一种辅酶再生系统及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种辅酶再生系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 相较于传统的化学催化，生物催化因其酶催化反应的高度的化学选择性，区域选 择性和立体选择性等优势而备受关注和研究。其中由于氧化还原酶的高效性和特异性等， 它们在生物合成中占据相当重要的地位。氧化还原酶能选择性的催化含羰基，醛类及酮类 化合物。氧化还原酶作为催化剂制备手性化合物，合成产物的同时会消耗掉一定量的辅酶。 例如：黎舒婷等用三甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸，合成中使用亮氨酸酶与甲酸脱氢酶偶联 体系，甲酸脱氢酶可以是辅酶I再生，产物的转化率可以达到82%。
[0003] 不像其它的酶类，在生物转化反应中，辅酶与底物的关系只是化学计量的关系。辅 酶是一种消耗性的化合物，不像氧化还原酶一样可以重复利用，在反应中作为氢的供体，反 应结束后辅酶以氧化态形式存在。而这些辅酶往往比所制备的产品的价格还要昂贵，稳定 性比较差，难以重复利用，导致了工业化生产中反应成本的高昂，从而限制了氧化还原酶的 使用。在工业化生产中，不可能投加大量的辅酶，所以高效的辅酶再生系统的构建和辅酶的 反复使用是当下必须解决的问题。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于开发一种简单、高效的辅酶再生技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种辅酶再生系统。
[0006] 本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
[0007]-种辅酶再生系统，包括甲酸脱氢酶（formatedehydrogenase，FDH)、亮氨酸脱氢 酶（leucinedehydrogenase，LDH)和甲酸铵。
[0008] 根据本发明的一个实施例，所述的辅酶再生系统还包括NAD+和/或NADH。
[0009] 根据本发明的一个实施例，所述的辅酶再生系统还包括磷酸吡哆醛。
[0010] 根据本发明的一个实施例，所述的辅酶再生系统中的甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶 来自基因工程菌发酵液，并且所述基因工程菌同时表达甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶。
[0011] 根据本发明的一个实施例，所述基因工程菌为同时表达甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢 酶的E.coliBL21(DE3)菌株。
[0012] 本发明的另一方面是提供一种辅酶再生系统的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0013] (1)甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的异源表达
[0014] 构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌，经发酵制得含FDH和LDH的酶液；
[0015] (2)配制辅酶再生系统
[0016] 在缓冲液中配制辅酶再生系统，所述辅酶再生系统包括：所述含FDH和LDH的酶 液、甲酸铵、NAD+、和磷酸吡哆醛。
[0017] 根据本发明的一个实施例，其中步骤（1)中包括以下步骤：
[0018] (a)构建FDH载体
[0019] 将FDH基因连入使用核酸内切酶NdeI和XhoI双酶切的pET28a载体，构建得到 重组表达FDH的质粒pFDH-pET28a;
[0020] (b)构建LDH载体
[0021] 将LDH基因连入使用核酸内切酶XhoI和NdeI双酶切的pET21a载体，构建得到 重组表达质粒pLDH-pET21a;
[0022] (c)构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌
[0023]将质粒pFDH-pET28a和质粒pLDH-pET21a共转入E.coliBL21 (DE3)，得到共表达 FDH与LDH的菌株E.coliBL21-FDH/LDH。
[0024] 根据本发明的一个实施例，该方法还包括以下步骤：
[0025] (d)发酵所述菌株E.coliBL21-FDH/LDH，制备所述含FDH和LDH的酶液
[0026] 将共表达菌株E.coliBL21-FDH/LDH在含Amp和Kan的LB液体培养基中培养，加 入IPTG至终浓度为0. 01~0. 05mmol/L，16~27°C诱导表达12~20h，发酵液经菌体破壁 后离心取上清即得所述FDH/LDH共表达酶液。
[0027] 根据本发明的一个实施例，其中步骤（a)中以假丝酵母总DNA为模板，分别以上下 游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，其中：
[0028]上游引物为 5 ' -AAACATATGAAAATCGITCTCGITITGTACTCC-3 '，其中，划线处为NdeI 酶切位点；下游引物为5'-AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3'，其中，划线处为Xhol酶切 位点。
[0029] 根据本发明的一个实施例，其中加入IPTG至终浓度为0.02mmol/L，诱导温度为 22°C，诱导表达时间为16h，发酵液经菌体破壁后离心取上清即得所述FDH/LDH共表达酶 液。
[0030] 本发明的优点是：本发明的辅酶再生系统，辅酶再生效率高，制备方法简单方便， 极大地降低了辅酶反应的成本，适用于大规模的工业化应用。
【附图说明】
[0031] 图1显示了构建质粒pFDH-pET28a的示意图；
[0032] 图2显示了pTD_pET28a的酶切验证图，泳道1TD的PCR扩增产物，泳道 2pTD-pET28a重组质粒酶切验证；
[0033] 图3显示了pFDH-pET28a的酶切验证图，泳道1FDH的PCR扩增产物，泳道 2pFDH-pET28a重组质粒酶切验证；
[0034] 图4显示了pLDH_pET21a的酶切验证图，泳道lpLDH_pET21a重组质粒酶切验证， 泳道2酶切获得的LDH片段。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例是对本发明的详细说明。应当理解，以下所述仅为本发明的优选实施 例，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对本发明进行修改和等同替换均应涵盖在本 发明的范围之内。
[0036]在下文中列出本发明所用的实验原料。
[0037] 表1实验质粒
[0038]
[0041] 表3实验中所用到的PCR引物
[0042]
[0043] 表4实验试剂
[0044]
[0045] 培养基
[0046] LB液体培养基/g?L1:蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7. 0。
[0047]LB固体培养基/g?LS蛋白胨10,酵母提取物5,氯化钠10,琼脂条20,pH7. 0。
[0048] 主要溶液和缓冲液
[0049] ⑴质粒抽提相关溶液：
[0050]SolutionI:0? 2973g葡萄糖，0? 091gTris，0? 112gEDTA定容至 30mL。
[0051] SolutionII(新鲜配置）：0?2mol/L NaOH，1% SDS〇
[0052]SolutionIII:44. 163g乙酸钾，17. 25mL冰醋酸定容至 150mL。
[0053] ⑵5〇XTAE(电泳缓冲液）（/L)
[0054] 242gTris57.lmL醋酸，lOOmLEDTA(0. 05mol/L) 〇
[0055] 实施例1 :PCR扩增目的基因
[0056] (l)PCR扩增引物
[0057] 根据甲酸脱氢酶（FDH)苏氨酸脱氨酶（TD)基因序列（Genbanknumber: XM_001525495和AAB18593)及其前后序列设计引物。经过筛选验证，最佳的甲酸脱氢酶 (FDH)上游引物为 5' -AAACATATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTACTCC-3' (划线处为Ndel酶切位 点）；下游引物为 5' -AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3' (划线处为Xhol酶切位点）。 根据苏氨酸脱氨酶的基因序列（AAB18593)设计上下游引物，经过筛选验证，最佳的上游引 物为5' -AAAAAGCTTGTTAGCAGCCGGATCTCAG-3?(划线处为Hindlll酶切位点）；下游引物为 5' -AAACATATGGTATTAAAACAAATTCTTC-3' (划线处为Ndel酶切位点）。
[0058] 以假丝酵母和大肠杆菌总DNA为模板，分别以上下游引物扩增得到FDH和TD基因 片段。
[0059] (2)PCR反应体系
[0060]PrimeSTARHSDNA聚合酶PCR反应体系如表5所示。
[0061] 表5PCR反应体系
[0062]
[0063] (3)PCR反应程序
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