专利名称：一种生产降解木质素酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白的方法。具体是应用微生物工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶。
背景技术：
木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase, LiP),猛过氧化物酶(ManganesePeroxidase, MnP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者基本成分是葡萄糖，而后者的基本成分是戊糖。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。它形成纤维支架，具有强化木质纤维的作用。纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。要利用纤维素，必须先将木质素水解。木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶具有共同水解木质素的功能。木质素降解酶不仅应用于植物原料的生产乙醇和生产沼气行业，还广泛应用于造纸行业和环境保护等行业。有些天然的微生物具有表达木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶的能力，目前工业生产上是以天然的产菌株进行发酵生产这三种酶。但是，由于天然的产酶菌株的生长缓慢或(和)营养要求高，使生产成本较高。当前有研究用工程菌分别生产这三种酶，由于是分别用一个菌株生产其中的一种酶，那么生产三种酶则需要三道工序,使其生产成本过高。毕赤酵母(Pichiapastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各 具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于在厌氧或需氧环境。
发明内容
本发明构建含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌；分别用含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶。本发明所采用的技术方案是:1.克隆基因:从天然的产木质素过氧化物酶、产猛过氧化物酶、产漆酶的天然菌株中克隆过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶基因。2.获得构建表达载体的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因序列。3.分别构建含这三种基因表达框架(基因表达框架:启动子-信号肽-基因-转录终止子)的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体。载体上的启动子是磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。载体上其它元件还有G418抗性基因和氨苄青霉素抗性基因序列；弓丨导载体重组于毕赤酵母基因组或酿酒酵母基因组的同源序列；大肠杆菌复制起点。4.通过电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，将以上构建的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母。分别筛选高表达木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶的重组子作为工程菌。5.分别发酵以上构建的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶。本发明构建含木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶木霉的基因表达框架的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶的优点体现于:(I)用工程菌取代天然菌株生产木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶木霉，通过增加基因拷贝数而提高酶的产量。(2)用含木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架的工程菌取代含单一酶基因的工程菌生产酶，用一个发酵工序同时生产木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶木霉取代了用三个工序分别生产重组木质素过氧化物酶或猛过氧化物酶或漆酶。节省了原材料、能耗和人力资源。(3)酿酒酵母和毕赤酵母在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌和毕赤酵母工程菌，为其重组酶生产提供两种菌株选择。
具体实施例方式
下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例一1.1构建克隆载体由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为PM。1.2获取目标基因和构建表达载体相关兀件的DNA序列1.2.1用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因合成如下PCR引物:引物I.5 ’ TCGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTCGGC3 ’ [说明:引物 5 ’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2.5 ’ CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG 3 ’ [说明:5 ’ 端的 10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]引物3.5 ’ TTGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCAGCC3 ’ [说明:引物 5 ’ 端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物4.5 ’ CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG 3 ’ [说明:5 ’ 端的 IO 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板，应用引物3和引物4进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列1.2.2用PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列合成如下PCR引物:引物1.5’ CGCCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGCTCTCCC 3’ [说明:5’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2.5’ CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA TCCATCGG 3’ [说明:5’ 端的 10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物I和2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列 分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌漆酶基因序列。1.2.3用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。引物1:5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGG 3’引物2:5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTC 3’[说明:引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(其中有下划线的6个碱基)]提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。[说明:毕赤酵母基因组DNA提取方法:将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]1.2.4合成a因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是a因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC1.2.5合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC1.2.6合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTG GAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG1.2.7合成如下氨苄青霉素抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因序列]5，CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCG TTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3’1.2.8从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列引物1:5， CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，引物2:5，CCTTCGMtgtctcaaagattaagccatgc 3，[说明:引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。1.3构建表达载体
1.3.1表达框架(启动子-信号肽-基因-转录终止子序列)的构建过程1.3.1.1通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、a因子信号肽DNA序列、白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于PM载体的多克隆位点。此载体称为PMl。1.3.1.2通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、a因子信号肽DNA序列、白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于PM载体的多克隆位点。此载体称为PM2。1.3.1.3通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、a因子信号肽DNA序列、枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列和转录终止子序列依次重组于PM载体的多克隆位点。此载体称为PM3。1.3.1.4通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，切取PM2和PM3载体的表达框架,并将切下的表达框架依次插入于PMl的多克隆位点。此载体称为PM123。1.3.1.5通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将氨苄青霉素抗性基因、G418基因和毕赤酵母的rDNA序列重组于PM123载体的多克隆位点，从而完成表达载体的构建。1.4构建毕赤酵母工程菌
用常规的氯化钙方法制备大肠杆菌感受态，将以上构建的载体DNA转化于大肠杆菌，提取质粒(载体)DNA。按照常规方法制备毕赤酵母感受态，用电转化方法将以上构建的质粒转化毕赤酵母，将经过转化作用的毕赤酵母细胞涂布于含G418浓度为700 u g/ml的YH)琼脂平板(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)，30°C培养3天。从G418抗性平板上挑取菌落进行增菌。将毕赤酵母转化子进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹:委托专业的多肽合成服务公司人工合成以上三种蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的3种基因在毕赤酵母中表达和分泌到胞外。从中筛选表达酶产量高的克隆作为毕赤酵母工程菌。1.5生产重组混合木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶将以上构建的毕赤酵母工程菌接种于YH)液体培养基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培养至OD6tltl = 1.5作为种子液。在容量为I吨的发酵罐中装入YPD培养基700升，按接入种子液7升，于30°C通过搅拌和加入压缩空气连续发酵32小时。离心取发酵液上清，测定发酵液上清的木质素过氧化物酶活性为> 2000单位/L，锰过氧化物酶活性为> 1300单位/L和漆酶活性为> 1400单位/L。说明:木质素过氧化物酶活性测定应用常规的天青B测定方法，锰过氧化物酶活性和漆酶活性测定均采用常规的愈创木酚测定方法。实施例二2.1构建克隆载体由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为W。
2.2犾取目标基因和构建表达载体相关兀件的DNA序列2.2.1用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因合成如下PCR引物:引物I.5 ’ TCGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTCGGC3 ’ [说明:引物 5 ’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2.5 ’ CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG 3 ’ [说明:5 ’ 端的 10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]引物3.5 ’ TTGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCAGCC3 ’ [说明:引物 5 ’ 端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物4.5 ’ CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG 3 ’ [说明:5 ’ 端的 IO 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板，应用引物3和引物4进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列2.2.2用PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列合成如下PCR引物:
引物1.5’ CGCCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGCTCTCCC 3’ [说明:5’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2.5’ CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA TCCATCGG 3’ [说明:5’ 端的 10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物I和2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌漆酶基因序列。2.2.3用PCR扩增酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。引物1:5’ CCTACGTATCGAGTTTATCATTATCAAT 3’[说明:引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2: 5’ GGGCATGCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG 3’[说明:引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。
[说明:酿酒酵母基因组DNA提取方法:将酿酒酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]2.2.4合成a因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是a因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC2.2.5合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTC ATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAG ATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC2.2.6合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACC TGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG2.2.7合成如下氨苄青霉素抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因序列]5，CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGC
CATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGT
TGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACG
TTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACT
GATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGA
ATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3>2.2.8从酿酒酵母基因组中PCR扩增rDNA序列引物1:5’ CCGGTACCTGAACTAACACCTTTTGTGG3，引物2:5’ CCTTCGAAGCTAATACATGCTTAAAATC3，[说明:引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个 碱基)]提取酿酒酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酿酒酵母基因组中的rDNA序列。2.3构建表达载体2.3.1表达框架(启动子-信号肽-基因-转录终止子序列)的构建过程2.3.1.1通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于匪载体的多克隆位点。此载体称为匪1。2.3.1.2通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列和转录终止子序列依次重组于匪载体的多克隆位点。此载体称为匪2。2.3.1.3通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列、α因子信号肽DNA序列、枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列和转录终止子序列依次重组于匪载体的多克隆位点。此载体称为匪3。2.3.1.4通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，切取匪2和匪3载体的表达框架,并将切下的表达框架依次插入于匪I的多克隆位点。此载体称为匪123。2.3.1.5通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将氨苄青霉素抗性基因、G418基因和酿酒酵母的rDNA序列重组于匪123载体的多克隆位点，从而完成表达载体的构建。2.4构建酿酒酵母工程菌用常规的氯化钙方法制备大肠杆菌感受态，将以上构建的载体DNA转化于大肠杆菌，提取质粒(载体)DNA。按照常规方法制备酿酒酵母感受态，用电转化方法将以上构建的质粒转化酿酒酵母，将经过转化作用的酿酒酵母细胞涂布于含G418浓度为700 μ g/ml的YB)琼脂平板(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)，30°C培养3天。从G418抗性平板上挑取菌落进行增菌。将酿酒酵母转化子进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹:委托专业的多肽合成服务公司人工合成以上三种蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的3种基因在酿酒酵母中表达和分泌到胞外。从中筛选表达酶产量高的克隆作为酿酒工程菌。2.5生产重组混合木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶将以上构建的酿酒酵母工程菌接种于YH)液体培养基(2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖)中培养至0D600 = 1.5作为种子液。在容量为I吨的发酵罐中装入YH)培养基700升，按接入种子液7升，于30°C通过搅拌和加入压缩空气连续发酵32小时。离心取发酵液上清，测定发酵液上清的木质素过氧化物酶活性为> 17000单位/L，锰过氧化物酶活性为> 1200单位/L和漆酶活性为> 1300单位/L。说明:木质素过氧化物酶活性测定应用常规的天青B测定方法，锰过氧化物酶活性和漆酶活性测定均采用 常规的愈创木酚测定方法。
权利要求
1.一种生产降解木质素酶的方法，其特征在于，其具体步骤如下: 1)、应用分子生物学技术从微生物中克隆木质素过氧化物酶基因、锰过氧化物酶基因和漆酶基因； 2)、分别构建含上述基因的表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体； 3)、将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母获得毕赤酵母重组子，将上述构建的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母获得酿酒酵母重组子； 4)、筛选高表达以上所述的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的毕赤酵母重组子作为毕赤酵母工程菌；筛选高表达以上所述的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的酿酒酵母重组子作为酿酒酵母工程菌； 5)、分别发酵以上所述的毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶。
2.根据权利要求1所述一种制备分解植物的木质素的菌剂的方法，其特征在于:利用权利要求1所述的生 产方法制备木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产降解木质素酶的方法。属生物技术领域。首先分别从微生物中克隆木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶基因；构建含上述三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体，并将载体转化相应的宿主菌而获得工程菌。分别发酵毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶。本发明的优点体现于用工程菌取代天然菌株生产木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶和漆酶，通过增加基因拷贝数而提高酶的产量；用含三种酶基因表达框架的工程菌取代含单一酶基因表达框架的工程菌生产其中的单一种酶，节省了原材料、能耗和人力资源。
文档编号C12R1/865GK103205403SQ20121049899
公开日2013年7月17日 申请日期2012年11月18日 优先权日2012年11月18日
发明者张爱联, 符仙, 杨穗珊, 尹慧祥, 张添元, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所