用于通过n-酰基或n-胍基保护的1,4-丁二胺前体制备1,4-丁二胺的方法
【专利说明】用于通过N-酿基或N-胍基保护的1,4- 丁二胺前体制备 1,4-丁二胺的方法
[0001 ] 本申请是申请号为201080032668. 4的中国专利申请的分案申请，原申请是国际 申请PCT/EP2010/060480的中国国家阶段申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于制备1，4-二氨基丁烷[DAB]的方法，所述方法涉及至少一个生物 催化步骤。
【背景技术】
[0003] 化合物DAB是一种重要的原材料，用于生产一些主要的工程塑料：聚酰胺-4, 6， 所述聚酰胺_4,6是均聚物的形式，或是共聚物，例如与约5wt. %的聚酰胺-6单体 (己内酰胺）的共聚物。均聚物聚酰胺-4, 6(尼龙_4,6)早在1938年已被描述过 (US-A-2, 130, 948,Carothers)。其为单体DAB和己二酸的缩聚产物。目前，特别地，聚酰 胺-4, 6化合物被荷兰的DSM生产并以商品名STANYX?出售。
[0004] 对DAB的合成而言，已知大量化学途径。这些化学途径受累于下述缺点：起始材料 必须得自被认为是不可更新的来源。然而，存在提供从可更新的碳源开始并使用生物化学 方法（也称作"生物转化"）合成DAB的新的可行途径的重大需要。
[0005] 涉及至少一个发酵步骤的用于制备DAB的方法已描述于作为W02006/005603和 W02006/00504公开的PCT申请中。两个文件均描述了在具有提高的鸟氨酸脱羧酶活性水平 的微生物中发酵生产DAB。
[0006] 本发明的方法涉及用于制备DAB的替代性方法。根据本发明的方法涉及至少一个 生物催化步骤，所述生物催化步骤包括生物催化生产至少一种DAB的N-保护的前体，随后 将所述N-保护的前体体外转化成DAB。
[0007] 已经发现在生物催化生产后回收DAB遇到了相当大的困难。在W02007/079944中 描述了对有机胺（例如DAB)的回收。在本文所述的一个特别的实施方案中，将含有胺的硫 酸盐或磷酸盐（因此例如为DAB-重硫酸盐）的无细胞发酵液浓缩，并添加碱（例如氨）。 根据条件形成两层体系。可以从主要含有有机化合物的层中回收想要的胺。
【发明内容】
[0008] 根据一个实施方案，用于制备DAB的方法涉及至少一个生物催化步骤，并且包括 以下步骤：(a)以生物催化的方式制备DAB的N-保护的前体，得到含有DAB的N-保护的前 体的生物催化反应混合物，b)从生物催化反应混合物中回收N-保护的前体，和c)将N-保 护的前体转化成DAB。
[0009] 根据一个特别的实施方案，用于生产DAB的本发明涉及至少一个生物催化步骤， 所述生物催化步骤包括以生物催化的方式生产至少一种DAB的N-保护的前体，所述DAB的 N-保护的前体选自由N5-保护的鸟氨酸、N-保护的DAB和N-保护的4-氨基丁醛组成的组， 随后将所述N-保护的前体体外转化成DAB。
[0010] "体外转化"在本文中表示在细胞外的介质中将DAB的N-保护的前体转化成DAB。 体外转化可以是至少一种生物催化剂催化的转化，或者可以是涉及至少一个化学步骤的化 学转化，或者可以是至少一个生物催化步骤和至少一个化学步骤的组合。
[0011] "DAB的N-保护的前体"在本文中表示下述化合物，所述化合物含有保护的氨基， 并且可以通过至少一个化学反应或生物催化反应或通过化学反应与生物催化反应的组合 被转化成DAB。
[0012] "N5-保护的鸟氨酸"在本文中表示在其N5原子上具有保护基的鸟氨酸分子； "N-保护的DAB"在本文中表示在其一个氨基上具有保护基团的DAB分子；"N-保护的4-氨 基丁醛"在本文中表示在氨基上具有保护基的4-氨基丁醛。
[0013] 上文所述的保护基可选自由具有1-6个碳原子的酰基种类组成的组，或者可以是 胍基。应当选择这样的保护基，以允许至少以下之一：生物催化生产，易于从生物催化反应 混合物（例如发酵液）中回收N-保护的前体，和随后进行生物催化反应和/或反应，以最 终生产DAB。
[0014] 可以通过例如4-氨基丁醛或鸟氨酸的酰化来制备DAB的N-保护的前体。例如， 通过在甲酸中用乙酸酐酰化以引入甲基保护基，或通过C2-C6羧酸酐或酰氯的反应以分别 引入N-乙酰基、N-丙酰基、N- 丁酰基、N-戊酰基或N-己酰基。
[0015]N-胍基保护的前体是例如生成蛋白质的精氨酸或N-胍基-氨基丁醛或N-胍 基-DAB。发酵途径描述于例如EP1260588,所述文献描述了在精氨酸脱羧酶的影响下从精 氨酸以生物化学方式生产胍丁胺（agmatine)。胍丁胺是N-胍基-保护的DAB。胍丁胺 (N-胍基-保护的DAB)可以通过酸水解，例如通过在水性浓矿物酸溶液（例如浓盐酸或浓 硫酸）中回流胍丁胺而被顺利地去保护成DAB。这产生了DAB二酸盐和副产物二氧化碳和 氨（后者是其使用的矿物酸的铵盐形式）。为了获得游离胺形式的DAB，应当将形成的二酸 盐分离、再溶解并用碱中和。
[0016] 根据又一个特别的实施方案，本发明涉及用于制备DAB的方法，其中生产至少一 种DAB的N-保护的前体，所述N-保护的前体选自由N5-乙酰基鸟氨酸、N-乙酰基DAB和N-乙酰基4-氨基丁醛组成的组。
[0017] 根据一个特别的实施方案，涉及至少一个生物催化步骤的用于制备DAB的方法包 括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备N5-乙酰基鸟氨酸，得到含有N5-乙酰基鸟氨酸的 生物催化反应混合物，（b)从生物催化反应混合物中回收N5-乙酰基鸟氨酸，和（c)将N5-乙 酰基鸟氨酸转化成DAB。
[0018] 根据一个特别的实施方案，涉及至少一个生物催化步骤的用于制备DAB的方法包 括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备N-乙酰基DAB，得到含有N-乙酰基DAB的生物催 化反应混合物，（b)从生物催化反应混合物中回收N-乙酰基DAB，和（c)将N-乙酰基DAB 转化成DAB。
[0019] 根据一个特别的实施方案，涉及至少一个生物催化步骤的用于制备DAB的方法包 括以下步骤：(a)以生物催化的方式制备N-乙酰基4-氨基丁醛，得到含有N-乙酰基4-氨 基丁醛的生物催化反应混合物，（b)从生物催化反应混合物中回收N-乙酰基4-氨基丁醛， 和（c)将N-乙酰基4-氨基丁醛转化成DAB。
[0020] 在本文中明确或暗示地涉及胺或N-保护的胺（例如N-保护的DAB)时，这些术语 旨在包括中性氨基、相应的带电荷的质子化胺及其盐。
[0021]
[0022] 除非另有说明，在本文中使用时，术语"或"被定义为"和/或"。
[0023] 除非另有说明，在本文中使用时，术语"一个"（"a"或"an"）被定义为"至少一 个"。
[0024] 提及单数名词（例如化合物、添加剂等）时，复数旨在被包括在内。
[0025] 提及存在立体异构体的化合物时，化合物可以是所述立体异构体中的任何或其组 合。因此，提及例如存在对映异构体的氨基酸时，氨基酸可以是L-对映异构体或D-对映异 构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是天然立体异构体。
[0026] 参考括号中的酶种类（EC)提及酶时，酶种类是以NomenclatureCommitteeof theInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB)所提供 的酶命名法（EnzymeNomenclature)为基础将酶分类或可以分类的种类，所述命名法可在 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.得至lJ〇 (尚）未归入特定种类但是可以如 此被归类的其他合适酶旨在被包括在内。
[0027] 术语"同源的"或"同源物"或"直系同源物"是指具有功能关系并且通常基于序列 同一性程度被测定的相关序列。这些术语可描述在一个物种、亚种、变种、栽培种或菌株中 存在的基因与在其他物种、亚种、变种、培养种或菌株中的等同基因之间的关系。它们也可 以描述天然存在的基因与人工构建的基因之间，或两个人工构建的基因之间的关系。功能 关系可以通过大量方式中的任何一种来指明，包括但不限于（a)序列同一性程度；(b)相同 或相似的生物功能。优选地，（a)和（b)均被指明。术语同源物还旨在包括由于遗传密码 的简并性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列（多核苷酸序列）。
[0028] 在本文中任何一处涉及多肽使用术语"同源物"旨在表示与参照多肽具有相同或 相似的生物功能以及一定程度的序列同一性的多肽。特别地，其旨在表示至少30%，优选 地至少40 %，更优选地至少60 %，更优选地至少65 %，更优选地至少70 %，更优选地至少 75 %，更优选地至少80 %，特别地至少85 %，更特别地至少90 %，至少91 %，至少92 %，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
[0029] "序列同一性"或"序列相似性"在本文中被定义为两条或更多多肽序列或两条或 更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序 列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，"同一性" 或"相似性"也表示多肽序列或核酸序列之间之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列 之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大 匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序 方法包括BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F.etal.，J.Mol.Biol. 1990, 215,403-410)，公众 可以从NCBI和其它来源（BLASTManual，Altschul，S.，etal.，NCBINLMNIHBethesda， MD20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10. 0,缺口延伸0. 5， Blosum62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10. 0,缺口延伸 0. 5,DNA全矩阵（DNA同一性矩阵）。
[0030] "生物转化"或"生物催化反应"在本文中表示其中使用酶作为催化剂的生物化学 反应。根据本发明，其表示使用生物催化剂，方法中至少一个反应步骤由生物材料或源自生 物来源的部分（例如生物或源自生物的生物分子）催化。特别地，生物转化可以是发酵步 骤。生物催化剂可特别地包括一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一个特 别的实施方案中，使用作为下述形式的一种或多种酶：溶液、乳液、分散液、冻干细胞（的悬 浮液），作为溶胞产物或固定在支持物上的，分离自天然环境（分离自生产它的生物）的。 在一个实施方案中，一种或多种酶构成活生物的部分（例如活的全细胞）。酶可在细胞内发 挥催化功能。酶可被分泌进其中存在细胞的培养基中也是有可能的。
[0031] "生物催化反应混合物"在本文中表示其中发生生物催化反应的环境。其可以是细 胞环境（对细胞内或细胞外的生物催化反应而言），或是无细胞环境。
[0032] "发酵步骤"在本文中表示其中在单细胞宿主中，更特别地在细胞培养物中的微生 物中发生特别的化学实体的形成或转化的方法步骤。"发酵制备"在本文中表示在含有可发 酵的碳源的细胞培养物中，在包含生物催化剂的微生物中生产具体化学实体，其中所述碳 源含有要被转化成要制备的特别化学实体的任何所述化合物，或其中细胞将要被转化的化 合物制备成要由碳源制备的特别化学实体。微生物可以是特别化学实体的天然生产者，或 者可以使用重组DNA技术，通过用编码至少一种合适酶的基因转化而获得了生产特别化学 实体的能力。也可以使用重组DNA技术，用编码至少一种合适酶的基因转化特别化学实体 的天然生产者，从而提高想要的特别化学实体的生产，和/或消除下述组分的生产，所述组 分可能干扰想要的特别化学实体生产力，或可能干扰根据本发明方法中的其他步骤。
[0033]用于发酵制备DAB的N-保护的前体的优选的微生物可以是真核或原核来源的。特 别地，其可选自动物（包括人）细胞，植物细胞，细菌，古细菌，酵母和真菌。更特别地，微生 物可以选自由细菌、酵母、真菌组成的组，所述细菌例如是Bacillus(特别是B.subtilis)， Brevibacterium(特别是B.ketoglutamicum)，corynebacteria(特别是C.glutamicum)， Escherichia(特别是E.coli)，Klebsiella(特别是K.pneumoniae)，lactobacilli(特 别是L.lactis)，propionibacterium，pseudomonas(特别是P.putida)，Rodococcus(特 别是R.erythropolis)，Streptomyces(特别是S.coelicor和S.clavuligerus)，所述酵 母例如是Kluyveromyces(特别是K.lactis)，Penicillium(特别是P.chrysogenum)， Saccharomyces(特别是S.cerevisiae)，Aspergillus(特别是A.niger)，Pichia(特别 是P.pastoris)，Hansenula，Schizosaccharomyces(特