耐热耐酸的α-淀粉酶基因工程菌重组酶及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐热耐酸的α-淀粉酶基因工程菌重组酶及应用方法，属于食品生物【技术领域】。方法包括基因工程重组、转化、发酵工艺优化、酶活力测定。优点是酶活力高，耐受的温度高，耐受的酸碱度宽，使用方便。
【专利说明】
耐热耐酸的Cl-淀粉酶基因工程菌重组酶及应用
【技术领域】
[0001]本发明属食品生物【技术领域】，是生物技术在食品酶学方面的探索性应用研究。
【背景技术】
[0002]耐高温α -淀粉酶属于水解酶类，能随机水解淀粉、糖原及降解物内部的a -D-1,4糖苷键。它能使淀粉溶液的粘度迅速下降，产生可溶性糊精、低聚糖及少量麦芽糖、葡萄糖。目前以α-淀粉酶为代表的工业酶制剂类已占据25%的市场份额，广泛地用于淀粉水解生成葡萄糖浆的液化，酿造、改性淀粉以及改善面粉的烘焙过程。微生物中有数百种嗜热真菌和上千种细菌可以产生淀粉酶，仅芽孢杆菌属{Bacillus)就有48个种能产生淀粉酶，但是产生高温淀粉酶的微生物较少。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是公认的产耐高温α-淀粉酶的优良菌种，但菌种本身是通过多代诱变而得到的高产菌株，存在着产酶条件不稳定、易发生回复突变、发酵条件难控制、酶生产易污染等不足。早在20世纪70年代就开始了基因工程表达耐高温α-淀粉酶的研究。巴斯德毕赤酵母{Pichia pastoris)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，操作简单，表达量高，具有大肠杆菌表达系统和其它酵母表达系统无法比拟的优越之处。
[0003]为寻求适于工业生产的耐高温α-淀粉酶产生菌及其发酵条件，有必要经过一系列的技术方法改造获得真正意义的用于工业生产的高产菌株，生物技术便是手段之一。本发明利用自主构建的地衣芽孢杆菌耐高温α -淀粉酶的重组毕赤酵母(P.pastorisGS115)基因工程菌，通过优化发酵条件来提高酶产量和酶活性，降低生产成本，为工业化规模发酵生产奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供耐热耐酸的α -淀粉酶基因工程菌重组酶及应用方法。该方法简单，制备的α -淀粉酶基因工程菌重组酶纯度高，活性高，耐受酸碱度宽。
[0005](I)表达载体,所用的酵母分泌型表达载体为pPICZ a A、pPIC9购自Invitrogen公司。
[0006](2) α -淀粉酶基因工程菌重组所用的引物:
Upstream primer 2:5 ‘-GAATTCGCGACCTTGGATTCATGGTT-3’
Downstreamprimer3:5 ‘-GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG-3’
(3)将重组质粒电转化到酵母表达载体，并用内切酶和#0(1进行双酶切进行鉴定正确连接。
[0007](4)进行接种量、甲醇添加量、pH、诱导时间对耐高温α -淀粉酶酶活的影响，筛选并确定最佳的发酵条件。
[0008](5)根改善酶活条件，使用CaCl2和MgCl2复合体系活性提高。
【具体实施方式】
实施例
[0009]I通过RT-PCR反应，成功地克隆淀粉酶的结构基因，然后成功构建酵母分泌表达载体，筛选到5株淀粉酶表达量和酶活相对较高的重组酵母菌。
[0010]2取冻存于-20 °C的地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶的重组毕赤酵母(ApaWorisGSllS)基因工程菌将其接种到新鲜的YH)培养基中30 °C >200 r/min摇瓶培养约14 h，观察菌液出现浑浊时再以3%的接种量转接到BMGY培养基中30 °C>150 r/min培养24 h，离心弃上清，菌体沉淀转接到BMMY中，30 °C >200 r/min发酵，每隔24 h补加甲醇使其终浓度为0.4% (每瓶均为100 mL培养基装于500 mL锥形瓶中)。培养72 h离心发酵液(4 0C , 10000 r/min, 20 min)，上清即为粗酶液，然后测定酶活性。
[0011]3接种量对耐高温α -淀粉酶酶活的影响
菌液密度0D600达到5.0后，分别将25、50、100、200、250 mL BMGY培养基上生长的菌体3 000 r/min，离心15 min，菌体沉淀依次接种到100 mL，接种量150mL/100Ml,含有0.4%甲醇的BMMY培养基上，每隔24 h补加甲醇使其终浓度为0.4%，培养72 h，检测菌体生长密度及耐高温α-淀粉酶的酶活性。
[0012]4甲醇添加量对耐高温α -淀粉酶酶活的影响
将100 mL BMGY培养基中的菌体沉淀分别转接到100 mL含有甲醇百分比浓度为0.2、0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1.0的诱导培养基上进行培养，24 h后分别补加相同浓度的甲醇，诱导培养72 h后收获发酵液，检测菌体生长密度及耐高温α-淀粉酶的酶活性。
[0013]5ρΗ对耐高温α -淀粉酶酶活的影响及最适pH值的确定
以0.1 mo I/L的Na2HPO4-NaH2PO4为缓冲液，将100 mL生长培养基中的菌体沉淀分别接入100 mL，pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，含甲醇0.4%的诱导培养基上进行培养。诱导培养72 h后收获发酵液，检测菌体生长密度及耐高温α-淀粉酶的酶活性，确定酶的最适pH值。
[0014]6诱导时间对耐高温α -淀粉酶酶活的影响
将100 mL BMGY培养中的基菌体2 000 r/min, 15min离心,菌体沉淀接入100 mL, pH为6.0，含甲醇0.4%的BMMY培养基中诱导培养108 h，诱导24 h后每隔12 h取样一次，检测菌体生长密度及耐高温α-淀粉酶的酶活性。
[0015]7 酶活
根据权利要求1d所述的改善酶活条件，其特征在于使用CaCl2和MgCl2复合体系活性提高，提高的条件为，加入CaCl2和MgCl2溶液，使Ca2+终浓度为0.08?0.12 mol/L, Mg2+终浓度为0.04?0.06 mol/L，在20?25°C下活力提高11%。
【权利要求】
1.本发明涉及耐热耐酸的α-淀粉酶基因工程菌重组酶及应用方法，其特征在于所述方法包括下述步骤: a地衣芽孢杆菌的基因组为模版，首先通过PCR扩增出目的基因，然后通过双酶切，载体连接及电转化技术构建重组酵母工程菌； b对重组酵母工程菌的最佳发酵条件进行优化； c对重组表达的淀粉酶的耐受的最高温度和最适的pH条件进行测定； d使用CaCl2和MgCl2复合体系改善耐高温淀粉酶的活性。
2.根据权利要求1a所述的地衣芽孢杆菌的基因组，其特征在于获得地衣芽孢杆菌的结构基因，要求包括酶所有的活性中心的氨基酸。
3.根据权利要求1b所述的最佳发酵条件进行优化，其特征在于依次对接种量、甲醇添加量、耐受PH范围、诱导时间对耐高温α-淀粉酶酶活的影响，筛选并确定最佳的发酵条件:接种量150mL/100mL、甲醇添加量0.4%、pH耐受范围4.5-9.4、诱导时间72h。
4.此时耐高温α-淀粉酶酶活为228.0U/mL。
5.根据权利要求1c所述对耐受的最高温度和最适的PH条件进行测定，其特征在于:耐受的最高温度为95、20min,最适pH为6.1。
6.根据权利要求1d所述的改善酶活条件，其特征在于使用CaCl2和MgCl2复合体系活性提高，提高的条件为，加入CaCl2和MgCl2溶液，使Ca2+终浓度为0.08、.12 mol/L,Mg2+终浓度为0.04?0.06 mol/L，在20?25°C下活力提高11%。
【文档编号】C12R1/84GK104419690SQ201310403265
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】孟宪梅, 潘风光, 柳增善 申请人:吉林工商学院