枯草芽孢杆菌x3及其在降低水牛粪便硫化氢生成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了枯草芽孢杆菌X3及其在降低水牛粪便硫化氢生成中的应用。枯草芽孢杆菌X3(Bacillus?subtilis?X3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年06月16日，编号为CCTCC?NO:M2013261，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。以水牛养殖场内土壤等作为菌株分离来源，对枯草芽孢杆菌X3(Bacillus?subtilis?X3)于37℃下培养24小时后，按20%（W/W）的比例直接接种到装有水牛粪便的密闭烧杯中，室温下培养2～8天，使硫化氢降低。与添加等比例无菌水的对照组相比，枯草芽孢杆菌X3能降低水牛粪便中硫化氢生成19.59%～52.74%，具有效率高、营养要求低、操作简单、安全性高优点。
【专利说明】枯草芽孢杆菌X3及其在降低水牛粪便硫化氢生成中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株可降低水牛粪便中硫化氢气体生成的新菌株枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)及其在降低粪便硫化氢生成中的应用。
【背景技术】
[0002]近年来，我国畜禽养殖业发展迅速，规模化养殖比例不断增加，在满足日渐提高的畜禽产品需求和改善人民生活水平的同时，也带来了一系列的生态问题。家畜粪尿在产生、处理、存放和排放过程会产生大量的恶臭物质，这些恶臭物质成分复杂，主要含有氨、硫化物、胺类和挥发性脂肪酸等化学物质。恶臭是指一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快和损坏生物环境的物质。恶臭作为7种典型公害之一(大气污染、水质污染、恶臭、土壤污染、噪声、振动、土地下沉)，其物质种类繁多，影响范围大，并且严重危害人体健康，它对人体的毒害是多方面的:(1)危害神经系统。长期受到一种或几种低浓度的恶臭物质刺激，首先使嗅觉脱失，继而导致大脑皮层兴奋与抑制过程的调节功能失调。有的恶臭物质，如硫化氢不仅有异臭作用，同时也对神经系统产生毒作用；(2)危害呼吸系统。当人们嗅到臭气时，会反射性地抑制吸气，妨碍正常呼吸功能；(3)危害循环系统。如氨等刺激性臭气，会使血压出现先下降后上升，脉搏先减慢后加快的变化。硫化氢还能阻碍氧的输送，而造成体内缺氧；(4)危害消化系统。经常接触恶臭物质，使人食欲不振与恶心，进而发展成为消化功能减退；(5)恶臭会使内分泌系统的分泌功能紊乱，而影响机体的代谢活动。此外氨和醛类对眼睛有刺激作用，常引起流泪、疼痛、结膜炎、角膜浮肿；(6)臭味还会阻碍人际关系的良好发展，影响个人、家庭或某一场所的外在形象。长期受到恶臭的持续作用会使人烦躁、忧郁、失眠、注意力不集中、记忆减退，从而使学习和工作效率降低。由于臭味对人体感观和健康的影响，引起世界各国的普遍重视，有关除臭技术的研究已成为环境治理工程中的一个重要的环节。
[0003]目前，对于臭味的去除方法主要有:(I)化学除臭法(氧化法，吸收法，吸附法)包括燃烧法(热力燃烧，催化燃烧)；(2)物理除臭法，如掩避法，稀释扩散法等；(3)生物除臭法，主要是利用微生物除臭，通过微生物的生理代谢将具有臭味的物质加以转化。对于大流量、低浓度的挥发性有机废气和恶臭气体，使用物理和化学法处理存在投资大、操作复杂、运行成本高的问题。早在1957年，美国就报道了利用土壤脱臭法处理硫化氢的专利。生物除臭方法因其具有适用范围广、处理效率高、无二次污染、所需设备简单、便于操作、运行成本低、环境负荷低和维护管理简单方便的特点，可广泛应用于污水处理厂、垃圾处理场、公园中的湖泊和水沟、畜牧养殖场等不同场所。在20世纪80年代末90年代初，生物除臭技术得到迅速发展，并逐渐发展成除臭技术的主流。它是一种利用微生物分解恶臭物质使其无臭化、无害化的处理方法，因此也叫微生物除臭法。生物除臭法按处理方式分有生物过滤法、生物洗涤法、生物滴滤法等；按填充材料分有土壤除臭法、珍珠岩棉除臭法、堆肥除臭法、活性污泥除臭法、泥炭土除臭法和锯末除臭法等。由于来自畜禽养殖或粪尿处理场的臭气中最主要成分是氨气和硫化氢，生物除臭法也正是源于此目的而发展起来的，所以这些方法对于消除氨气和硫化氢的臭味最为有效。目前各国对牛粪等的处理方法不外乎采用厌氧消化，即沼气发酵。而目前真正用微生物直接除去牛粪中，尤其是水牛粪便中所产生的臭气味的研究报道尚少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株可降低水牛粪便中硫化氢气体生成的新菌株枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)及其在微生物降解硫化氢的应用。
[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案是:
[0006]1.枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年06月16日，编号为CCTCC N0:M2013261，保藏地址:中国?武汉?武汉大学。
[0007]本发明所提供的硫化氢降解菌分离自广西壮族自治区水牛研究所的水牛养殖场附近草地土壤，命名枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)，经形态特征及16SrRNA序列初步鉴定为_，目前尚无利用_降低水牛粪便中的硫化氢生成的报道。
[0008]菌株的形态:杆状，在固体培养基37°C培养24小时后菌落成乳白色,圆形,边缘光滑，湿润，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄。
[0009]本菌株的获得:从广西壮族自治区水牛研究所的水牛养殖场附近草地土壤中取样，通过初步，复筛，获得具有降低水牛粪便硫化氢生成的纯培养物，对该培养物进行形态和16SrRNA鉴定，将其鉴定为 枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)。
[0010]本菌株的分离、筛选:将土壤样品以10% (W/W)的比例接种于装有新鲜水牛粪便的烧杯中，每种三个重复，用玻棒搅拌均匀，密闭，室温下连续培养7天，每隔24h用感官法判定除臭效果。如有明显除臭效果的处理，立即取样稀释进行微生物分离纯化实验，即采用多次平板划线法从具有明显除臭效果的样品中分离单个菌株，所用培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
[0011]菌株的形态:杆状，在固体培养基37°C培养24小时后菌落成乳白色,圆形，边缘光滑，湿润，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄。
[0012]菌株的16SrRNA序列测定:采用机械破壁法将X3菌株的DNA提取出来，经纯化后，选用引物 8f(5’ -CACGGATCCAGAGTTTGAT (C/T) (A/C) TGGCTCAG-3’)/1510r (5，-GTGAAGCTTACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3，)扩增细菌的16SrRNA序列并送检测序，利用Blast将所测得的序列与GenBank数据库中的16SrRNA基因序列进行同源性比较分析，其同源性与GenBank数据库中许多枯草芽孢杆菌的同源性在99%以上，所以将菌株X3命名为枯草芽孢杆菌 X3 (Bacillus subtilis X3),其 16SrRNA 序列如下(5，一 3’):
[0013]I tctgtccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa
[0014]61 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc
[0015]121 tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa
[0016]181 ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc
[0017]241 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc
[0018]301 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag[0019]361 atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca
[0020]421 accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga
[0021]481 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg
[0022]541 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg
[0023]601 gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc
[0024]661 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc
[0025]721 ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta
[0026]781 cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt
[0027]841 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc
[0028]901 gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc
[0029]961 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa
[0030]1021 cggtacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc
[0031]1081 ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag
[0032]1141 gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat
[0033]1201 cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa
[0034]1261 gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt
[0035]1321 agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc
[0036]1381 cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag
[0037]1441 gcacgcc
[0038]菌株的培养:取配制好的枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)菌悬液2ml接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在37°C培养箱中培养24小时。
[0039]菌株的保藏:与已灭菌40%甘油混匀后，于_20°C冰箱中保存。
[0040]本发明所述的枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)在微生物降低硫化氢中的应用。
[0041]将50g牛粪加入1000ml塑料大烧杯中，按20%接种量接种菌株枯草芽孢杆菌X3培养液，以等量无菌水作为对照；在一个大烧杯放入盛有20ml锌铵络盐溶液的小烧杯，用以吸收硫化氢(测定方法见附录I)。大烧杯用两层塑料膜和一层保鲜膜密封，做两个重复，室温下培养；每隔2天，取小烧杯检测硫化氢的释放量，连续8天。实验证明，枯草芽孢杆菌 X3(Bacillus subtilis X3)(编号为 CCTCC N0:M2013261)能够有效地降低 19.59% ~52.74%水牛粪便中的硫化氢气体生成。
[0042]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:针对水牛粪便特点，本菌株具有高效降低硫化氢气体生成的特点，且操作简便，应用前景广阔。
【具体实施方式】
[0043]下面结合实施例对本发明 作进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。
[0044]实施例1
[0045]枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3，编号为 CCTCC N0:M2013261)的分离。
[0046]枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3 编号为 CCTCC N0:M2013261)的分离包括样品初筛和菌株分离两部分:[0047]1.含高效除臭微生物的样品来源初筛:
[0048](I)分别称量牛场外下水道淤泥、鱼塘水、牛场内下水道淤泥、鱼塘边淤泥、草地干牛粪10g，放入离心管(注意:应留出一小截空间不装满，避免冷冻后体积增大胀出)，-200C保存，每种样品存放3管。
[0049](2)称量20g新鲜牛粪加入培养皿。
[0050](3)称量牛场外下水道淤泥、鱼塘水、牛场内下水道淤泥、鱼塘边淤泥、草地干牛粪、无菌水按10%(w/w)接种入装有新鲜牛粪的培养皿，每种三个重复。玻棒搅拌均匀。
[0051](4)盖好培养皿，室温下培养。
[0052](5)计时观察，每隔24h用感官法判定除臭效果(感官法判定除臭效果标准见表
I),连续7天。
[0053](6)如有明显除臭效果的培养基，标记。并立即取样稀释进行微生物分离纯化实验。
[0054]表1感官法判定除臭效果标准
【权利要求】
1.枯草芽孢杆菌X3(Bacillus subtilis X3),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2013年06月16日，编号为CCTCC N0:M2013261，保藏地址:中国.武汉.武汉大学。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌X3(Bacillus subtilis X3)_,其特征在于,所述的枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)特征为:杆状，在固体培养基37°C培养24小时后菌落成乳白色，圆形，边缘光滑，湿润，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌X3(Bacillus subtilis X3)，其特征在于枯草芽抱杆菌 X3 (Bacillus subtilis X3)的 16SrRNA 序列如下(5，—3，):1 tctgtccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa
61 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc
121 tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa
181 ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc
241 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc
301 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag
361 atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca
421 accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga
481 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg
541 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg
601 gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc
661 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc
721 ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta
781 cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt
841 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc
901 gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc
961 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa
1021 cggtacttgt tct tccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc
1081 ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag
1141 gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat
1201 cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa
1261 gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt
1321 agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc
1381 cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag
1441 gcacgcc 。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌X3(Bacillus subtilis X3)在微生物降解粪便中硫化氢的应用。
5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌X3(Bacillus subtilis X3)在降低水牛粪便硫化氢生成中的应用，其特征在于:对枯草芽孢杆菌X3 (Bacillus subtilis X3)进行扩大培养，然后接种于粪便中，使粪便中的硫化氢降低。
【文档编号】C12R1/125GK103484402SQ201310403129
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杨承剑, 李婉, 梁辛, 梁贤威, 韦升菊, 李舒露, 杨炳壮, 邹彩霞, 李丽莉 申请人:广西壮族自治区水牛研究所