木质素降解液及制备方法以及用其降解木质素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学和生物炼制方法，具体涉及一种木质素降解液及制备方法以 及用其降解木质素的方法。
【背景技术】
[0002] 随着化石资源不断枯竭，利用生物炼制技术从木质纤维素原料中获取乙醇、丁醇 等液体燃料以及化学材料和化学品将成为石油炼制的重要补充。由多种苯丙烷基结构单元 高度交联而成的木质素是木质纤维素中的主要成分，也是地球上含量最丰富的生物高分子 之一，木质素的生物转化极为困难，它不仅限制了木质纤维素中纤维素和半纤维素等多糖 组分的转化，也是生物炼制废弃物的主要成分。因此，木质素的高效降解转化是当前生物炼 制工业的发展重点和必然趋势。
[0003] 白腐菌（white rot fungus)是自然界中木质素的主要分解者，也是唯一可以完全 降解木质素的一类微生物。白腐菌通过胞外分泌的锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶 等木质素酶降解木质素。当前，已经从Phanerochae te sp·、Echinodon tium sp·、Irpex sp、Pleuro tus sp.、Trame tes sp.、Ganoderma sp.等白腐菌中分离出多种木质素酶。但 是，大多数研宄仅将漆酶或漆酶/介体系统用于体外催化木质素的降解。研宄表明，在漆酶 作用下，木质素大分子的主要结构骨架降解甚微，漆酶催化过程中木质素片段的再聚合也 会对木质素降解产生不利影响。因此，通常先用理化方法将木质素大分子降解为简单的小 分子木质素片段或使木质素改性，再利用漆酶或漆酶/介体催化系统降解。如在造纸制浆 工艺中，常先利用化学制浆工艺去除木材中大部分木质素，再利用漆酶或漆酶/介体系统 降解纸浆残余木质素片段进行生物漂白；中国科学院过程工程研宄所陈洪章等先将玉米秸 杆蒸汽爆破，使木质素大分子解聚或改性，再利用漆酶降解，木质素降解率可达10-25 %。而 直接利用漆酶等木质素酶降解木质素则很少见报道。
[0004] 在天然环境下，白腐菌对木质素的降解通常依赖于几种木质素酶的共同作用。依 据其菌株来源、种类不同，白腐菌产生的木质素酶对不同木质素结构单元的降解具有偏好 性，且不同木质素酶对木质素底物的降解具有叠加增效作用，如锰过氧化物酶主要降解木 质素中的非酚型结构，而漆酶主要降解木质素中的酚型结构，漆酶在介体存在时对非酚型 结构也具有降解作用。木质素酶的复合作用不仅有利于木质素大分子中多样化的木质素结 构基团的同步降解，而且有利于抑制木质素降解产物的再聚合。因此，既然现有单一的漆酶 或漆酶/介体系统很难实现大分子木质素的高效降解，那么利用不同木质素酶构建复合催 化体系降解木质素应是一个可行的技术途径。当前，已有少数工艺利用几种木质素酶复合 降解木质素。但这些工艺通常利用粗酶液进行木质素的降解，如河南天冠企业集团有限公 司利用白腐菌粗漆酶和粗过氧化物酶协同降解秸杆木质素促进燃料乙醇的转化效率。但由 于粗酶液中成分非常复杂，很难确定木质素降解是木质素酶还是其它成分的作用，且每批 次酶液的成分都不可能保持一致，因此可能导致处理效果不稳定。而利用纯化的白腐菌漆 酶和锰过氧化物酶复合降解木质素的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种木质素降解液，同时提供其制备方法以及用于降解木质素的方 法，解决现有采用漆酶等单一木质素酶难以实现木质素高效生物降解的问题。
[0006] 本发明所提供的一种木质素降解液，包括漆酶和锰过氧化物酶，其特征在于：
[0007] 所述木质素降解液中，将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例， 溶于pH4~6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~ 50U/ml 和 lU/ml ~50U/ml，然后加入 1 ~IOmM MnSOjP 0. 1 ~ImM H2O2;
[0008] 所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得 到。
[0009] 所述的木质素降解液制备方法，依次包括制备木质素酶步骤和制备降解液步骤， 其特征在于：
[0010] (1)所述制备木质素酶步骤：将白腐菌分别接种于漆酶产酶培养基和锰过氧化 物酶产酶培养基，发酵后分别获得胞外粗酶液，分别经分离纯化后得到漆酶和锰过氧化物 酶；
[0011] ⑵所述制备降解液步骤：将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷 比例，溶于PH4~6的醋酸缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ ml和lU/ml~50U/ml，再加入1~IOmM MnSOjP 0· 1~ImM H2O2，得到木质素降解液。
[0012] 所述的木质素降解液制备方法，其进一步特征在于，所述制备木质素酶步骤中：
[0013] (I. 1)所述漆酶的制备包括下述子步骤：
[0014] A.从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇 床以50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种；
[0015] B.将所述液体菌种以体积比10 %~50 %的接种量接入漆酶产酶培养基，25°C~ 37°C下静置培养2~6d后，加入1~IOmM藜芦醇，继续培养3d~15d后，培养物过滤获得 漆酶粗酶液；
[0016] C.漆酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩后得 到电泳纯的漆酶；
[0017] (1. 2)所述锰过氧化物酶的制备包括下述子步骤：
[0018] A.从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇 床以50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种；
[0019] B.将所述液体菌种以体积比10%~50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养 基，25°C~37°C培养IOd~60d后，按质量体积比1 : 5~1 : 50加入蒸馏水浸泡培养物 Ih~8h，过滤获得锰过氧化物酶粗酶液；
[0020] C.锰过氧化物酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管 浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶。
[0021] 所述的木质素降解液制备方法，其更进一步特征在于，
[0022] 所述白腐菌为灵芝、乳白耙菌、糙皮侧耳、射脉菌、多孔菌中的一种或多种；
[0023] 所述漆酶产酶培养基组成为：每IOOmLKirk限氮液体培养基中加入0. 1~20g麸 皮，100°C~125°C灭菌 10 ~40min ;
[0024] 所述锰过氧化物酶产酶培养基组成为：将20目~80目的木质纤维素类生物质，按 质量体积比I : 1~1 : 5加入蒸馏水，pH自然，100°C~125°C灭菌10~40min;所述木 质纤维素类生物质包括竹粉、农业秸杆粉或木肩。
[0025] 利用所述木质素降解液降解木质素的方法，其特征在于：
[0026] 对于从生物质中分离获得的木质素高分子，添加所述木质素降解液，使木质素质 量浓度达到0. 2 %~5 %，于25 °C~50 °C通氧或不通氧反应2h~48h ;
[0027] 对于含有木质素的木质纤维素生物质，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓 度达到1%~10%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应12h~48h。
[0028] 所述木质素包括从生物质中分离获取的木质素高分子及木质纤维素生物质中的 木质素，从生物质中分离获取的木质素包括碱木素、酶解木质素、磺化木质素、磨木木质素 等；所述木质纤维素生物质包括草本类植物秸杆和木材，其中草本类植物秸杆包括荻竹、玉 米杆、麦杆、稻杆、高粱杆、棉杆、油菜杆、芒草等；木材包括各类木材加工后的木肩。
[0029] 本发明基于不同木质素酶对各种木质素结构单元降解的偏好性及降解作用的协 同增效，实现结构多样性丰富的大分子木质素各基团和连键的协同氧化降解，与现有单一 木质素酶降解反应体系相比，木质素高分子的降解率可达到30~50%，显著提高木质素降 解转化效率，尤其显著提升非酚型木质素的降解效率，适用于不同来源的木质素和木质纤 维素中木质素的高效降解，可用于木质纤维素生物炼制、生物制浆或环境处理等领域。
【附图说明】
[0030] 图1为木质素降解液LacP-MnpI降解玉米秸杆木质纤维素中的木质素效果示意 图。
【具体实施方式】
[0031] 为了便于理解，以下通过具体实施例对本发明进行详细描述。
[0032] 实施例1制备来源于多孔菌的漆酶LacT :
[0033] A.从多孔菌斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放 置于摇床以200r/min速度震荡培养8d，温度25°C，获得液体菌种；
[0034] B.将制备好的液体菌种以体积比10%的接种量接入漆酶产