专利名称：长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种分子生物技术领域的检测方法，包括引物、探针及其试剂盒，具体是一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的方法，针对长春碱类药物使用者基因内3个生物标记的引物、探针及其试剂盒。
背景技术：
化疗在目前是恶性肿瘤治疗的重要手段，临床化疗的效果对于肿瘤患者的治疗和提高生存期有着至关重要的影响。对于不同的患者，不同的化疗药物的效果差异很大；肿瘤患者对化疗的反应不同，很多时候是由于对化疗药物敏感性存在差异；由于临床医生往往只能凭经验对不同患者使用某种化疗药物或化疗方案，带有一定的盲目性，因此很多肿瘤患者的化疗效果并不理想，往往达不到化疗的预期目的；所以，一个能够在化疗前筛选出针对性强、患者敏感度较高化疗药物的检测方法，对于提高个体化治疗效果，提高化疗的成功率，有着重要的意义。近年来国内外肿瘤和化疗药物研究领域相继创建了一系列体内或体外预测肿瘤化疗药物敏感性的方法；常用的有裸鼠皮下移植药敏测定法、人体肿瘤细胞集落测定法、放射性标记代谢物前体掺入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速荧光分析等等；这些方法均存在一些缺点，要么费用昂贵且检测周期长，不适合常规使用；要么需要在体外培养原发肿瘤，检测成功率低；这些缺陷把肿瘤化疗药敏实验限制在了研究性的实验室里，很少有大规模使用的报道。药物基因组 学(pharmacogenomics)研究的进展为从分子水平研制和开发新一代的，针对药物敏感性进行检测的试剂盒提供了理论基础和大量的实验数据；实验证明，个体基因水平上的差异，包括基因多态性、基因突变和表达差异等，与肿瘤患者对药物的敏感性密切相关；通过检测患者在这些基因上与药物敏感性相关的生物标记，可以预测患者对肿瘤化疗药物的敏感性，帮助进一步指导选择合理的化疗方案。长春碱类药物是从夹竹桃科植物长春花中提取的生物碱。此类化合物具有抗肿瘤活性，目前被应用与临床化疗中的有长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞宾等多种药物，主要用于何杰金氏病和绒毛膜癌；长春碱类化合物可以与细胞中的微管蛋白结合，抑制微管聚合，妨碍纺锤体微管的形成，使细胞分裂停滞在中期；长春碱类药物通过干扰细胞周期的正常进行，抑制细胞的分裂增殖，从而达到抑制肿瘤细胞的效果。研究人员发现ABCBl基因上的几个生物标记与长春碱类药物敏感性密切相关；ABCBl基因编码P糖蛋白(P-glycoprotein P_gp),是一种广谱的多药外排泵；P_ gp可以通过它的疏水位点与疏水性抗肿瘤药物结合，通过ATP水解供能，逆浓度梯度将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药；P_gp的转运底物包括长春碱类化合物，因此ABCBl的基因变化导致个体对长春碱类药物的敏感性不同；通过设计试剂盒，检测ABCBl基因上的多个SNP生物标记，可以方便、快速的预测长春碱类药物对患者个体的疗效。
发明内容
本发明的目的是利用SNP标记检测方便快捷，准确率高的优点，采用Seqnome检测技术，提供一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的方法，包括PRC弓I物、延伸弓I物和试剂盒。本发明是通过以下技术方案实现的:本发明涉及一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的PCR扩增引物，含有SEQ ID N0.1 3所示的上游引物和SEQ ID N0.4 6所示的下游引物。本发明涉及一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的单碱基延伸引物，含有SEQ ID N0.7 9所示的单碱基延伸引物。本发明设计一种试剂盒，由PCR扩增试剂组、SAP酶试剂组和iPLEX试剂组构成，其中PCR扩增试剂组含有:PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、纯水和如SEQID N0.1 3所示的上游引物和如SEQ ID N0.4 6所示的下游引物；SAP酶试剂组含有:SAP缓冲液、SAP酶和纯水；iPLEX试剂组含有:iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQ ID N0.7 9所示的单碱基延伸引物。上述标记组合优选利用飞行质谱(MALD1-T0F)方法进行检测，检测方法包括以下步骤:
(1)提取基因组DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮细胞DNA；
(2)飞行质谱检测SNP多态；
(3)根据SNP分型结果推断长春碱类药物敏感度。
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本发明对ABCBl基因上的三个SNP生物标记进行分型，建立了一个快速，简便，且成本低廉的检测试剂盒，该试剂盒准确度高，灵敏性好，具有很强的实用价值。
具体实施例方式实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1:采用飞行质谱方法对肿瘤患者进行SNP分型及长春碱类药物敏感度检测:
一)提取基因组DNA:本试验的样本是使用刮棒采集的口腔粘膜细胞，室温保存，刮棒采样DNA提取的具体步骤如下:将口腔刮棒上的脱落细胞溶于400 μ L IX裂解液中，加入
Iμ L蛋白酶K，56度水浴30分钟；取出样品置冰水浴I分钟，加入6mol/L NaCl 150 μ L，剧烈振荡15-20秒，13000转离心10分钟；吸取上清液至新的离心管中，加入1.1mL无水乙醇，上下颠倒10次至絮状DNA沉淀出现。室温放置10分钟，13000转离心2分钟沉淀DNA ;弃去上清液，再加入0.25mL70%乙醇洗涤DNA沉淀，室温放置I分钟后，13000转离心5分钟；用移液器小心吸取乙醇，然后放入通风橱中通风10分钟，然后用35 μ L TE溶解DNA ;DNA可在4度保存1-2个月，或者存放在-20度长期保存；使用18PL PCR Master Mix反应液以及2PL DNA模板，PCR扩增β -actin片断，1.5%琼脂糖凝胶，120V电泳15分钟，观察结果合格后转移至PCR管中；紫外分光光度计SMA3000测定溶液中DNA的浓度和A260/A280比值，测量3次取平均值，浓度应在30ng/y L，A260/A280比值应该在1.7-2.0之间，合格的DNA 4°C取用或_20°C保存；
二)飞行质谱检测SNP多态采用本发明中所述试剂盒对样本中的SNP生物标记进行检测，下面为检测过程:
1)引物与DNA稀释以及质检:PCR引物稀释至终浓度为0.5μΜ ;根据Sequenom的稀释公式，按照单碱基延伸引物的分子量将引物稀释至终浓度为7-14 μ M之间；
2)PCR扩增:在每个384孔PCR板中加入Iμ L DNA和4 μ L PCR扩增试剂，共5 μ L，按照PCR仪程序I进行扩增；PCR扩增程序1:94°C 15min
权利要求
1.一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的PCR扩增引物，其特征在于，包含SEQID N0.1 3所示的上游引物和SEQ ID N0.4 6所示的下游引物。
2.一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的弓I物单碱基延伸引物，其特征在于，包含SEQ ID N0.7 9所示的单碱基延伸引物。
3.一种用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的方法，其特征在于，由PCR扩增试剂组、SAP试剂组、iPLEX试剂组构成: [ 1)PCR扩增试剂组含有:PCR缓冲液、MgCl2, dNTP混合液、Hotstar Taq酶、纯水和如SEQ ID N0.1 3所示的上游引物和如SEQ ID N0.4 6所示的下游引物； [2)SAP酶试剂组含有:SAP缓冲液、SAP酶和纯水； [3)iPLEX试剂组含有:iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQ IDN0.7、所示的单碱基延伸引物。
4.根据权力要求3所述的方法制造的试剂盒，包括具有一系列特征的试剂盒: [1)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的PCR扩增缓冲液为10X缓冲液，含2mM MgCl2 ；[2)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的MgCl2浓度为2mM； [3)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的dNTP混合液的浓度为500 μ M ；[4)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的HotstarTaq酶为0.5U ； [5)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的SAP缓冲液为IOX缓冲液； [6)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的SAP酶为1.7 U/ μ L的虾碱性磷酸酶； [7)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的iPLEX缓冲液IOX缓冲液； [8)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的ddNTP混合液为经过质量修饰的核苷酸 ； [ 9)根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的单碱基延伸酶为iPLEX聚合酶。
全文摘要
一种分子生物技术领域的用于长春碱类抗肿瘤药物敏感度检测的方法，包括引物、探针及其试剂盒，该试剂盒由PCR扩增试剂组、SAP酶试剂组、iPLEX试剂组构成；PCR扩增试剂组含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合液、HotstarTaq酶、纯水和如SEQIDNo.1~3所示的上游引物和如SEQIDNo.4~6所示的下游引物；SAP酶试剂组含有SAP缓冲液、SAP酶和纯水；iPLEX试剂组含有iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQIDNo.7~9所示的单碱基延伸引物；利用该试剂盒将肿瘤患者的DNA提取并处理后，可利用飞行质谱方法，检测引物扩增片段内的生物标记，并基于检测结果评价肿瘤患者对长春碱类药物的敏感度，结果准确，灵敏度高，方法快速简便并且有很高通量。
文档编号C12N15/11GK103074421SQ20121056196
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月22日 优先权日2012年12月22日
发明者王健, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:上海迪道科技有限公司, 郭景康