专利名称：凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法
技术领域：
本发明属于微生物活性保护研究领域，具体地，涉及一种凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法。
背景技术：
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。橙色粘球菌是土壤中分离得到的粘细菌之一，多用于原核生物社会学行为研究的模式菌，其保存方法主要有传代培养保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法等，各种保藏方法都有其缺点，如耗时、耗材、设备费用昂贵等。固定化微生物技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的一项新的生物技术，采用物理或化学方法将微生物限定在一定的空间内，从而保持微生物活性。通常采用的固定化微生物技术主要有吸附法、载体结合法、交联法和包埋法等。有多篇文献及专利报道采用固定化保藏菌种，例如文献“光合细菌G3菌株固定化保存方法的研究，安徽农业科学，2011，39 (2):676-678",申请号为200710018010. 8的专利“基于固定化细胞技术的菌种保藏方法”等都报道了采用固定化细胞技术进行菌种保藏的方法。尚未检索到凹凸棒土负载壳聚糖对橙色粘球菌细胞固定化的报道。载体材料的性能对固定化微生物功能的发挥起着至关重要的作用。通常载体的表面粗糙度与电荷是影响固定化速率的重要因素，载体材料的表面越粗糙，越有利于微生物在其表面附着固定，同时孔洞和缝隙等的存在对已吸附的微生物具有保护的作用，使它们免受水力剪切的影响。
凹凸棒土是一种多孔型链层状含水富镁铝硅酸盐类粘土矿物，晶体结构内部沸石通道的存在赋予了凹凸棒土巨大的内表面积，表面丰富的S1-OH基团对有机质具有很强的亲和力，可直接或通过适当的改性处理用于固载催化剂，改性凹凸棒土作为生物催化剂酶的载体，在固定化酶的技术中被广泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法，利用凹凸棒土负载壳聚糖固定橙色粘球菌，降低橙色粘球菌活菌制剂生产成本，提高活菌存活率，操作方便，可适用于粗放的工业化大生产。本发明的技术解决方案是以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载壳聚糖，再采用包埋、吸附法相结合对橙色粘球菌进行固定化。其中，凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌固定化方法包括以下步骤
(I)凹土纯化凹土与去离子水混合，凹土与去离子的比例为1:5 (w/v)，常温下IOOr/min搅拌24h，静置沉降24h后倒掉最下层杂质和上清液，加入与上清液等量的去离子水，再常温100r/min搅拌24h，静置24h倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土 ；(2)凹土改性取纯化凹土，加入体积浓度为60%的硫酸溶液，凹土与60%的硫酸溶液的比例为1:5 (w/v),常温下以100r/min的转速搅拌24h,抽滤,水洗滤饼至水为中性,滤饼105°C烘干，得改性凹土 ；
(3)凹凸棒土负载壳聚糖用3%(v/v)的醋酸水溶液缓慢溶解脱乙酰度为90%的壳聚糖，配置浓度为5% (w/v)的壳聚糖溶液；取改性凹土加入浓度为5% (w/v)的壳聚糖溶液中，改性凹土与壳聚糖的质量比为1:0. 3，50°C搅拌6 h，静置6 h后除去上清液，抽滤，滤饼115°C干燥，冷却，研细，过160目筛，得凹凸棒土负载壳聚糖的固体吸附剂；
(4)菌株活化取一株橙色粘球菌(Myxococcusfulvus) JCH-04,保藏号为CGMCC No.2893，菌株在CY培养基上34°C培养I天，在发酵培养基中34°C、150rpm摇瓶培养2天，接种量为106CFU/ml ;该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620 ;所述的CY培养基组成为每IOOOml水中含有酪素水解蛋白胨3g，酵母膏lg，牛血白蛋白O. 5g，泛酸钙O. 5g，pH7. 5 ；所述的发酵培养基组成为每IOOOmL水中含有可溶性淀粉Sg，黄豆粉12g，蔗糖10g，葡萄糖 2.5g，酵母膏 0.25g，CaCl2 lg, MgSO4. 7H20 O. 5g, pH 7. 5 ；
(5)菌株扩培将菌株活化的液体菌种接种于装有发酵培养基的三角瓶中，34°C、150rpm摇瓶培养3天，接种量为106CFU/ml，采用流加量为50mL的变速流加补料，单位菌浓度达到4. 70 X IO9 CFU/ ml，在无菌条件下将菌株扩培的培养菌液用O. 2Mm微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/ml浓缩菌液；
(6)凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌凹凸棒土负载壳聚糖的固体吸附剂加入步骤(5)的浓缩菌液中，使负载壳聚糖凹凸棒土与菌液的比例为1:12-1:8 (w/v)，在温度400C ,150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼_50°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥18-20h，冻干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌的活菌制剂。本发明的有益效果是对凹凸棒土表面负载壳聚糖，壳聚糖/凹土复合载体表面有丰富的多糖链和功能基团，使凹土表面带有正电荷，能吸附或包裹带负电荷的微生物细胞，加速固定进程，更利于微生物的吸附固定化与活性保持，成本低廉，操作方便，活菌存活率高，可适用于粗放的工业化大生产。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。实施例1 :依以下步骤制备活菌制剂
(1)凹土纯化凹土与去离子水混合，凹土与去离子的比例为1:5(w/v)，常温下IOOr/min搅拌24h，静置沉降24h后倒掉最下层杂质和上清液，加入与上清液等量的去离子水，再常温100r/min搅拌24h，静置24h倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土 ；
(2)凹土改性取纯化凹土，加入体积浓度为60%的硫酸溶液，凹土与60%的硫酸溶液的比例为1:5 (w/v),常温下以100r/min的转速搅拌24h,抽滤,水洗滤饼至水为中性,滤饼105°C烘干，得改性凹土 ；
(3)凹凸棒土负载壳聚糖用3%(v/v)的醋酸水溶液缓慢溶解脱乙酰度为90%的壳聚糖，配置浓度为5% (w/v)的壳聚糖溶液；取改性凹土加入浓度为5% (w/v)的壳聚糖溶液中，改性凹土与壳聚糖的质量比为1:0. 3，50°C搅拌6 h，静置6 h后除去上清液，抽滤，滤饼115°C干燥，冷却，研细，过160目筛，得凹凸棒土负载壳聚糖的固体吸附剂；
(4)菌株活化取一株橙色粘球菌(Myxococcusfulvus) JCH-04,保藏号为CGMCC No.2893，菌株在CY培养基上34°C培养I天，在发酵培养基中34°C、150rpm摇瓶培养2天，接种量为106CFU/ml ;该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620 ;所述的CY培养基组成为每IOOOml水中含有酪素水解蛋白胨3g，酵母膏lg，牛血白蛋白O. 5g，泛酸钙O. 5g，pH7. 5 ；所述的发酵培养基组成为每IOOOmL水中含有可溶性淀粉Sg，黄豆粉12g，蔗糖10g，葡萄糖 2.5g，酵母膏 0.25g，CaCl2 lg, MgSO4. 7H20 O. 5g, pH 7. 5 ；
(5)菌株扩培将菌株活化的液体菌种接种于装有发酵培养基的三角瓶中，34°C、150rpm摇瓶培养3天，接种量为106CFU/ml，采用流加量为50mL的变速流加补料，单位菌浓度达到4. 70 X IO9 CFU/ml，在无菌条件下将菌株扩培的培养菌液用O. 2Mm微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/ml浓缩菌液；
(6)凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌取8g负载壳聚糖凹凸棒土加入96ml浓缩菌液中，在温度40°C、150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼于_50°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥18h，冻干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌活囷制剂。实施例2 :步骤(I)-步骤(5)同实施例1，其步骤(6)凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌是
取25g负载壳聚糖凹凸棒土加入200ml浓缩菌液中，在温度40°C、150 r/min振荡60min,抽滤，滤饼于-50°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥19h，冻干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌活菌制剂。实施例3 :步骤(I)-步骤(5)同实施例1，其步骤(6)凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌是
取50g负载壳聚糖凹凸棒土加入500ml浓缩菌液中，在温度40°C、150 r/min振荡60min,抽滤，滤饼于-50°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20h，冻干后水分控制在4-5%，得凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌活菌制剂。实施例1-3所得凹凸棒土负载壳聚糖固定化橙色粘球菌的活菌制剂，在常温下，I年细胞存活率彡90%，活菌数彡IO10CFU/克。
权利要求
1.凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征是它是以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载海藻酸钠制备微球，然后微球采用吸附法对β-葡萄糖苷酶进行固定化。
2.根据权利要求1所述的凹凸棒土负载海藻酸钠固定β_葡萄糖苷酶的制备方法，其特征是该制备方法包括以下步骤 1)凹土纯化凹凸棒土与去离子水混合，凹凸棒土与去离子水的比例为1:5(w/v)，常温下lOOr/min搅拌24h，静置沉降24h后，倒掉最下层杂质和上清液，再加入与上清液等量的去离子水，常温lOOr/min搅拌24h，静置24h，倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土； 2)酸改性凹土取纯化凹土，加入质量浓度为60%的硫酸溶液，纯化凹土与硫酸溶液的比例为1:5 (w/v),在常温下，以100r/min的转速搅拌24h,抽滤,水洗滤饼至水为中性,滤饼在105°C烘干； 3)改性凹凸棒土负载海藻酸钠的微球于40°C水浴，配制2%(w/v)海藻酸钠水溶液，搅拌使之呈均匀体系；称取酸改性凹土按1:10 (w/v)加入去离子水，置于回旋式振荡器上以100r/min转速震荡，分散24h，将分散的酸改性凹土加入2%(w/v)海藻酸钠水溶液中置于搅拌器内搅拌，酸改性凹土与2%(w/v)海藻酸钠水溶液比例为1:10( 八)，在40-601下复合2h ;将复合液体通过内径为O. 8mm的娃胶管由恒流泵以10 ml/min的速度滴到2% (w/v)CaCl2溶液中，复合液体与2%(w/v) CaCl2溶液的体积比为1: 1，持续搅拌交联固化12h，抽滤，并用去离子水冲洗，85°C干燥，冷却，研细过100目筛，得凹凸棒土负载海藻酸钠微球； 4)β_葡萄糖苷酶的固定将凹凸棒土负载海藻酸钠微球加入到装有浓度为10mg/ml的β -葡萄糖苷酶ΡΗ6. O柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的容器中，凹凸棒土负载海藻酸钠微球与葡萄糖苷酶的质量比例为30:1 40:1，温度40°C，150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼-40°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥18-20h，冻干后水分控制在4-5%，真空包装，得凹凸棒土负载海藻酸钠固定化葡萄糖苷酶。
全文摘要
本发明公开了一种凹凸棒土负载壳聚糖包被橙色粘球菌的固定化方法，以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载壳聚糖，再采用包埋、吸附法相结合对橙色粘球菌进行固定化。本发明利用凹凸棒土负载壳聚糖固定橙色粘球菌，降低橙色粘球菌活菌制剂生产成本，提高活菌存活率，操作方便，可适用于粗放的工业化大生产。
文档编号C12N11/10GK103045581SQ201210561348
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者贾建波 申请人:淮阴工学院