N-β-咔啉-3-甲酰基-N’-氨基酸酰基肼,其纳米结构,活性和应用
【专利摘要】本发明公开了利用发明人建立的P-选择素的平均结构的活性口袋对接获得的2种N-β-咔啉-3-甲酰基-N’-氨基酸酰基肼(R为羟甲基时氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基，R为1H-咪唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基)，公开了它们的纳米结构，公开了它们对血小板表达P-选择素的抑制作用，因而公开了它们在制备P-选择素抑制剂中的应用。
【专利说明】
Ν- β -咔啉-3-甲酿基-Ν' -氨基酸酿基肼，其纳米结构，活 性和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分析发明人建立的Ρ-选择素平均结构的活性口袋对小分子配体的结 构要求，用DS软件将具有抗血栓活性的小分子与Ρ-选择素的平均结构的活性口袋对接， 搜寻符合平均结构的活性口袋空间要求的已知抗血栓小分子，锁定下式的2种Ν-β -咔 啉-3-甲酰基-Ν'-氨基酸酰基肼（R为羟甲基时氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基，R为1Η-咪 唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基），涉及它们的纳米结构，涉及它们对血小板表达 Ρ-选择素的抑制作用，因而本发明阐明了它们在制备Ρ-选择素抑制剂中的应用。本发明属 于生物医药领域。
[0002]
技术背景
[0003] Ρ-选择素以溶解型Ρ-选择素（又称sP-selectin)和不溶型Ρ-选择素（又 称P-selectin)两种形态存在。正常状态下的不溶型P-选择素储存在血小板的α-粒 (a-granule)中。在血小板活化状态下，形成血栓的刺激使细胞外吐作用（exocytosis)驱 使含不溶型P-选择素的α-粒从血小板的内膜层快速移动到活化的血小板的表面膜。在 血小板表面膜上不溶型Ρ-选择素表达，切割并转化为溶解型Ρ-选择素进入血液循环。目 前知道，血液循环中溶解型Ρ-选择素水平升高与炎症，血栓，癌症，以及癌转移等多种致命 性疾病的发病有关。目前公认，寻找溶解型Ρ-选择素的单纯性抑制剂（以下简称Ρ-选择 素抑制剂），是新药研究的重要领域。至今没有成功的案例。
[0004] 发明人长期从事抗血栓药物研究，了解有多种病理途径可导致血栓。大多数业内 认为，血小板表面糖蛋白受体GPIIb/IIIa活化，是血栓形成的最后通路。发明人知道，这 是不完整的认识。实际上，血栓包括两种。一种是由血小板通过纤维蛋白原与血小板交联 构成的血栓，即血小板-纤维蛋白原 -血小板（platelet-fibrinogen-platelet，PFP)型 血栓，由GPIIb/IIIa活化引起。一种是由血小板通过纤维蛋白原与白血球交联构成的血 栓，BP血小板-纤维蛋白原-白细胞（platelet-fibrinogen-leukocyte，PFL)型血栓，由 血小板释放到血液中的溶解型P-选择素引起。与GPIIb/IIIa抑制剂一样，P-选择素抑制 剂是抗血栓药物的成员。寻找P-选择素抑制剂，需要使用的理论模型。于是，发明人在 国际上第一个公开了图1的可用于计算机筛选P-选择素抑制剂的P-选择素的平均结构 (见 Haimei Zhu, Yuji Wang, Ming Zhao, Jianhui ffu, Xiaoyi Zhang, Guodong Yang, Shiqi Peng, Energy minimized crystal structures of P-selectins based on molecular dynamics simulation ：Leading to two average structures capable of designing anti-thrombotic agents.MedChemComm 2013,4，1066_1072)。虽然发明人曾经利用P-选 择素的晶体结构加糖蛋白受体GPIIb/IIIa筛选到下面结构的双重抑制剂，但是它们并不 是溶解型P-选择素的单纯性抑制剂。此外，它们的结构也不能够整体性地对接到可用于计 算机筛选P-选择素抑制剂的P-选择素的平均结构的活性口袋之中。
[0005]
[0006] 结构式中AA^L-Tyr残基时，AA2SL-Phe残基，或L-Ser残基，或L-Val残基；式 中AAiS L-Leu残基时，AA 2为L-Phe残基，或L-Ser残基，或L-Val残基；式中AA L-Pro 残基时，AA2S L-Phe残基，或L-Ser残基，或L-Val残基。
[0007] 发明人将自己发明的数百种具有抗血栓活性的化合物与发明人在国际上公开的 可用于计算机筛选p-选择素抑制剂的p-选择素平均结构的活性口袋对接，锁定下面结构 的N-β -咔啉-3-甲酰基-Ν'-氨基酸酰基肼（R为羟甲基时氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基， R为1Η-咪唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基）是溶解型Ρ-选择素的单纯性抑制剂。 于是，发明人提出了本发明。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的第一个内容是分析发明人建立的Ρ-选择素平均结构的活性口袋对小分 子配体的结构要求，用DS软件将具有抗血栓活性的小分子与Ρ-选择素的平均结构的活性 口袋对接，搜寻符合平均结构的活性口袋空间要求的已知抗血栓小分子，锁定下式的抗血 栓化合物Ν- β -咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼（R为羟甲基时氨基酸酰基为L-丝氨 酸酰基，R为1Η-咪唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基）是优秀的配体，因而是优秀 的Ρ-选择素抑制剂。
[0010]
[0011] 本发明的第二个内容是评价Ν-β-咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼（R为羟 甲基时氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基，R为1Η-咪唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基） 对血小板表达溶解型Ρ-选择素的抑制作用。
[0012] 本发明的第三个内容是测定Ν-β-咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼（R为羟 甲基时氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基，R为1Η-咪唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基） 的纳米结构。
【附图说明】
[0013] 图1.本发明P-选择素抑制剂的结构图。
[0014] 图2.发明人在国际上公开的可用于计算机筛选P-选择素抑制剂的P-选择素 1 (暗绿色）和2 (绿色）的平均结构及SLex的结合位点.Ca2+用橘黄色球表示。
[0015] 图3.发明人在国际上公开的可用于计算机筛选P-选择素抑制剂的P-选择素的 平均结构的活性口袋的要求的小分子配体的药效团模型。
[0016] 图4. N- β -咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼（R为羟甲基时氨基酸酰基为L-丝 氨酸酰基，R为1Η-咪唑-4-基时氨基酸酰基为L-组氨酸酰基）与药效团模型匹配最好。
[0017] 图5·Ν-(1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基）-Ν' -组氨基酸酰基肼（R为1Η-咪 唑-4-基，左）和Ν-α-甲基-β-咔啉-3-甲酰基）-Ν' -丝氨基酸酰基肼（R为羟甲基， 右）与Ρ-选择素的平均结构的活性口袋对接的细节。
[0018] 图6.Ν-β_咔啉-3-甲酰基-Ν' -L-组氨酸酰基肼氨基酸酰基肼（R为1Η-咪 唑-4-基，左）和Ν- β -咔啉-3-甲酰基-Ν' -L-丝氨酸酰基肼（右）在纯水溶液中1 X 10 6Μ 浓度下的透射电镜照片。
【具体实施方式】
[0019] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0020] 实施例1对接获得Ν- (1-甲基-β -咔啉-3-甲酰基）-Ν' -氨基酸酰基肼 [0021 ] 基于发明人建立的Ρ-选择素的平均结构的活性口袋，发明人构建了基于受体结 构的药效团模型，确认小分子配体结构应符合图2的5个药效团特征元素。，包括1个疏水 中心（1号网格球），2个氢键受体（2号网格球），以及2个正电离子中心（3号网格球）。 按照这些结构要求，对具有抗血栓活性的小分子化合物库筛选，确定Ν-β -咔啉-3-甲酰 基-Ν'-氨基酸酰基肼是符合要求的配体类型。Ν-β -咔啉-3-甲酰基-Ν'-氨基酸酰基肼 的氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基及L-组氨酸酰基与药效团模型匹配最好（见图3)。
[0022] N-(l-甲基-β-咔啉-3-甲酰基）-N' -L-丝氨酸酰基肼与N-(l-甲基-β-咔 啉-3-甲酰基）-Ν' -L-组氨酸酰基肼分别与Ρ-选择素的平均结构的活性口袋对接，对接 结果显示它们与Ρ-选择素的相互作用细节见图4。对接的细节是，它们的Γ-0与Ρ-选择 素105位的Asn残基形成氢键，4' -0与Ρ-选择素111位的Lys残基侧链ΝΗ3+形成氢键， 2' -Ν的正电荷中心与Ρ-选择素107位Glu残基的侧链羧基负电荷中心匹配，5' -Ν的正电 荷中心与P-选择素88位Glu残基的侧链羧基负电荷中心匹配，苯环与疏水中心匹配，2-N 与P-选择素82位Asn残基的侧链羰基形成氢键。另外，N-(l-甲基-β-咔啉-3-甲酰 基）-Ν' -L-组氨酸酰基肼的L-组氨酸侧链Ν的L-组氨酸侧链Ν还与Ρ-选择素84位Lys 残基侧链NH3+形成氢键，N- (1-甲基-β -咔啉-3-甲酰基）-Ν' -L-丝氨酸酰基肼的L-丝 氨酸侧链0Η还与Ρ-选择素88位Glu的侧链羧基形成氢键。
[0023] 实验例1测定N-(l-甲基-β -咔啉-3-甲酰基）_N' -氨基酸酰基肼的透射电镜 照片
[0024] 将N- (1-甲基-β -咔啉-3-甲酰基）-Ν' -氨基酸酰基肼（氨基酸酰基为L-丝氨 酸酰基，以及氨基酸酰基为L-组氨酸酰基）按照1 X 10 6M的浓度配置纯水溶液，均匀的铺 在铜网上，在透射电镜（TEM，JEM-1230, JE0L)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如 图5。结果表明，它们在水中可形成直径为20-100nm的纳米颗粒。
[0025] 实验例2测定N- (1-甲基-β -咔啉-3-甲酰基）-Ν' -氨基酸酰基肼对P-选择素 的抑制作用
[0026] 1.绘制Ρ-选择素标准曲线
[0027] 按Ρ-选择素 ELISA试剂盒（美国⑶SABIO C0)的说明书，采用逐步稀释法在96 孔酶标包被板制备P-选择素标准溶液，每孔溶液量为50 μ L, P-选择素的终浓度为600ng/ mL, 300ng/mL, 150ng/mL, 75ng/mL, 37. 5ng/mL, 18. 75ng/mL 和 9. 37ng/mL。在酶标仪上测定 〇D值。每个浓度重复2次，求平均值。绘制P-选择素标准曲线。
[0028] 2.制备血小板样品
[0029] 健康SD雄性大鼠（体重180_220g)乌拉坦麻醉后经颈动脉取血。血液用3. 8% 柠檬酸钠水溶液抗凝，每4500 μ L全血加500 μ L柠檬酸钠水溶液。血液离心20分钟 (2000-3000转/分），得到富血小板血浆。取600 μ L富血小板血浆与5400 μ L试剂盒中的 稀释液混合，得血小板样品待测定用。
[0030] 3.制备Ρ-选择素测定样品
[0031] 在PC管中将960 μ L血小板样品与20 μ L NS (空白对照）或20 μ LN-[ (1S， 3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基]-Ν' -氨基酸酰基肼（氨基酸酰基为 L-丝氨酸酰基，以及氨基酸酰基为L-色氨酸酰基）的NS溶液混合，37°C恒温培养箱内孵育 5min。然后往里加入20 μ L AA的NS溶液（0. 15g/L)，再孵育3min。
[0032] 4.测定P-选择素含量
[0033] 往96孔酶标包被板的孔底加100 μ L空白对照或100 μ L P-选择素测定样品。用 封板膜封板并置37°C恒温培养箱内孵育120min。揭掉封板膜，吸去培养液，残留的培养液 用滤纸吸干。残留物用200+100 μ L稀洗涤液（来自试剂盒中的洗涤液用蒸馏水稀释20倍） 洗，静置30秒后弃去。该洗涤操作重复5次，拍干。往空白对照孔加100yL NS，往Ρ-选 择素测定孔加100 μ L试剂盒中的生物素标记抗体。用封板膜封板并置37°C恒温培养箱内 孵育60min。揭掉封板膜，吸去培养液，残留的培养液用滤纸吸干。残留物用200+100yL 稀洗涤液（来自试剂盒中的洗涤液用蒸馏水稀释20倍）洗，静置30秒后弃去。该洗涤操 作重复3次，拍干。往残留物中加100 μ L试剂盒中的辣根过氧化物酶标记亲和素，用封板 膜封板并置37°C恒温培养箱内孵育60min。揭掉封板膜，吸去培养液，残留的培养液用滤纸 吸干。残留物用200+100 μ L稀洗涤液（来自试剂盒中的洗涤液用蒸馏水稀释20倍）洗， 静置30秒后弃去。该洗涤操作重复5次，拍干。往残留物中加90 μ L试剂盒中的底物液， 轻轻震荡混匀，37°C避光显色20min。然后每孔加50 μ L试剂盒中的终止液，终止显色反应 (蓝色转黄色）。15min之后在450ηη波长下测量各孔的吸光度（0D值），通过Ρ-选择素标 准曲线求出各孔中的Ρ-选择素含量。结果表明Ν-(1-甲基-β -咔啉-3-甲酰基）-Ν'-氨 基酸酰基肼（氨基酸酰基为L-丝氨酸酰基，简称化合物A ;以及氨基酸酰基为L-组氨酸酰 基，简称化合物B)可明显抑制P-选择素表达（表1)。
[0034] 表1化合物A和B对P-选择素表达量（I ± SD ng/ml)的影响
[0035]
[0036] η = 4 ;a)与生理盐水比 p < 0· 01。
【主权项】
1. 下面结构的P-选择素抑制剂，N-β-咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼， R为轻甲基时氨基酸SfcSiT? L-翌K刃m- μ不μ生-4-番?η、」氨基酸酰基为L-组 氨酸酰基。2. 获得权利要求1的P-选择素抑制剂，N- β -咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼的 对接方法，其特点是利用发明人建立的P-选择素的平均结构的活性口袋对接，该方法由以 下步骤构成： (1) 分析发明人建立的P-选择素平均结构的活性口袋对小分子配体的结构要求； (2) 用DS软件将具有抗血栓活性的小分子与P-选择素的平均结构的活性口袋对接，搜 寻符合平均结构的活性口袋空间要求的已知抗血栓小分子； (3) 锁定权利要求1的P-选择素抑制剂。3. 权利要求1的P-选择素抑制剂，N-β -咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼的纳米 结构。4. 权利要求1的P-选择素抑制剂，N-β -咔啉-3-甲酰基-Ν' -氨基酸酰基肼在制备 P-选择素抑制剂中的应用。
【文档编号】A61P7/02GK105884765SQ201410562154
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月20日
【发明人】彭师奇, 赵明, 朱海梅, 王玉记, 吴建辉
【申请人】首都医科大学