专利名称：一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法
技术领域：
本发明涉及一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法。
背景技术：
雨生红球藻Zfeeaaiococcm是一种单细胞绿藻,是目前已知的奸青素含量最高的生物。雨生红球藻因自身所积累虾青素物质可高达干重的1. 5% 3. 0%，被视为天然虾青素的“浓缩品”。雨生红球藻所含的虾青素是自然界中发现的抗氧化能力最强的物质，在人类缓解疲劳、延缓衰老以及预防和治疗心脑血管疾病方面有显著的效果。由于天然虾青素结构的稳定性和安全性，规模化培养雨生红球藻成为未来获取天然虾青素的最佳途径，是目前得到各国大力推进的新型生物技术产业。
目前在培养雨生红球藻生产虾青素过程通常采用一步法，即在同一培养装置中完成全部的生产工艺。光生物反应器技术应用于雨生红球藻生产虾青素通常采取一步法的生产模式(ZL02138827. X)，即在同一生物反应器中需要完成雨生红球藻营养细胞的培养扩增，转化及虾青素累积，导致了一次性成本投入极高，调控复杂，产品效益不明显。如公告 号为CN1966660，专利名称为“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”的发明专利，公开了一种设置在固定架上的光生物反应器系统的培养装置。
少数采用二步法，即在生产工序上，培养环节属于营养生长，需要常温、弱光、高营养盐，碳/氮比小，而转化与累积过程需要高温、强光、高营养盐，碳/氮比大，二步法具有更高的培养效率。其实，无论采用一步法还是二步法，培养雨生红球藻生产虾青素的关键环节之一是转化过程。转化的诱导与促进方法主要有三类其一是光因子的诱导，公告号为CN1966660,专利名称为“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”的发明专利，公开了人工LED光源对雨生红球藻照光培养。也有光因子与温度影响相结合的诱导方法。其二是营养的诱导，公告号为CN101586140，专利名称为“一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法”的发明专利，公开了调节和控制氮、磷含量，PH值，培养温度，光照强度，光照时间，添加矿盐，实现生长与转化。其三是利用植物生长调节剂，如公告号为CN101803600A，专利名称为“雨生红球藻细胞生长促进剂及其使用方法”的发明专利，公开了萘乙酸、3-吲哚丁酸加入到雨生红球藻细胞的培养基中，促进生长。 如公告号为CN101974599A，专利名称为“利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法”的发明专利，公开了一种利用油菜素内酯刺激雨生红球藻快速生产虾青素的方法， 类似的还有茉莉酸甲酯、茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法。
上述的方法均是通过改变整个培养条件，实现转化，较为复杂，且难于实施。发明内容
本发明提出一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法，在培养雨生红球藻营养生长到转化并累积虾青素的过程中，通过改变局部的藻际生长的微环境，诱导局部藻细胞先发生转化，从而提高迅速转化的效率与稳定性。
本发明是这样实现的一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法，包括固定化转化细胞的制备、固定化转化细胞与营养生长细胞相结合、相关的环境条件控制等，其特征是步骤如下
①制备高密度的雨生红球藻转化细胞培养后的雨生红球藻转化细胞的藻液先离心浓缩，离心浓缩条件为1500——3000 r/ min, 3-5 min ;浓缩液经无菌的蒸馏水洗涤后，再一次在离心浓缩条件为1500—3000 r/ min, 3-5 min离心浓缩，并添加2%氯化钙溶液，配制得藻密度每平方厘米为500万一 1000万的高密度藻液。②制备固定化凝胶载体采用体积浓度5%褐藻酸钠溶液，并按褐藻酸钠溶液的重量添加0. 5%硫酸亚铁、0. 01%-0. 03%寡糖和适量的海藻酸钠凝胶溶液，混匀得到混合液，煮沸 3 min。③制备固定化雨生红球藻转化细胞凝胶载体，步骤②获得的混合液冷却成胶体后，在室温下用滴管向胶体内加入3-5滴步骤①获得的高密度的雨生红球藻转化细胞，在 钙离子的作用下，形成褐藻酸钙固定化凝胶，产生直径为0. 1-1厘米的固化小球。固化小球内部为雨生红球藻转化细胞，通过加固强化可减少雨生红球藻转化细胞的泄漏量。④根据需要的藻种浓度，加入步骤③制备的雨生红球藻转化细胞凝胶载体，固定化凝胶载体与需要转化的培养细胞，其分布的密度达到每平方厘米0. 2-2. 0个时共培养。⑤采用光照，温度控制在24 °C — 26 °C，控制光照在8000LUX，通过调节水位的方法，控制水位在0. 5m，采用流水的方法，实现固定化转化细胞的诱导转化。本发明的固定化转化细胞的诱导方案，通过对固定化转化细胞迅速固定去除氮磷等营养物质，转化细胞固定化凝胶载体的微观结构四面通透，十分有利于内部的雨生红球藻转化细胞对对磷酸盐、氨氮等营养物质的吸收，使PH值升高，有利于转化的发展。培育后，雨生红球藻细胞体积产量高达0. 1-0. 7g/L，天然虾青素含量可高达细胞干重的0.8-2. 2%。比常规方法提早12-36小时。按常规技术经分离收获藻细胞及低温干燥等工序获取富含虾青素的藻细胞。本发明通过改变局部的藻际生长微环境，诱发转化，并保证培养产物的安全性，是高效培育雨生红球藻和转化虾青素的途径之一。本发明简单易行、成本低廉，并能缩短雨生红球藻细胞转红的时间，从而提高雨生红球藻累积虾青素的效率，具有良好的产业化前景。本发明的方法对于培养液体中局部的氮、磷等营养物质的去除效果高，因此反应效率高，诱导效果明显，运行稳定可靠，固定化转化细胞易于收获重复利用，没有使用盐类产生的废水处理困难的现象，具有良好的经济效益。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1
利用固定化转化细胞的诱导培养雨生红球藻转化、生产虾青素的方法，包括下述步
骤
I)获得高密度的雨生红球藻转化细胞。培养后的雨生红球藻转化细胞的藻液离心浓缩，离心浓缩条件3000 r/ min, 3 min ;浓缩液经无菌的蒸馏水洗涤、在同样条件下再离心，并添加2%氯化钙溶液，配制得藻密度每平方厘米为500万一1000万的高密度藻液。
2)获得固定化凝胶载体。取体积浓度5%的褐藻酸钠溶液，并按重量添加O. 5%硫酸亚铁、O. 03%寡糖和适量的海藻酸钠凝胶溶液，混匀得到混合液，煮沸3 min。
3)制备固定化雨生红球藻转化细胞凝胶载体，待步骤2)的混合液冷却后成胶体， 室温条件下用滴管在胶体中加入3-5滴步骤I)获得的高密度雨生红球藻转化细胞，在钙离子的作用下，形成褐藻酸钙固定化凝胶，产生直径为O. 1-1厘米的固化小球。
4)在需要诱导的红球藻培养液中，其细胞密度为每毫升12万的藻种浓度，加入步骤3)获得的固定化雨生红球藻转化细胞凝胶载体，使凝胶载体在培养液分布的密度达到每平方厘米2个时共培养。
5)采用光照，温度控制在24°C—26°C，控制光照 在8000Lux，通过调节水位的方法，控制水位在O. 5m，采用流水的方法，实现固定化转化细胞的诱导转化。
培养18 — 25天，雨生红球藻细胞体积产量高达O.1—O. 7g/L，经分离收获藻细胞及低温干燥等工序获取富含虾青素的藻细胞，天然虾青素含量可高达细胞干重的 O. 8-2. 2%。
权利要求
1.一种雨生红球藻的转化方法，其特征是利用固定化雨生红球藻转化细胞的诱导培养雨生红球藻转化、生产虾青素，步骤如下①制备高密度的雨生红球藻转化细胞培养后的雨生红球藻转化细胞的藻液先离心浓缩，离心浓缩条件为1500——3000 r/ min, 3-5 min ;浓缩液经无菌的蒸馏水洗涤后，再一次在离心浓缩条件为1500—3000 r/ min, 3-5 min离心浓缩，并添加2%氯化钙溶液，配制得藻密度每平方厘米为500万一 1000万的高密度藻液；②制备固定化凝胶载体采用体积浓度5%褐藻酸钠溶液，并按褐藻酸钠溶液的重量添加O. 5%硫酸亚铁、O. 01%-0. 03%寡糖和适量的海藻酸钠凝胶溶液，混匀得到混合液，煮沸3 min ；③制备固定化雨生红球藻转化细胞凝胶载体，步骤②获得的混合液冷却成胶体后，在室温下用滴管向胶体内加入3-5滴步骤①获得的高密度的雨生红球藻转化细胞，在钙离子的作用下，形成褐藻酸钙固定化凝胶，产生直径为O. 1-1厘米的固化小球。固化小球内部为雨生红球藻转化细胞，通过加固强化可减少雨生红球藻转化细胞的泄漏量；④根据需要的藻种浓度，加入步骤③制备的雨生红球藻转化细胞凝胶载体，固定化凝胶载体与需要转化的培养细胞，其分布的密度达到每平方厘米O. 2-2. O个时共培养；⑤采用光照，温度控制在24°C— 26°C，控制光照在8000Lux，通过调节水位的方法，控制水位在O. 5m，采用流水的方法，实现固定化转化细胞的诱导转化；培育后，雨生红球藻细胞体积产量高达O. 1-0. 7g/L，天然虾青素含量高达细胞干重的O. 8-2. 2%。
全文摘要
一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法，包括固定化转化细胞的制备、固定化转化细胞与营养生长细胞相结合、相关的环境条件控制等，步骤如下①制备高密度的雨生红球藻转化细胞；②制备固定化凝胶载体；③制备固定化雨生红球藻转化细胞凝胶载体，④根据需要的藻种浓度，加入步骤③制备的雨生红球藻转化细胞凝胶载体，固定化凝胶载体与需要转化的培养细胞；⑤采用光照，温度控制在24℃—26℃，控制光照在8000Lux，通过调节水位的方法，控制水位在0.5m，采用流水的方法，实现固定化转化细胞的诱导转化；本发明提供的方法具有诱导效果明显，运行稳定可靠。
文档编号C12R1/89GK102994603SQ201210561399
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者徐青山, 骆其君, 严小军, 谭应宏, 陈海敏 申请人:丽江程海保尔生物开发有限公司