酸的酷基氨基酸。
[0020] β-径基脂肪酸：如本文所使用的术语"β-径基脂肪酸"是指在脂肪酸链的β位置处 包含径基的脂肪酸链。如所属领域的技术人员所理解，0位置对应于脂肪酸链的第Ξ个碳， 第一个碳是簇酸醋基团的碳。因此，当关于本发明的酷基氨基酸使用时，其中脂肪酸的簇酸 醋部分已共价连接到氨基酸的氮，β位置对应于碳，两个碳从具有碳的醋基团移除。根据本 发明使用的β-径基脂肪酸可在脂肪酸链中含有任何数目的碳原子。作为非限制性实例，β-径基脂肪酸可含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、3、14、15、15、16、17、18、19、20 个或更多个碳 原子。根据本发明使用的β-径基脂肪酸可含有直链碳链，其中除末端碳原子和连接到氨基 酸的氮的碳W外，链中的每个碳直接共价连接于两个其它碳原子。或者或另外，根据本发明 使用的0-径基脂肪酸可含有分支链碳链，其中链中的至少一个碳直接共价连接于Ξ个或更 多个其它碳原子。根据本发明使用β-径基脂肪酸可在相邻碳原子之间含有一或多个双键。 或者，根据本发明使用的β-径基脂肪酸可在相邻碳原子之间仅含有单键。可根据本发明使 用的非限制性示例性β-径基脂肪酸是或包含β-径基，在脂肪酸链中含有13到15个碳的酸； 在一些实施例中，可根据本发明使用的示例性β-径基脂肪酸是或包含肉豆違酸，肉豆違通 常用于意指14个碳。所属领域的技术人员将知道可根据本发明使用的不同β-径基脂肪酸。 可根据本发明使用对其它0-径基脂肪酸(例如天然或非天然存在的0-径基脂肪酸)呈现特 异性的不同β-径基脂肪酸键结构域W产生实践者选择的任何酷基氨基酸。
[0021] 特征性序列元件:如本文所用，短语"特征性序列元件"是指聚合物中（例如多肤或 核酸中）可见的表示聚合物的特征部分的序列元件。在一些实施例中，特征性序列元件的存 在与聚合物的具体活性或特性的存在或水平相关联。在一些实施例中，特征性序列元件的 存在(或不存在)将具体聚合物定义为运类聚合物的具体家族或群组的成员（或非成员）。特 征性序列元件通常包含至少两个单体(例如氨基酸或核巧酸）。在一些实施例中，特征性序 列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多 个单体(例如连续连接的单体）。在一些实施例中，特征性序列元件包括由一或多个间隔区 隔开的连续单体的至少第一和第二延伸，其长度在共有所述序列元件的聚合物中可能改变 或可能不改变。
[0022] 组合疗法:如本文中所使用，术语"组合疗法"是指其中个体同时暴露于两种或更 多种治疗剂的情形。在一些实施例中，运类药剂是同时投予;在一些实施例中，运类药剂是 依序投予;在一些实施例中，运类药剂是在重叠方案中投予。
[0023] 可比的：如本文所用，术语"可比的"是指彼此可能并非一致但充分类似W允许在 其间比较，使得可基于所观察到的差异或类似性而合理地得到结论的两种或更多种药剂、 实体、情形、条件组等。所属领域的技术人员将了解，在情形中，在待视为可比的两种或更多 种运类药剂、实体、情形、条件组的任何给定情况中需要何种程度的一致性。
[0024] 对应于:如本文中所使用，术语"对应于"通常用于表示聚合物中残基(如多肤中的 氨基酸残基或核酸中的核巧酸残基）的位置/一致性。所属领域的技术人员将了解，出于简 单性的目的，运类聚合物中的残基通常基于相关参考聚合物使用典型编号系统表示，使得 例如第一聚合物中"对应于"参考聚合物中位置190处的残基的残基无需实际上是第一聚合 物中的第190个残基，而是对应于在参考聚合物中第190号位置处发现的残基;所属领域的 技术人员易于了解如何鉴别"相应"氨基酸，包括通过使用专口针对聚合物序列比较而设计 的一种或多种市售算法。
[0025] 结构域、多肤结构域:如本文所使用的术语"结构域"和"多肤结构域"通常指即使 在从其它多肤或多肤结构域分离(例如裂解)时仍显示具体活性的多肤部分。在一些实施例 中，多肤结构域在Ξ维空间中折叠成具体离散结构。在一些实施例中，较长多肤内的多肤结 构域借助于连接子元件与所述较长多肤内的一或多个其它多肤结构域分隔开，所述连接子 元件例如可包含氨基酸的实质上非结构化延伸。在一些实施例中，所述术语是指较长多肤 中天然存在的结构域;在一些实施例中，所述术语是指经工程改造的多肤部分，其对应于运 类天然存在的多肤部分或其它参考多肤部分(例如经历史工程改造的部分)和/或展示与运 类天然存在的多肤部分或其它参考多肤部分的显著同源性和/或一致性。在一些实施例中， 对应于天然存在的或其它参考部分和/或展示与天然存在的或其它参考部分的显著同源性 和/或一致性的经工程改造的结构域共有特征结构（例如主要结构，如结构域的氨基酸序 列，和/或第二、第Ξ、第四等结构）；或者或另外，运类经工程改造的结构域可呈现其与其参 考多肤部分共有的一种或多种不同功能。如所属领域的技术人员将了解，在许多情况下，多 肤是模块化并且包含一或多个多肤结构域;在一些运类实施例中，每个结构域呈现一种或 多种有助于多肤的整体功能的不同功能。在一些实施例中，所属领域的技术人员已知许多 运类结构域的结构和/或功能。
[0026] 工程改造:如本文所使用的术语"工程改造"是指通过人力产生的非天然存在的部 分。举例来说，关于多肤，"经工程改造的多肤"是指通过人力设计和/或产生的多肤。在一些 实施例中，经工程改造的多肤具有氨基酸序列，其包括一或多个在自然界中不存在的序列 元件。在一些实施例中，经工程改造的多肤具有氨基酸序列，其包括一或多个在自然界中存 在、但在经工程改造的多肤中W与其在自然界中不同的序列情形(例如与其在自然界中所 连接的至少一个序列分隔开和/或与其在自然界中不连接的至少一个序列元件连接)存在 的序列元件。在一些实施例中，经工程改造的多肤是其中天然存在的序列元件与其在自然 界中相关联(例如连接)的序列分隔开的多肤和/或W其它方式操作W包含自然界中不存在 的多肤。在各种实施例中，经工程改造的多肤包含两个或更多个共价连接的多肤结构域。典 型地，运类结构域将通过肤键连接，但本发明不限于包含通过肤键连接的多肤结构域的经 工程改造的多肤，并且涵盖所属领域的技术人员已知的其它共价键。经工程改造的多肤的 一或多个共价连接的多肤结构域可天然存在。因此，在某些实施例中，本发明的经工程改造 的多肤包含两个或更多个共价连接的结构域，其中至少一个是天然存在。在某些实施例中， 两个或更多个天然存在的多肤结构域共价连接W产生经工程改造的多肤。举例来说，来自 两个或更多个不同多肤的天然存在的多肤结构域可共价连接W产生经工程改造的多肤。在 某些实施例中，经工程改造的多肤的天然存在的多肤结构域在自然界中共价连接，但在经 工程改造的多肤中W与结构域在自然界中的连接方式不同的方式共价连接。举例来说，同 一个多肤中天然存在、但通过一或多个介入氨基酸残基分隔开的两个多肤结构域可直接共 价连接(例如通过移除介入氨基酸残基），w便产生本发明的经工程改造的多肤。或者或另 夕h同一个多肤中天然存在的直接共价连接在一起(例如不由一或多个插入氨基酸残基分 隔开)的两个多肤结构域可间接共价连接(例如通过插入一或多个介入氨基酸残基），w便 产生本发明的经工程改造的多肤。在某些实施例中，经工程改造的多肤的一或多个共价连 接的多肤结构域可不天然存在。举例来说，运类多肤结构域可本身经工程改造。
[0027] 脂肪酸键结构域:如本文所使用的术语"脂肪酸键结构域"是指将脂肪酸共价连接 到氨基酸W形成酷基氨基酸的多肤结构域。在一些实施例中，脂肪酸键结构域是缩合结构 域;在一些实施例中，运类脂肪酸键结构域是具有至少一个或仅一个腺巧酷化结构域、硫醇 化结构域或其两者的单个多肤或多肤复合物的一部分。本领域中已知多种脂肪酸键结构 域，如例如存在于产生脂肤的不同肤合成酶复合物中的脂肪酸键结构域。在某些实施例中， 脂肪酸键结构域将0-径基脂肪酸连接到氨基酸;在一些实施例中，脂肪酸键结构域将0-氨 基脂肪酸连接到氨基酸;在一些实施例中，脂肪酸键结构域将0位置处未经修饰的脂肪酸连 接到氨基酸。在一些实施例中，脂肪酸键结构域催化脂肪酸和氨基酸的缩合，使得形成其两 者的酷胺，例如在脂肪酸上的簇酸部分与氨基酸上的氨基部分之间。
[0028] 同源性:如本文中所用，术语"同源性"是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA 分子和/或RNA分子)之间和/或多肤分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合分 子的序列是至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85 %、90 %、95 %或99 % -致，那么认为所述分子彼此"同源"。在一些实施例中，如果聚合分 子的序列是至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 S5 %、90 %、95 %或99%类似(例如在相应位置处含有具有相关化学特性的残基），那么认为 所述分子彼此"同源"。举例来说，如所属领域的技术人员众所周知，某些氨基酸通常分类为 彼此类似，如"疏水性"或"亲水性"氨基酸，和/或如具有"极性"或"非极性"侧链。相同类型 的一种氨基酸对另一种氨基酸的取代通常被视为"同源"取代。典型氨基酸分类概述如下：
[0029]
'[0031]如所属领域的技术人员将了解，I存在多种可用于序列比较W确定其同源程度的算 法，包括在考虑不同序列中那些残基彼此"对应"时，通过允许一个序列中相对于另一个序 列的指定长度间隙。两个核酸序列的同源性百分比的计算可通过出于最佳比较目的而对准 两个序列来进行(例如可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中W便最佳对准 且出于比较目的可W忽略非对应序列）。在某些实施例中，出于比较目的所对准的序列长度 是参考序列长度的至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少 90%、至少95%或实质上100%。接着比较相应核巧酸位置的核巧酸。当第一序列中的位置 由与第二序列中对应位置相同的核巧酸占据时，那么分子在所述位置处一致；当第一序列 中的位置由与第二序列中对应位置类似的核巧酸占据时，那么分子在所述位置处类似。两 个序列之间的同源性百分比与所述序列共有的一致和类似位置的数目有关，并且考虑最佳 对准两个序列需要引入的间隙的数目和每个间隙的长度。适用于确定两个核巧酸序列之间 的同源性百分比的代表性算法和计算机程序包括例如使用PM120加权残基表、空位长度罚 分是12和空隙处罚是4的迈尔和米勒(]\feyers and Miller)算法(CABI0S，1989,4:11-17)， 其已并入ALIGN程序（2.0版）中。或者，可W例如使用GCG软件包中的GAP程序，使用 NWSgapdna. CMP矩阵确定两个核巧酸序列之间的同源性百分比。
[003引一致性:如本文中所用，术语"一致性"是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA 分子和/或RNA分子)之间和/或多肤分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合分 子的序列是至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%或99%-致，那么认为所述分子彼此"实质上一致"。如所属领域的技术人 员将了解，存在多种可用于序列比较W确定其同源程度的算法，包括在考虑不同序列中那 些残基彼此"对应"时，通过允许一个序列中相对于另一个序列的指定长度间隙。两个核酸 序列的一致性百分比的计算可通过出于最佳比较目的而对准两个序列来进行(例如可将间 隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中W便最佳对准且出于比较目的可W忽略非 对应序列）。在某些实施例中，出于比较目的所对准的序列长度是参考序列长度的至少 30 %、至少40%、至少50%、至少60 %、至少70 %、至少80%、至少90%、至少95 %或实质上 100%。接着比较相应核巧酸位置的核巧酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位 置相同的核巧酸占据时，那么分子在所述位置是一致的。两个序列之间的一致性百分比与 所述序列共有的一致位置的数目有关，并且考虑最佳对准两个序列需要引入的间隙的数目 和每个间隙的长度。适用于确定两个核巧酸序列之间的一致性百分比的代表性算法和计算 机程序包括例如使用PAM120加权残基表、空位长度罚分是12和空隙处罚是4的迈尔和米勒 (M巧ers and Miller)算法(CABIOS, 1989,4:11-17)，其已并入ALIGN程序（2.0版）中。或者， 可W例如使用GCG软件包中的GA