专利名称：乳杆菌深冻产品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌的深冻干粉制剂的制备方法。
背景技术：
深冻发酵剂产品存在生产成本低、活力强、稳定性好、贮存期长的优点。需要克服的技术难题是如何增加前期高密度培养的活 菌数和后期深冻的存活率。针对上述技术难题，本发明专利采用分子营养、发酵过程参数和深冻菌体保护优化技术优化出高密度培养基的组成、发酵过程参数控制模式和菌体深冻保护剂的组成和控制模式，有效的解决了上述技术难题。嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌都属于乳酸菌，革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌，在其冻干制剂的生产中，存在菌体死亡率较高及稳定性能差的缺点，致使产品中活菌含量少、用量大、发酵效果差，制造和使用成本均较高。本发明的目的是为了解决上述问题，提供嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆高密度培养的培养基及其深冻产品的制备方法。
发明内容
具体技术方案一特别优选的一种培养基，一种在制备嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品过程中使用的培养基，该培养基由以下组分及用量配制而成80-120g的脱脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25-30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸 丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;其中，优选尿嘧啶和黄嘌呤的比例为1:2 ;生物素和叶酸的比例为1:1 ;尼克酸和泛酸钙的比例为1:3，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的；上述配比带来了难以预料的技术效果。普通常规培养基也适用于本发明。具体技术方案二 深冻保护剂，其组成及配制25g的脱脂乳粉、2g的斯盘60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的维生素C，5g的甘油、O. 5g的细胞松弛素B，将上述保护剂的干粉和液体直接加入到发酵液中，上述保护剂中的干粉采用辐照的方式进行灭菌，液体采用湿热的方式灭菌，将此混合物在Γ Ο 的环境中放置12h。具体技术方案三嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品的制备方法，按以下步骤进行1、高密度培养
将经过活化的菌株以2%的接种量接种于灭菌的培养基中进行发酵；发酵过程中PH采用两段式，总发酵时间10h，第一阶段将发酵液的pH用质量浓度10%的氨水控制在6. 0-6. 5，发酵7. Oh ;第二阶段不控制发酵液的pH，发酵3. Oh ;发酵过程中采用变温培养模式，第一阶段将发酵温度控制在42. 5-45°C，发酵3. 5h ;第二阶段将发酵温度控制在35-37°C，发酵3. 5h ;第三阶段将发酵温度控制在37-40°C，发酵3h ;其中所述培养基为80-120g的脱脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25-30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸 丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在发酵过程中搅拌速度为120rpm，直至发酵结束。此外，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。2、洗脱
发酵液在O 20°C时,加入与发酵液等重量的质量浓度为15%的朽1檬酸钠溶液或质量浓度为15%的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白洗脱。3、富集
洗脱结束后，将发酵液的温度降至4°C，依次采用膜过滤、连续式离心进行浓缩，具体膜浓缩操作为用孔径为100 200nm、面积为1. Om2的陶瓷膜，在跨膜压力为150KPa进行膜浓缩处理，至发酵液的浓缩倍数达到3 ;离心浓缩具体为以30kg/min的进料量用连续自动 出料离心机式进行离心浓缩，控制出料量为5kg/min ；
4、菌体的深冻保护
将上述获得的发酵液与深冻保护剂以质量比为10 Γ10 2进行混合，然后进行冷贮。保护剂的组成为25g的脱脂乳粉、2g的斯盘60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的维生素C，5g的甘油、O. 5g的细胞松弛素B，将上述保护剂的干粉和液体直接加入到发酵液中，上述保护剂中的干粉采用辐照的方式进行灭菌液体采用湿热的方式灭菌，将此混合物在4 10°C的环境中放置12h。5、菌体的深冻
将混合物以3°C /min的降温速率于4°C降至_20°C，保持5min ;将混合物以4°C /min的降温速率于_20°C降至_60°C，保持20min。6、菌体的包装、贮藏与运输
将深冻产品在_60°C的粉碎机中粉碎后包装于灭菌的铝箔袋中，于_80°C的环境中贮藏，运输时采用充有液氮或干冰的保温箱进行运输。对于乳酸菌的高密度培养而言，要想获得较高的活菌数，需要对主要发酵过程参数温度和PH进行优化，单独使用两段式的温度控制模式而不对pH进行优化控制会导致在发酵过程中出现代谢产物的积累，导致乳酸菌的生长和繁殖受到抑制。单独使用两段式的PH控制模式而不对温度进行优化控制会导致由于温度不是菌体细胞的最佳生长模式，而造成乳酸菌的生长率过高或过低。此外，PH和温度不是两个孤立的因素，而是相互影响的因素。因此单独使用独立的两种培养模式均达不到理想的效果。申请人:先前研究了单一温度培养模式和变温培养模式对乳酸菌发酵活力和生物量的影响，结果表明采用采用两阶段的温度控制方式，发酵初期高温进行发酵，后期低温进行发酵，与单一温度发酵相比，乳酸菌的最大细胞生物量和最高发酵活力均有所提高。但是，发明人在研究过程中发现变温发酵虽然提高了细胞生物量和最高发酵活力，但是受PH影响很大，而且在该菌冷冻干燥后发酵活力和细胞生物量有明显下降，影响冻干制剂质量、提闻了使用成本。在高密度培养过程中，往往通过控制培养过程中培养液的pH值，以解除酸对菌体生长的抑制作用，促进菌株生长。但是该方法当菌体浓度达一定的数量时，中和反应将不起作用。因此，本发明专利采用两段式的pH控制方式，此外第二阶段不控制pH，使菌体细胞处于应激的状态，从而产生应激蛋白，增加了菌体抵御不良条件的抗性和冻干存活率。最适温度随着菌体生长阶段变化而改变。温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构和功能、细胞结构如细胞膜的流动性和完整性以及胞内酶的活性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。较低的接种温度导致活菌数量缓慢增加，有利于延长乳酸菌的对数期和稳定期，较高的培养温度将增加菌体细胞的生长速度。因此，本发明专利发酵初期采用较高的发酵温度以缩短迟滞期使其快速进行对数生长期，当进入对数生长期时采用较低的发酵温度以延长乳酸菌的对数生长期，当到达对数生长期末期时，采用相对适中的温度以缩短到达稳定期的时间。本发明专利在基础培养基中加入的甜菜糖蜜和玉米淀粉糖浆中含有的甜菜碱和 多种糖类有效的缓解了乳杆菌在增殖过程中由于高的渗透压对菌体细胞带来的损伤并为其生长提供了大量优质的碳源；尿嘧啶和黄嘌呤直接快速的为乳杆菌合成遗传物质提供了基本成分；生物素、叶酸、尼克酸、泛酸钙、核黄素和盐酸硫胺素是乳杆菌生长过程中重要酶的辅助因子，为乳杆菌在增殖过程中快速有效的合成蛋白和脂肪提供了有力的物质保障。本发明专利充分的利用了乳蛋白对菌体细胞的包埋作用、斯盘60对细胞膜的保护作用、海藻糖防止大冰晶的形成和保水作用、甜菜糖蜜降低渗透压作用及维生素C保持适合的氧化还原电势的作用，
与现有技术相比，本发明具有以下突出效果
(I)发明人将影响细菌发酵的两个关键因素相结合，在高密度发酵过程中采用两段式pH、三段式变温相结合的方式进行发酵，最大细胞生物量和最高发酵活力较单独的两阶段的温度或单独的两段式PH控制方式，得到明显提高，同时得到的冻干制剂中活菌数高、稳定性好。(2)本发明更突出的是，在高密度培养的培养基中添加了 25g的NaCl、5g的谷胱甘肽，盐刺激可以提高乳酸菌胁迫的抗性，因此在发酵后期向发酵液中加入一定浓度的NaCl可以有效的增强乳酸菌的抗冻能力，从而增加其深冻期间的存活率。随着细胞的代谢，自由基可连续不断地产生，给细胞带来一定的损伤，如细胞膜及细胞内亚结构成分的膜等。因此，谷胱甘肽作为一种良好的生物抗氧化剂可以有效的增加菌体细胞的深冻期间的存活率。增菌培养基中同时增加了腺嘌呤和尿嘧啶的使用量，为后续冻干产品的制备过程中增加了功能性益生性乳杆菌的存活率。优选配制的培养基与两段式pH、三段式变温发酵的方式相结合产生了预料不到的技术效果。另外，使用其他常规的培养基，同时采用本申请中所述的两段式pH、三段式变温相结合的方式进行发酵，也能够取得好的技术效果。特别优选的深冻保护剂是经过通过特定的组分并采用特定的配比，为深冻过程提供有效保护，甘油是常用的冷冻保护剂组分，对菌体细胞在冷冻过程中有很强的保护作用，但是其在冷冻干燥过程中不容易干燥，因此，更适合于作为不需要干燥的深冻保护剂。在上述保护体系的基础上为了进一步增强菌体细胞的抗冻性能，本发明专利还向保护体系中加入了对菌体细胞具有良好保护作用的甘油和对菌体细胞骨架具有保护作用的细胞松弛素B。上述保护体系减轻了低温深冻对菌体的损伤，此外，在发酵后期向发酵液中加入一定浓度的NaCl并在低温深冻前将菌体置于低温下，使菌体产生应激蛋白和抗冻蛋白，也有效的提高了菌体的深冻存活率。细胞骨架是位于细胞核和细胞膜内侧面的一种纤维状蛋白基质，提高细胞骨架在玻璃化冷冻过程中的稳定性将有可能提高乳酸菌冷冻的存活率以及生长繁殖潜力。细胞松弛素B是一种细胞骨架稳定剂，可以阻止细胞内蛋白的聚集，因此有效的提高了细胞的冷冻存活率和活性。其它常规深冻保护剂也可以被用于本发明。所得深冻产品产品，经测试其中活菌数为5.2X10nCFU/g，本专利技术产品在冻藏的条件下可保存I年，活菌数不低于lX10ncfU/g。在高密度培养过程中，上述乳酸菌在优化的单一温度(42. 5°C)和pH (6. 2)的条件下培养的活菌数为2. 2X 108CFU/mL。两段式变温培养pH(6. 2)。第一阶段(42. 5-45. 0°C),第二阶段(35-37°C)的条件下培养的活菌数为8. 7X 108CFU/mL。与单一的温度和pH培养模式相比,活菌数增加了 3. 9倍。本申 请中的两段式pH、三段式变温相结合的发酵方式中进行乳酸菌的高密度培养，乳酸菌的活菌数为7. 6X 109CFU/mL。与单一的培养模式相比活菌数增加了 34. 5倍，与两段式变温培养模式相比活菌数增加了 8. 7倍。两段式pH、三段式变温相结合的发酵方式与“两段式变温”的培养模式及常规单一温度和PH的培养模式的活菌数相比差异显著(P < O. 001)。
具体实施例方式
实施例1、一种在制备嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品过程中使用的培养基，该培养基由以下组分及用量配制而成80g的脱脂乳粉，50g的甜菜糖蜜，40g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸馏水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黄嘌呤的比例为1:2 ;生物素和叶酸的比例为1:1 ;尼克酸和泛酸钙的比例为1:3，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。实施例2 —种在制备嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品过程中使用的培养基，该培养基由以下组分及用量配制而成120g的脱脂乳粉，70g的甜菜糖蜜，60g的玉米淀粉糖楽；、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿喃唳和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸馏水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黄嘌呤的比例为1:2 ;生物素和叶酸的比例为1:1 ;尼克酸和泛酸钙的比例为1:3，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。实施例3、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品的制备方法，按以下步骤进行
一、高密度培养
将经过活化的菌株以2%的接种量接种于灭菌的培养基中进行发酵；发酵过程中pH采用两段式，总发酵时间10h，第一阶段将发酵液的pH用质量浓度10%的氨水控制在6. 0，发酵7. Oh ;第二阶段不控制发酵液的pH，发酵3. Oh ;发酵过程中采用变温培养模式，第一阶段将发酵温度控制在42. 5°C，发酵3. 5h ;第二阶段将发酵温度控制在35°C，发酵3. 5h ;第三阶段将发酵温度控制在37°C，发酵3h ;其中所述培养基为80-120g的脱脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿卩密唳和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在发酵过程中搅拌速度为120rpm,直至发酵结束。此外，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。二、洗脱
发酵液在O 20°C时,加入与发酵液等重量的质量浓度为15%的朽1檬酸钠溶液或质量浓度为15%的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白洗脱。三、富集
洗脱结束后，将发酵液的温度降至4°C，依次采用膜过滤、连续式离心进行浓缩，具体膜浓缩操作为用孔径为100 200nm、面积为1. 0m2的陶瓷膜，在跨膜压力为150KPa进行膜 浓缩处理，至发酵液的浓缩倍数达到3 ;离心浓缩具体为以30kg/min的进料量用连续自动出料离心机式进行离心浓缩，控制出料量为5kg/min ；
四、菌体的深冻保护
将上述获得的发酵液与深冻保护剂以质量比为10 Γ10 2进行混合，然后进行冷贮。保护剂的组成为25g的脱脂乳粉、2g的斯盘60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的维生素C，5g的甘油、O. 5g的细胞松弛素B，将上述保护剂的干粉和液体直接加入到发酵液中，上述保护剂中的干粉采用辐照的方式进行灭菌液体采用湿热的方式灭菌，将此混合物在4 10°C的环境中放置12h。五、菌体的深冻
将混合物以3°C /min的降温速率于4°C降至_20°C，保持5min ;将混合物以4°C /min的降温速率于_20°C降至_60°C，保持20min。六、菌体的包装、贮藏与运输
将深冻产品在_60°C的粉碎机中粉碎后包装于灭菌的铝箔袋中，于_80°C的环境中贮藏，运输时采用充有液氮或干冰的保温箱进行运输。实施例4、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品的制备方法，按以下步骤进行
一、高密度培养
将经过活化的菌株以2%的接种量接种于灭菌的培养基中进行发酵；发酵过程中pH采用两段式，总发酵时间10h，第一阶段将发酵液的pH用质量浓度10%的氨水控制在6. 5，发酵7. Oh ;第二阶段不控制发酵液的pH，发酵3. Oh ;发酵过程中采用变温培养模式，第一阶段将发酵温度控制在45°C，发酵3. 5h ;第二阶段将发酵温度控制在37°C，发酵3. 5h ;第三阶段将发酵温度控制在40°C，发酵3h ;其中所述培养基为80-120g的脱脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿卩密唳和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在发酵过程中搅拌速度为120rpm,直至发酵结束。此外，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。二、洗脱
发酵液在O 20°C时,加入与发酵液等重量的质量浓度为15%的朽1檬酸钠溶液或质量浓度为15%的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白洗脱。三、富集洗脱结束后，将发酵液的温度降至4°C，依次采用膜过滤、连续式离心进行浓缩，具体膜浓缩操作为用孔径为100 200nm、面积为1. 0m2的陶瓷膜，在跨膜压力为150KPa进行膜浓缩处理，至发酵液的浓缩倍数达到3 ;离心浓缩具体为以30kg/min的进料量用连续自动出料离心机式进行离心浓缩，控制出料量为5kg/min ；
四、菌体的深冻保护
将上述获得的发酵液与深冻保护剂以质量比为10 Γ10 2进行混合，然后进行冷贮。保护剂的组成为25g的脱脂乳粉、2g的斯盘60、10g的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的维生素C，5g的甘油、O. 5g的细胞松弛素B，将上述保护剂的干粉和液体直接加入到发酵液中，上述保护剂中的干粉采用辐照的方式进行灭菌液体采用湿热的方式灭菌，将此混合物在4 10°C的环境中放置12h。
五、菌体的深冻
将混合物以3°C /min的降温速率于4°C降至_20°C，保持5min ;将混合物以4°C /min的降温速率于_20°C降至_60°C，保持20min。六、菌体的包装、贮藏与运输
将深冻产品在_60°C的粉碎机中粉碎后包装于灭菌的铝箔袋中，于_80°C的环境中贮藏，运输时采用充有液氮或干冰的保温箱进行运输。实施例5、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品的制备方法，按以下步骤进行
一、高密度培养
将经过活化的菌株以2%的接种量接种于灭菌的培养基中进行发酵；发酵过程中pH采用两段式，总发酵时间10h，第一阶段将发酵液的pH用质量浓度10%的氨水控制在6. 3，发酵7. Oh ;第二阶段不控制发酵液的pH，发酵3. Oh ;发酵过程中采用变温培养模式，第一阶段将发酵温度控制在43. 5°C，发酵3. 5h ;第二阶段将发酵温度控制在36°C，发酵3. 5h ;第三阶段将发酵温度控制在38°C，发酵3h ;其中所述培养基为80-120g的脱脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25-30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿卩密唳和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在发酵过程中搅拌速度为120rpm,直至发酵结束。此外，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。二、洗脱
发酵液在O 20°C时,加入与发酵液等重量的质量浓度为15%的朽1檬酸钠溶液或质量浓度为15%的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白洗脱。三、富集
洗脱结束后，将发酵液的温度降至4°C，依次采用膜过滤、连续式离心进行浓缩，具体膜浓缩操作为用孔径为100 200nm、面积为1. 0m2的陶瓷膜，在跨膜压力为150KPa进行膜浓缩处理，至发酵液的浓缩倍数达到3 ;离心浓缩具体为以30kg/min的进料量用连续自动出料离心机式进行离心浓缩，控制出料量为5kg/min ；
四、菌体的深冻保护
将上述获得的发酵液与深冻保护剂以质量比为10 Γ10 2进行混合，然后进行冷贮。保护剂的组成为25g的脱脂乳粉、2g的斯盘60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1.5g的维生素C，5g的甘油、O. 5g的细胞松弛素B，将上述保护剂的干粉和液体直接加入到发酵液中，上述保护剂中的干粉采用辐照的方式进行灭菌液体采用湿热的方式灭菌，将此混合物在4 10°C的环境中放置12h。五、菌体的深冻
将混合物以3°C /min的降温速率于4°C降至_20°C，保持5min ;将混合物以4°C /min的降温速率于_20°C降至_60°C，保持20min。六、菌体的包装、贮藏与运输
将深冻产品在_60°C的粉碎机中粉碎后包装于灭菌的铝箔袋中，于_80°C的环境中贮藏，运输时采用充有液氮或干冰的保温箱进行运输。
权利要求
1.一种在制备嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品过程中使用的培养基，该培养基由以下组分及用量配制而成将80-120g的脱脂乳粉，50-70g的甜菜糖蜜，40-60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸钙、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸馏水并定容至IOOOmL ;其中，尿嘧啶和黄嘌呤的比例为1:2 ;生物素和叶酸的比例为1:1 ;尼克酸和泛酸钙的比例为1:3，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的。
2.嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品的制备方法，按以下步骤进行 一、高密度培养 将按常规方法活化的嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌以2%的接种量接种于灭菌的培养基中进行发酵；发酵过程中PH采用两段式，总发酵时间10h，第一阶段将发酵液的PH用质量浓度10%的氨水控制在6. 0-6. 5，发酵7. Oh ;第二阶段不控制发酵液的PH，发酵3. Oh ;发酵过程中采用变温培养模式，第一阶段将发酵温度控制在42. 5-45°C,发酵3. 5h ;第二阶段将发酵温度控制在35-37°C，发酵3. 5h ;第三阶段将发酵温度控制在37-40°C，发酵3h ;其中所述培养基为80-120g的脱脂乳粉，50_70g的甜菜糖蜜，40_60g的玉米淀粉糖浆、25g的NaCl、5g的谷胱甘肽、25_30g的酵母膏或酵母粉、12mg的尿嘧啶和黄嘌呤、O. 005mg的生物素和叶酸、2. Omg的尼克酸和泛酸I丐、2. Omg的核黄素及1. Omg盐酸硫胺素加入蒸懼水并定容至IOOOmL ;在发酵过程中搅拌速度为120rpm,直至发酵结束；其中，尿嘧啶和黄嘌呤的比例为1:2 ;生物素和叶酸的比例为1:1 ;尼克酸和泛酸钙的比例为1:3，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的；此外，培养基中的NaCl是在发酵进行到8h时添加到发酵液中的； 二、洗脱 三、富集 四、菌体的深冻保护 将步骤三获得的菌体浓缩物与深冻保护剂以质量比为10 Γ10 2进行混合，将此混合物在Γ Ο 的环境中放置12h ;其中深冻保护剂的组成为25g的脱脂乳粉、2g的斯盘60、IOg的海藻糖、5g的蔗糖糖蜜和1. 5g的维生素C，5g的甘油、O. 5g的细胞松弛素B，将深冻保护剂中的各组分灭菌后直接加入到发酵液中； 五、菌体的深冻 将步骤四获得的混合物以3°C /min的降温速率于4°C降至_20°C，保持5min ;将混合物以4°C /min的降温速率于-20°C降至_60°C，保持20min ； 六、菌体的包装、贮藏与运输 将深冻产品在_60°C的粉碎机中粉碎后包装于灭菌的铝箔袋中，于_80°C的环境中贮藏，运输时采用充有液氮或干冰的保温箱进行运输；
3、根据权利要求2任一项所述的方法，其中所述的洗脱步骤具体为发酵液在O 20°C时，加入与发酵液等重量的质量浓度为15%的柠檬酸钠溶液或质量浓度为15%的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白洗脱；
4、根据权利要求3任一项所述的方法，其中所述的富集步骤具体为洗脱结束后，将发酵液的温度降至4°C，依次采用膜过滤、连续式离心进行浓缩，具体膜浓缩操作为用孔径为100 200nm、面积为1. Om2的陶瓷膜，在跨膜压力为150KPa进行膜浓缩处理，至发酵液的浓缩倍数达到3 ;离心浓缩具体为以30kg/min的进料量用连续自动出料离心机式进行离心浓缩，控制出料量为5kg/min ；
5、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌的深冻产品，按权利要求1-4任一项所述的方法制备。
全文摘要
本发明涉及嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌的深冻制品的制备方法；提供了一种在制备嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌深冻产品过程中使用的培养基；发明人将影响细菌发酵的两个关键因素相结合，创造性地在高密度发酵过程中采用两段式pH、三段式变温相结合的方式进行发酵，最大细胞生物量和最高发酵活力较单一方式得到明显提高，同时得到的冻干制剂中活菌数高、稳定性好。还提供了一种优良的深冻保护剂。
文档编号C12N1/04GK103013832SQ20121056105
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者张兰威, 冯镇, 韩雪, 杜明, 易华西, 张莉丽, 张英春, 单毓娟, 范荣波 申请人:哈尔滨工业大学