SEQ ID NO. 1所示，与从NCBI中比对获得的相近霉菌的 18SrDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，然后采用MEGA4. 0生物学软件构建系统 进化树，结果显不菌株AWS26的18SrDNA核苷酸序列与Trichodermaatroviride (JX462604) 的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性（maxident)达到99%。综合结合其形态 特征、培养特征观察，将菌株AWS26鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0056] 实施例2
[0057] 本实施例说明以深绿木霉为菌株固态发酵法制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，包 括以下步骤：
[0058] 步骤1，菌种制备：首先，在无菌条件下挑取两环保藏的试管菌种孢子接种于活 化斜面培养基上活化，30-35?培养箱培养3-5天；然后，向活化好的深绿木霉斜面中注入 ImL无菌生理盐水，移液枪反复吹打斜面孢子，进一步将孢子浓度稀释至IO7个/mL，再接 种孢子数含量为以上浓度的孢子悬浮液2mL到装有50g固态孢子培养基的250mL三角瓶 中，充分摇动三角瓶使孢子同培养基充分混勾，30-40 °C培养箱培养3-4天，每天翻动一次 固态培养基；最后，在500mL三角瓶中装IOOmL液体种子培养基，灭菌冷却，接种2mL孢子 浓度为I. 2-1. 6X108cfu/mL的孢子悬液，置于旋转式摇床上30-40°C培养l-2d，摇床转速 16〇-250r/min。
[0059] 活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL，麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，蔗糖 lg，琼脂粉 3g，ρΗ5· 0-6. 0,121°C灭菌 15min。
[0060] 固态孢子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土 豆浸出液8mL，121°C灭菌15min。
[0061] 深绿木霉孢子悬液的制备：在无菌条件下，将无菌生理盐水倒入深绿木霉孢子培 养好的三角瓶中，使生理盐水完全覆盖固体培养基，然后将三角瓶置于磁力搅拌机上中速 搅拌30min，使得充分打碎菌丝体，从而释放孢子，然后将制备好的孢子悬液取样在雪球计 数板上计数，调节孢子浓度至1. 2-1. 6 X 108cfu/mL。
[0062] 补料液体营养液的制备：玉米秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按照质量 比1:1:1混合，然后向固体混合物中加入去离子水至浓度为10%，煮沸30min，过滤去除深 褐色滤液。向滤渣中加入浓度为1 %的稀硫酸，固体混合物：稀硫酸=1:10 (g/l〇〇mL)，于 121°0水解211，冷却至60°0并在该温度下用0&(0!1) 2调节水解液至？!110.0,60°0水浴保温 30-40min，冷却至室温，过滤除去滤渣并保留水解液，再用HCl调节pH至6. 0,即得到补料液 体营养液。
[0063] 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：在500mL三角瓶中加入固态培养基50g，121°C 灭菌后接入深绿木霉液体种子2ml，35-40 °C条件下培养2-3d，再将温度提高至40-45 °C条 件下继续培养2天后，无菌条件下向三角瓶中添加补料液体营养液10-20ml，将三角瓶摇晃 均匀，再将温度降至30-37?下继续培养至7-8d，每天晃动三角瓶2次，在该发酵条件下产 酶量为：176. 35U/g。
[0064] 固态发酵培养基：玉米秸杆粉lg，大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米 粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，无机盐液的起始pH5. 0,装 250mL三角瓶中，121°C，灭菌20min。
[0065] 无机盐液：（NH4)2SO4L 25g，尿素 lg，KH2PO4L 0g，MgSO4 · 7Η200· 5g，NaNO3O. 2g， FeCl30.0 2g，吐温-80 0· 5mL，水 500mL。
[0066] 土豆浸出液的制备方法：100g土豆切成Icm3方块，煮沸30min，4层纱布过滤后，补 充水至100mL。
[0067] 麸皮浸出液的制备方法：麸皮15g，加水100mL，煮沸30min，过滤得滤液，补充水至 IOOmL0
[0068] 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行了曲盘放大 试验。曲盘大小为：36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘。固液比1.2: I (g/100mL)，初始pH5. 5, 33-35°C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养 液20ml，温度调至35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次；最后将温度降至28-32°C，再培养 24h。酶活达到205. 14U/g干曲。
[0069] 曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼 粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，无机盐液的起始pH5. 0,装三角瓶中， 121°C 灭菌 20min。
[0070] 无机盐液：（NH4)2SO4L 25g，尿素 lg，KH2PO4L Og，MgSO4 · 7Η200· 5g，NaNO3O. 2g， FeCl30.0 2g，吐温-80 0· 5mL，水 500mL。
[0071] 土豆浸出液的制备方法：100g土豆切成Icm3方块，煮沸30min，4层纱布过滤后，补 充水至100mL。
[0072] 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转 蒸发，得粗酶浓缩液。
[0073] 浸提：向培养后的固体曲中按浸提比（w/v) 1:10的量加入蒸馏水，于50°C浸提lh， 四层纱布过滤，虑液8000r/min离心10min，上清液保存备用。向上清液中中按20g/L的量 加入颗粒状活性炭，70°C脱色30min，然后过滤除去活性炭渣滓。
[0074] 超滤：利用截留分子量为120kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2)对脱色后 的粗酶液超滤分离，超滤截留液的体积减少至原体积的6~10%时，添加去离子水至原体 积的1/2,继续超滤至截留液为原体积的3-5%。收集两次的滤出液。超滤条件：进口压力 0· 3MPa，出口压力0· 2MPa，流速I. 4L/h。利用截留分子量为40kDa的平板式超滤膜（聚醚 砜材质，0. 09m2)对上部获得的滤出液进行超滤浓缩，当超滤至截留液为原体积的30%时， 停止超滤，收集截留液。分离条件：进口压力〇· 4MPa，出口压力0· 5MPa，流速I. lL/h。
[0075] 旋转蒸发浓缩：用旋转蒸发仪，0. 09MPa，50°C减压蒸发浓缩超滤后的阿魏酸酯酶 粗酶液，浓缩至浓缩前体积的20-30时，停止浓缩。
[0076] 步骤5,粗酶制剂制备：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、 脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。
[0077] 硫酸铵分级沉淀：将盛有IOOmL粗酶的烧杯放在另一个装有冰水的大烧杯中，然 后将大烧杯置于磁力搅拌器上，一边搅拌一边慢慢加入烘干研磨后的硫酸铵至饱和度为 20%，加完后继续搅拌30min，使硫酸铵充分溶解，4°C冰箱中放置6h后，5000r/min离心 20min，除去沉淀。然后按着上述操作再加入硫酸铵至饱和度为80%。4°C冰箱中放置6h 后，5000r/min离心20min。沉淀用5-10体积的纯水溶解，上清液透析除盐后，测定其蛋白 含量和酶活力。
[0078] 脱盐柱脱盐：将硫酸铵80%饱和度的沉淀物用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl缓 冲液溶解，上Sephacryl S-100凝胶过滤柱脱盐。