结构的降解效率。
[0083] 实施例8制备木质素降解液LacG-MnpR :
[0084] 将漆酶LacG和锰过氧化物酶MnpR以10 : 1的酶负荷比例，溶于ρΗ4的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lOU/mL和lU/mL，再加入IOmM MnSO4 和0.1 mM H2O2，获得木质素降解液LacG-MnpR，可用于酶解木质素降解。
[0085] 实施例9制备木质素降解液LacT-MnpP :
[0086] 将漆酶LacT和锰过氧化物酶MnpP以10 : 1的酶负荷比例，溶于pH4. 5的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为50U/mL和5U/mL，再加入2mM MnSO4 和0. 5mM H2O2，获得木质素降解液LacT-MnpP，可用于麦杆、稻杆、木肩木质纤维素中木质素 降解。
[0087] 实施例10制备木质素降解液LacP-MnpI :
[0088] 将漆酶LacP和锰过氧化物酶MnpI以1 : 5的酶负荷比例，溶于pH4. 8的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lOU/mL和50U/mL，再加入3mM MnSO4 和0. 6mM H2O2，获得木质素降解液LacP-MnpI，可用于玉米秸杆木质纤维素中木质素降解。
[0089] 实施例11木质素降解液LacP-MnpP降解碱木素
[0090] 向碱木素中添加木质素降解液LacP-MnpP，使碱木素浓度达到5%，于25°C不通氧 反应48小时，并分别以单独漆酶LacP和单独锰过氧化物酶MnpP为对照，进行木质素的降 解反应。反应后酸洗沉淀残余碱木素，沉淀冷冻干燥后称重，计算碱木素降解率，结果如表 7所示。
[0091 ] 表7木质素降解液LacP-MnpP降解碱木素
[0092]
[0093] 实施例12木质素降解液LacG-MnpR降解酶解木质素：
[0094] 向酶解木质素中添加木质素降解液LacG-MnpR，使酶解木质素浓度达到0. 2%， 50°C通氧反应2小时，并分别以单独漆酶LacG和单独锰过氧化物酶MnpR为对照，进行木质 素的降解反应。反应后将反应物冷冻干燥，利用Klason木质素测定法测定反应物中木质素 含量，计算降解率，结果如表8所示。
[0095] 表8木质素降解液LacG-MnpR降解酶解木质素
[0096]
[0097] 实施例13木质素降解液LacT-MnpP的降解麦杆、稻杆和木肩木质纤维素中的木质 素：
[0098] 分别向麦杆、稻杆和木肩木质纤维素中添加木质素降解液LacT-MnpP，使木质纤维 素浓度达到10%，在不通氧条件下25°C反应48小时，并分别以单独漆酶LacT和单独锰过 氧化物酶MnpP为对照，降解木质纤维素中的木质素。反应后过滤沉淀，测定沉淀中残余木 质素含量，木质素含量采用Klason木质素的测定方法，结果如表9所示。
[0099] 表9木质素降解液LacT-MnpP降解麦杆、稻杆和木肩中木质素的降解率
[0100]
[0101] 实施例14木质素降解液LacP-MnpI的降解玉米秸杆木质纤维素中的木质素：
[0102] 向玉米秸杆中添加木质素降解液LacP-MnpI，使玉米秸杆木质纤维素浓度达到 1 %，在加氧条件下50°C反应12小时，并分别以单独漆酶LacP和单独锰过氧化物酶MnpI为 对照，进行木质素的降解反应。反应后过滤沉淀，测定秸杆中残余木质素含量，木质素含量 采用Klason木质素的测定方法，同时测定秸杆木质纤维素在木质素降解后的糖化率。结果 如图1所示，经过复合酶木质素降解液降解秸杆中的木质素后，木质素降解效率增强，秸杆 木质纤维素糖化率提升。
【主权项】
1. 一种木质素降解液，包括漆酶和锰过氧化物酶，其特征在于： 所述木质素降解液中，将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例，溶于PH4~6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ ml和lU/ml~50U/ml，然后加入 1~IOmMMnSO4^P0? 1 ~ImMH2O2; 所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得到。2. 权利要求1所述木质素降解液的制备方法，依次包括制备木质素酶步骤和制备降解 液步骤，其特征在于： (1) 所述制备木质素酶步骤：将白腐菌分别接种于漆酶产酶培养基和锰过氧化物酶产 酶培养基，发酵后分别获得胞外粗酶液，分别经分离纯化后得到漆酶和锰过氧化物酶； (2) 所述制备降解液步骤：将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例， 溶于pH4~6的醋酸缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ml和 lU/ml~50U/ml，再加入1~IOmMMnSOjP0. 1~ImMH2O2，得到木质素降解液。3. 如权利要求2所述的制备方法，其进一步特征在于，所述制备木质素酶步骤中： (I. 1)所述漆酶的制备包括下述子步骤： A. 从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇床以 50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种； B. 将所述液体菌种以体积比10 %~50 %的接种量接入漆酶产酶培养基，25°C~37°C 下静置培养2~6d后，加入1~IOmM藜芦醇，继续培养3d~15d后，培养物过滤获得漆酶 粗酶液； C. 漆酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩后得到电泳 纯的漆酶； (1. 2)所述锰过氧化物酶的制备包括下述子步骤： A. 从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇床以 50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种； B. 将所述液体菌种以体积比10%~50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 25°C~37°C培养IOd~60d后，按质量体积比1 : 5~1 : 50加入蒸馏水浸泡培养物Ih~ 8h，过滤获得锰过氧化物酶粗酶液； C. 锰过氧化物酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩 后得到电泳纯的锰过氧化物酶。4. 如权利要求2或3所述的制备方法，其更进一步特征在于， 所述白腐菌为灵芝、乳白耙菌、糙皮侧耳、射脉菌、多孔菌中的一种或多种； 所述漆酶产酶培养基组成为：每IOOmLKirk限氮液体培养基中加入0. 1~20g麸皮， 10CTC~125°C灭菌 10 ~40min; 所述锰过氧化物酶产酶培养基组成为：将20目~80目的木质纤维素类生物质，按质量 体积比I: 1~1 : 5加入蒸馏水，pH自然，100°C~125°C灭菌10~40min;所述木质纤 维素类生物质包括竹粉、农业秸杆粉或木肩。5. 利用权利要求1所述木质素降解液降解木质素的方法，其特征在于： 对于从生物质中分离获得的木质素高分子，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓 度达到0.2%~5%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应2h~48h; 对于含有木质素的木质纤维素生物质，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓度达 到1%~10%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应12h~48h。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于： 所述木质素包括从生物质中分离获取的木质素高分子及木质纤维素生物质中的木质 素，从生物质中分离获取的木质素高分子包括碱木素、酶解木质素、磺化木质素、磨木木质 素等；所述木质纤维素生物质包括草本类植物秸杆和木材，其中草本类植物秸杆包括荻竹、 玉米杆、麦杆、稻杆、高粱杆、棉杆、油菜杆、芒草等；木材包括各类木材加工后的木肩。
【专利摘要】木质素降解液及制备方法以及用其降解木质素的方法，属于生物化学和生物炼制方法，解决现有采用漆酶等单一木质素酶难以实现木质素高效生物降解的问题。所述木质素降解液由漆酶和锰过氧化物酶，以10∶1～1∶5的酶负荷比例，溶于pH4～6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为1U/ml～50U/ml和1U/ml～50U/ml，然后加入1～10mM MnSO4和0.1～1mM H2O2；所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得到。本发明实现结构多样性丰富的大分子木质素协同氧化降解，与单一木质素酶降解反应体系相比，木质素高分子的降解率可达到30～50％，显著提高降解转化效率，可用于木质纤维素生物炼制、生物制浆或环境处理等领域。
【IPC分类】C12P19/00, C12N9/08, C12N9/02
【公开号】CN104894079
【申请号】CN201510278306
【发明人】余洪波, 孔雯, 倪浩翔, 张晓昱
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日