g/mL Be，Mg， In，Co调谐溶液、lOg/mL Cr，Ni，As，se，cd，cs，Pb混合标准溶液、lOg/mL Hg标准溶液、 1000~g/mL Au标准溶液（美国Perkin Elmer公司）JOOOg/mLl乙标准溶液、GBW10016茶 叶（中国计量科学研究院）；30%过氧化氢、浓硝酸（GR，Mer. ck公司）；超纯水（18. 2M~/ em);烟叶样品（采收实施例1中所述每盆栽所有成熟烟叶）。
[0070] 所用仪器：ELAN动态反应池（DRC) -电感耦合等离子体（ICP) -质谱（MS)仪（美 国Perkin Elmer公司）；Rotorl6微波消化器（美国Perkin Elmer公司）；超纯水仪（美 国Millipore公司）；PL601_L电子分析天平（0. 0001g，瑞士梅特勒公司）。
[0071] 将烘干备用的烟叶样品去梗粉碎，过40目筛，为保证数据的准确度，每个样品称 取两个平行样，两个平行样〇. 2000g烟粉样品，称好的样品置于聚四氟乙烯消化罐内。加入 样品后，依次加入（土壤消解65%浓硝酸5mL、30%过氧化氢2mL，48-51%氢氟酸lmL)旋紧 密封，置于Mars5型微波消解仪（美国CEM公司）中，按设置的微波消解程序（如表1)进 行消解，消解结束后，待微波消解仪的温度降至40°C以下，取出消解罐。
[0072] 表1 :微波消解升温程序
[0074] 在通风橱内打开消解罐，将消解罐中的试样溶液转移至预先称重的50mL聚对苯 二甲酸乙二醇酯（PET)样品瓶中，用水（GB/T 6682中一级水）洗涤消解罐内罐和瓶盖3~ 4次，洗涤液也转移至样品瓶中，转移样品完成后，用水（GB/T 6682中一级水）定容（总重 量<50g)，称量并记录样品瓶的总重量，样品摇匀后即可用于进一步的检测，对照为未加样 品的空白处理液。
[0075] 采用7500a电感耦合等离子体质谱仪（美国AG，ILENT公司）对消解后的烟叶样 品进行分析时，打开仪器，按下述参数进行优化。
[0076] 射频功率：1300W ;载气流速：1. 20L/min ;进样速率：0. lr/s ;获取模式：全定量分 析；重复次数：3 ;元素测定参数按表2设定。
[0077] 表2元素测定质量数、内标元素、积分时间
[0079] 制作标准曲线：在线加入内标溶液，分别吸取标准空白溶液和不同浓度砷、镉、铅、 氧化砷的标准工作溶液，注入电感耦合等离子体质谱中，在选定的仪器参数下，以待元素 砷、镉、铅、氧化砷含量与对应内标元素含量的比值为横坐标，待测元素砷、镉、铅、氧化砷质 荷比强度与对应内标元素质荷比强度的比值为纵坐标，建立砷、镉、铅、氧化砷的工作曲线。 对校正数据进行线性回归，求得砷、镉、铅、氧化砷的回归方程，R2应不小于0. 999。
[0080] 样品测定：在线加入内标溶液，分别吸取试样空白溶液和试样液，注入电耦合等离 子体质谱中，在选定的仪器参数下，得到待测元素砷、镉、铅、氧化砷质荷比强度与对应内标 元素质荷比强度的比值，带入以上工作曲线的线性回归方程，计算得试样空白溶液和试样 液中砷、镉、铅、氧化砷的浓度。
[0081] 结果的计算：试样中的砷、镉、铅、氧化砷含量按下式进行计算：
[0083] 式中：
[0084] X--试样中铬、镍、砷、硒、镉、铅的含量，单位为微克每克（μ g/g);
[0085] c--试样溶液浓度，单位为微克每升（μ g/L);
[0086] c〇--试样空白溶液浓度，单位为微克每升（μ g/L);
[0087] V--试样溶液体积，单位为毫升（mL);
[0088] m 试样质量，单位为克（g);
[0089] w--试样中水分含量％。
[0090] 结果的表述：以两个平行样品测定的平均值为测定结果，结果精确到0. 01 μ g/g。 两次平行测定结果之间的相对偏差不应大于5. 0%。
[0091] (8)统计分析
[0092] 采用SPSS 20. 0、MATLAB. R2012b软件进行数据处理、统计分析。
[0093] (9)结果与分析
[0094] 结果中的CK指没有内生真菌处理的烟草。混合胁迫中，Rhizopycnis sp. NYN8G01 降低烟叶中砷As3+含量效应达17. 04%，Cd2+效应达27. 79 %，Pb2+效应达49. 38 % ; (Rhizopycnis sp.)NYN8C05 降低烟叶中砷 As3+含量效应达 21. 11%，Cd2+效应达 32. 53%， Pb2+效应达26. 62% (表3) ;Lecanicillium sp. NYN771C06降低烟叶中砷As3+含量效应达 11. 16%，Cd2+效应达 27. 21%，Pb2+效应达 53. 86%。
[0095] 表3 Cd2+、As3+、Pb2+混合胁迫30d后不同菌肥制剂处理云烟87叶片中重金属含量
[0096]
[0097] 对植物和共生微生物的互作研究表明，植物根系和共生微生物的互作对植物吸收 重金属和对重金属的耐受性具有重要影响。很多植物都有菌根真菌（AM)，菌根真菌在植物 根部定殖增加了根的吸收表面积，在土壤中扩展延伸的真菌菌丝帮助植物吸收包括重金属 在内的营养物质。菌根真菌种类和寄主植物基因型对菌根真菌在植物根部的定殖及对营养 吸收的效果有显著的差异。结果表明，菌根真菌的根外菌丝能将土壤中的重金属吸收固定， 但重金属从真菌到植物的迀移受到限制，或很少迀移到植物地上部。因此共生微生物能否 限制或降低烟草对重金属元素的吸收，或改变重金属从植物根系到地上部的迀移，对于降 低烟草重金属含量非常关键。筛选发现造成烟草重金属低积累或根茎超积累而烟叶低积 累的共生微生物在烟草重金属减害方面显示良好的应用潜力。Rhizopycnis sp. NYN8G01、 Rhizopycnis sp. NYN8C05、Lecanicillium sp. NYN771C06 实验组烟草，降低烟草的重金属， 尤其是砷As3+、镉Cd2+、铅Pb2+含量方面有非常明显作用。
[0098] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种内生真菌菌株（sp. )NYN8C05,保藏单位：中国典型培养物保藏 中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCN0:M2015219,保藏时间2015年 4月10日。2. 权利要求1所述的内生真菌菌株NYN8C05的用途，该用途用于降低烟叶中镉、砷或铅 的含量。3. -种内生真菌菌肥制剂，其特征在于该内生真菌菌肥制剂包括权利要求1所述的内 生真菌菌株NYN8C05。4. 一种权利要求3所述的内生真菌菌肥制剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下 的步骤： 1) 菌株活化、一级种子培养、二级种子培养 菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养基上，封 口后置于恒温培养箱中，24h黑暗，25°C，活化培养； 一级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中，于 150以11^11，25°(：培养7211; 二级种子液培养：200ml-级种子液用搅拌器打碎并摇晃混勾，吸取20ml接种于200ml液体种子培养基，于150r/min，25°C培养72h; 2) 固态培养： 200ml二级种子培养液打碎并摇晃混勾，吸取2ml接种于10g固态培养基质中，于25°C条件下黑暗培养7d; 3) 内生真菌菌肥制剂的制备 称取200g麸皮，添加100ml水，拌匀后置于1000ml锥形瓶内，8层纱布4层报纸封口 后，121°C，0· 15Mpa灭菌30min，冷却备用； 每个灭菌待的麸皮培养基，接种二级培养液40ml，置于恒温培养箱中，24h黑暗，25°C， 培养。
【专利摘要】本发明属于微生物及微生物应用领域，尤其涉及一种内生真菌菌株NYN8C05，其在降低烟草吸收重金属方面的用途。内生真菌菌株<i>（</i><i>Rhizopycnis？sp.</i><i>）</i>NYN8C05的特征为：菌落生长较慢，呈灰黑色，表生绒毛状灰色菌丝。菌落背面灰色至灰黑色，间淡色轮纹，明显轮纹状。菌丝暗色有隔且多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状。ITS？rDNA区的序列分析鉴定为<i>Rhizopycnis</i>？sp.，ITS序列见序列2。CCTCC NO:M201522020150410
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/14, C05F11/08
【公开号】CN105316241
【申请号】CN201510518527
【发明人】徐清泉, 夏琛, 程昌合, 金慧清, 解莹莹, 刘化冰, 李石头, 幕继瑞, 李信军, 章初龙, 冯晓晓, 刘宏玉, 林福呈
【申请人】浙江中烟工业有限责任公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年8月21日