专利名称：一种共表达faeA和xyn11A的酵母系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β_1，4_木聚糖酶基因(xynllA)的毕赤酵母新表达系统，属于生物工程技术领域。
背景技术：
半纤维素是自然界的第二大类多糖聚合物，作为木质素和纤维素中间的连接物， 广泛存在于植物细胞壁。半纤维素的降解产物具有广泛的应用价值，因此，如何充分利用丰富的半纤维素资源成为研究的热点。已有报道表明，阿魏酸酯酶可以和其它的半纤维素酶 (如木聚糖酶)协同作用使微生物对植物细胞壁中半纤维素进行最大程度的降解。阿魏酸酯酶(E. C. 3.1.1. 73,ferulic acid esterase,FAE)又称肉桂酸酯酶,是羧酸水解酶的一个亚类，属于胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来。自1991年Faulds等首次分离出阿魏酸酯酶以来，已有超过30种阿魏酸酯酶被纯化，其主要生物功能是水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连结的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。β-1，4_内切木聚糖酶(EC 3. 2.1. 8, endo-β-1,4-xylanase) 是一类能够专一降解木聚糖为 低聚木糖和木糖的一组酶的总称，主要从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。两种酶均广泛应用于食品、医药、饲料、造纸和印染等领域。
在食品工业中可利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸杆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚糖 (主要是低聚木糖)、阿魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效率。
早期对于阿魏酸酯酶和β -1,4-内切木聚糖酶的研究多集中在产酶菌株的选育、 发酵条件的优化、酶的分离纯化、酶的理化性质、酶的复合诱变、酶的水解机理等方面。随着分子生物学研究的不断深入与完善，越来越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表达方面，如构建和筛选优良的高效基因工程菌株；基于酶结构与功能的关系，通过定点诱变改变酶活性位点，从而实现催化功能的改变，以拓宽其应用范围等。不同来源的两种酶基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母等表达系统中进行了表达。然而在毕赤酵母系统中进行共表达的研究尚未见报道。发明内容
本发明的目的是构建一种新型的共表达阿魏酸酯酶A和β -1，4-木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌。
本发明的技术方案
所设计到的pPICZ a A-faeA和pPIC9k_xynllA均为本实验室构建和保藏。
所述的重组FaeA和重组XynlIA活性的测定方法
以阿魏酸甲酯(MFA)为底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作按为移取900 μ L MFAdmM, pH 6.0)于2mL EP管中，45°C保温lOmin，加入100 μ L适当稀释的酶液，反应IOmin后加入400 μ L冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400 μ L冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件以甲醇、I %乙酸一步梯度洗脱，在IOmin内，甲醇浓度由50%上升至80% ,流速lmL/min,柱温30°C,检测波长320nm, 上样量20 μ L。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义在测定条件下(45°C、pH 6. O)每分钟产生I μ mo I阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位 ⑶。
于25mL具塞试管A和B中，各加入质量浓度为O. 5%的底物溶液2. 4mL, 50°C预热IOmin,在A管中加入O.1mL适当稀释的酶液,50°C反应IOmin ;立即各加入2. 5mL 3', 5' — 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从标准曲线上查出相应的木糖含量并折算成酶活性单位。重组XynllA活性测定底物为用pH 4. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生I μ mol还原糖所需的酶量定义为I个木聚糖酶活性单位(IU)。
所述的重组工程菌的构建方法
(l)GS115/faeA的构建、表达及活性测定用Sac I对pPICZ a A-faeA进行线性化， 按照毕赤酵母表达手册进行电转化GSl 15感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA ;按照手册上的标准流程进行诱导表达，以阿魏酸甲酯为底物，高 效液相法分析阿魏酸的释放量，测得发酵液中重组阿魏酸酯酶的酶活性。
(2)工程菌65115八^么17111认的构建用Sal I对pPIC9k_xynllA进行线性化， 按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA-XynllA ;按照手册上的标准流程进行诱导表达，分别用HPLC法和DNS法测定重组阿魏酸酯酶和重组木聚糖酶的酶活性。
本发明的有益效果本发明提供了一种新型的共表达阿魏酸酯酶基因和β-1， 4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA-XynllA的构建方法。本发明不仅实现了对双质粒体系在共表达的应用进行了有益探索，而且实现了目标酶的共同生产，降低了产物的制备成本，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1工程菌GS115/faeA的构建、表达及产物活性测定
用Sac I对pPICZ a A-faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115 感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GSl 15/man5A。该工程菌用1. 0% 甲醇诱导72h，以阿魏酸甲酯为底物，HPLC分析阿魏酸释放量，测定发酵液中重组阿魏酸酯酶活性达7. 04U/mL。SDS-PAGE电泳显示重组甘露聚糖酶分子量为36. OkDa。
实施例2工程菌GS115/faeA-XynllA的构建、表达及产物活性测定
用Sal I对pPIC9k-XynllA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化 GSl 15/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GSl 15/man5A_xynl 1A。 该工程菌用1. 0%甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达600IU/mL，重组阿魏酸酯酶活性仍为7. 04U/mL。SDS-PAGE电泳显示重组木聚 糖酶和阿魏酸酯酶分子量分别为 20. 7kDa 和 36. OkDa。
权利要求
1.一种共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β-1,4-木聚糖酶基因(xynllA)的毕赤酵母新表达系统。
2.共表达faeA和xynllA的毕赤酵母系统的构建和表达方法 (1)GS115/faeA的构建、表达及活性测定用Sac I对pPICZ a A_faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GSl 15感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA ;按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用1. 0%甲醇诱导72h，以阿魏酸甲酯为底物，高效液相法分析阿魏酸的释放量，测得发酵液中重组阿魏酸酯酶的酶活性达7. 04U/mL ； (2)工程菌GS115/faeA-xynllA的构建用SalI对pPIC9k_xynllA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA-xynllA;按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用1.0%甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达600U/mL，重组阿魏酸酯酶活性仍为7. 04U/mL ；SDS-PAGE电泳显示重组木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分别为20. 7kDa和.36. OkDa0
全文摘要
本发明提供了一种新型的共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001阿魏酸酯酶A基因和β-1，4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA-xyn11A的构建方法。所构建成的毕赤酵母共表达系统可用于的阿魏酸酯酶和β-1，4-木聚糖酶的工业化生产。所制备的两种酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N9/42GK102994542SQ20121056244
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者邬敏辰, 龚燕燕, 殷欣, 曾妍, 李剑芳 申请人:江南大学