专利名称：耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法
技术领域：
本发明公开了一株耐1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯([Mmim]DMP)纤维素酶产生菌地霉菌sp. CCZUll-1的培养及其在离子液体[Mmim] DMP/溶剂体系高效原位酶解甘蔗渣的方法，属于微生物技术领域。
背景技术：
随着化石资源的逐渐枯竭，利用纤维素等可再生资源生产生物能源的研究越来越受到国内外研究者的关注。地球上的纤维素资源非常丰富，有效地利用纤维素资源对人类 面临的能源危机有现实意义。然而，纤维素原料具有较高的结晶度，且分子内与分子间存在大量的氢键，因此难被纤维素酶糖化，为了使纤维素原料高效地糖化，必须使用合适的方法将其进行预处理。许多方法用于纤维素的预处理。酸法、溶剂法、金属复合物法和湿法氧化法等可用于纤维素原料的预处理，然而许多预处理方法易产生抑制下游发酵的抑制剂。近些年，离子液体(IL)作为不易挥发、低熔点和高热稳定性的纤维素预处理溶剂引起许多广泛的研究兴趣。尽管IL体价格比较昂贵，但是它们可回收及循环使用。然而，大部分IL易使纤维素酶失活，因此利用IL处理纤维素原料之后，需要再生纤维素并除去痕量的IL，整个工艺中需要引入IL再生及分离工艺，因而增加了纤维素预处理的成本。IL 1，3_ 二甲基咪唑磷酸二甲酯([Mmim]DMP)目前作为高效预处理纤维素原料溶剂引起许多专家学者的研究兴趣。然而，目前对耐受IL[Mmim]DMP纤维素酶产生菌少有报道，因此筛选到耐受IL的纤维素酶新酶源是当务之急。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种耐1，3- 二甲基咪唑磷酸二甲酯([Mmim]DMP)纤维素酶产生菌地霉菌及其纤维素酶原位酶解甘蔗渣的方法，以实现甘蔗渣的高效酶解。本发明的耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法，按照如下步骤进行
(1)菌株的培养
摇瓶培养将地霉菌焊CM sp. CCZUll-1采用本领域常规的方法，在摇瓶培养基中进行扩增培养72 192 h，培养温度为25 35 ° C;
(2)纤维素酶冻干粉制备
将上述培养获得的发酵液经过离心(8，0008 min)除去菌体，硫酸铵沉淀之后获得活性粗蛋白，活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉；
(3)冻干纤维素酶粉原位酶解甘蔗渣
离子液体1，3- 二甲基咪唑磷酸二甲酯在120 ° C下对甘蔗渣进行溶解预处理30 min后，加入pH=4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液形成离子液体/溶剂体系，离子液体含量占离子液体/溶剂体系体积的25%，然后用终浓度为1-10 g/L (按离子液体/溶剂体系计)步骤(2)中的纤维素酶进行甘蔗渣的原位酶解，在50 ° C和160 rpm的恒温摇床上振荡反应，即可达到酶解甘蔗渣的目的，其中离子液体与甘蔗渣的质量比为5 :1。其中步骤(I)中所述的培养基组分和含量如下(NH4)2SO4 4-8 g/L,KH2PO4 2-5 g/L, MgSO4 7H20 0. 1-0. 5 g/L, CaCl2 2H20 0. 1-0. 5 g/L, Tween-80 (聚氧乙烯失水山梨醇硬脂酸酯)0. 2-1.0 g/L，甘蔗渣10-30 g/L。其中步骤(3)中离子液体1，3- 二甲基咪唑磷酸二甲酯的结构式如下
权利要求
1.耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法，其特征在于按照如下步骤进行 (1)菌株的培养 摇瓶培养将地霉菌sp.采用本领域常规的方法，在摇瓶培养基中进行扩增培养72 192 h，培养温度为25 35 ° C; (2)纤维素酶冻干粉制备 将上述培养获得的发酵液经过离心8 min除去菌体，硫酸铵沉淀之后获得活性粗蛋白，活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉； (3)冻干纤维素酶粉原位酶解甘蔗渣 离子液体1，3- 二甲基咪唑磷酸二甲酯在120 ° C下对甘蔗渣进行溶解预处理30 min后，加入pH=4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液形成离子液体/溶剂体系，离子液体含量占离子液体/溶剂体系体积的25%，然后按离子液体/溶剂体系计用终浓度为1-10 g/L的步骤(2)中的纤维素酶进行甘蔗渣的原位酶解，在50 ° C和160 rpm的恒温摇床上振荡反应，即可达到酶解甘蔗渣的目的，其中离子液体与甘蔗渣的质量比为5 :1。
2.根据权利要求1所述的耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法，其特征在于其中步骤(I)中所述的培养基组分和含量如下=(NH4)2SO4 4-8 g/L,KH2PO4 2-5 g/L, MgSO4 7H20 0. 1-0. 5 g/L, CaCl2 2H20 0. 1-0. 5 g/L, Tween-80 0. 2-1. 0 g/L，甘蔗渣10-30 g/L。
3.根据权利要求1所述的耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法，其特征在其中步骤(3)中离子液体1，3- 二甲基咪唑磷酸二甲酯的结构式如下
4.根据权利要求1所述的耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法，其特征在于其中步骤(3)中所述的纤维素酶的浓度为3 g/L。
全文摘要
本发明耐离子液体地霉菌及其纤维素酶原位糖化甘蔗渣的方法，属于微生物技术领域。涉及一株耐受(IL)1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯([Mmim]DMP)的纤维素酶产生菌地霉菌属Galactomycessp.，其代谢的纤维素酶可耐受[Mmim]DMP，分别在培养体系添加含有5%(v/v)的[Mmim]DMP和反应体系中含有25%(v/v)的[Mmim]DMP中仍表现出较高的活性。另外，该纤维素酶可实现原位高效酶解甘蔗渣。本发明工艺简单，与现有的离子液体处理甘蔗渣后再生酶解的“两步法”相比，具有效率高、过程经济、三废少等优点。
文档编号C12N1/14GK103013840SQ20121055990
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者何玉财, 龚磊, 张跃, 李创, 吴培培, 邢震, 高凤婷, 庞震, 夏东琴, 王利群, 卿青, 严生虎 申请人:常州大学