专利名称：一种用毕赤酵母工程菌联合降解植物的木质素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建和应用微生物工程菌的方法。具体是应用微生物工程菌降解植物原料的木质素的方法。
背景技术：
猛过氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)、木质素过氧化物酶(LigninPeroxidase, LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者由葡萄糖构成，而后者由戊糖构成。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，形成纤维支架，结构十分稳定。欲利用纤维素则必须先降解木质素。当前用于降解木质素的方法有物理、化学和生物的方法。物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学法主要是酸或碱处理的方法。化学处理法具有工艺简单的特点，但是处理后的纤维素和半纤维素损失大，并且产生大量的酸碱废气物污染环境。与化学法和物理法相t匕，当前应用的生物法主要是应用天然的表达分泌降解木质素的酶的白腐真菌与植物原料作用而降解植物原料中的木质素。应用白腐真菌降解植物的木质素的优势在于，白腐真菌具有完整的降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)，其不足之处是白腐真菌所含的锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因只是单拷贝，表达的酶的产量少，并且，白腐真菌生长缓慢，降解木质素的周期长。毕赤酵母(Pichia pastoris)是常用于生产重组蛋白的微生物。毕赤酵母营养要求低，能将表达的蛋白分泌到胞外，并且它具有组成型强启动子:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)。
发明内容
本发明构建含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；用含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌与植物原料作用，通过工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木质素。本发明所采用的技术方案是:1.克隆基因:用反转录PCR技术或PCR技术从含锰过氧化物酶基因的微生物、含木质素过氧化物酶的微生物和含漆酶基因的微生物中分别克隆锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶基因。2.通过PCR扩增或DNA序列合成获得构建表达载体所需的启动子、信号肽、转录终止子和抗性基因表达框架的DNA序列。3.分别构建含锰过氧化物酶基因表达框架(巨大芽孢杆菌的磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-锰过氧化物酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的毕赤酵母表达载体、含木质素过氧化物酶基因表达框架(巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-木质素过氧化物酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的毕赤酵母表达载体和含漆酶基因表达框架(巨大芽孢杆菌的磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-漆酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的毕赤酵母表达载体。以上所构建的表达载体除了含有基因表达框架之外，还有大肠杆菌复制起点、G418基因表达框架和氨苄青霉素基因表达框架。3.通过电转化方法将以上构建的3种毕赤酵母表达载体分别转化毕赤酵母。根据G418抗性，筛选高拷贝重组了锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母重组子作为含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；筛选高拷贝重组了含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母重组子作为含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；筛选高拷贝重组了漆酶基因表达框架的毕赤酵母重组子作为含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。4.将以上构建的含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌进行混合而作为降解植物的木质素的毕赤酵母工程菌的混合菌。5.将以上所述的含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的混合菌与植物原料作用，通过工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而联合降解植物的木质素。
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本发明构建含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，并将这三种毕赤酵母工程菌进行混合应用，将这种混合菌与植物原料作用，联合降解植物的木质素的优点体现于:由于工程菌的构建选择了强的启动子调控基因，生产性能好的微生物作为工程菌构建的对象，并且选择高拷贝的重组子作为工程菌，所以，本发明构建的含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的混合菌不仅具备毕赤酵母本身的营养要求低、生长繁殖迅速等特点，还具备工程菌的良好表达分泌降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)的功能，这三种工程菌的混合应用对植物的木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的天然的表达分泌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的天然的微生物。
附图1.毕赤酵母表达载体I。Pgap.毕赤酵母的三磷酸甘油醒脱氢酶启动子；S.MFa因子信号肽；genel.猛过氧化物酶基因；TT.转录终止子；G418.G418基因表达框架；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架。附图2.毕赤酵母表达载体2。Pgap.毕赤酵母的三磷酸甘油醒脱氢酶启动子；S.MF α因子信号肽；gene2.木质素过氧化物酶基因；TT.转录终止子；G418.G418基因表达框架；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架。附图3.毕赤酵母表达载体3。Pgap.毕赤酵母的三磷酸甘油醒脱氢酶启动子；S.MF α因子信号肽；gene2.漆酶基因；TT.转录终止子；G418.G418基因表达框架；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架。附图4.扫描电镜拍的毕赤酵母工程菌1、毕赤酵母工程菌2和毕赤酵母工程菌3与水稻秸杆作用4天后的照片。附图5.扫描电镜拍的含锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶的白腐真菌与水稻秸杆作用4天后的照片。附图6.扫描电镜拍的毕赤酵母与水稻秸杆作用4天后的照片。
附图7.扫描电镜拍的氨水与水稻秸杆作用4天后的照片。附图8.扫描电镜拍的天然的水稻秸杆的照片。
具体实施例方式下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例一1.1获得酶基因及构建表达载体所需的相关原件(I)PCR扩增毕赤酵母的磷酸甘油醛脱氢的启动子序列用蜗牛酶裂解毕赤酵母的细胞壁，提取毕赤酵母基因组DNA，应用上游引物(5，TTTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGT3 )和下游引物(5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTT3 )进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。(2) PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因用蜗牛酶裂解枯草芽孢杆菌的细胞壁，提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5 AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列。(3)应用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和锰过氧化物酶基因应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌(白腐真菌模式菌种-黄孢原毛平革菌)的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板,应用引物 I (5 ’ AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3 ’)和引物 2 (5 ’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板,应用引物 3 (5 ’ CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 ’)和引物 4 (5 ’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的锰过氧化物酶基因序列(4)应用PCR扩增毕赤酵母的rDNA序列提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用上游引物(5’CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，)和下游引物(5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。说明:①毕赤酵母和枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法:将菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。②引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基).
(5)合成如下氨苄青霉素抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因序列]5， AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3>(6)合成如下G418抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGG TGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATGG1.2构建毕赤酵母表达载体(I)由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体 命名为PQ。(2)构建毕赤酵母表达载体1、毕赤酵母表达载体2和毕赤酵母表达载体3。①构建毕赤酵母表达载体1:通过DNA内切酶的酶切作用和T4DNA连接酶的连接作用依次将氨苄青霉素基因表达框架、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、锰过氧化物酶基因、转录终止子和G418基因表达框架重组于PQ表达载体的多克隆位点，构建成毕赤酵母表达载体I (附图
1)。在表达载体I中，三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、锰过氧化物酶基因和转录终止子统称为含锰过氧化物酶基因的表达框架，它们的位置是:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-MF α因子信号肽-锰过氧化物酶基因-转录终止子。②构建毕赤酵母表达载体2:通过DNA内切酶的酶切作用和T4DNA连接酶的连接作用先将氨苄青霉素基因表达框架、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、木质素过氧化物酶基因、转录终止子和G418基因表达框架重组于PQ表达载体的多克隆位点，构建成毕赤酵母表达载体2 (附图
2)。在表达载体2中，三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、木质素过氧化物酶基因和转录终止子统称为含木质素过氧化物酶基因的表达框架，它们的位置是:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-MF α因子信号肽-木质素过氧化物酶基因-转录终止子。⑧构建毕赤酵母表达载体3:通过DNA内切酶的酶切作用和T4DNA连接酶的连接作用先将氨苄青霉素基因表达框架连接于PQ载体的多克隆位点、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MF α因子信号肽、漆酶基因、转录终止子、G418基因表达框架和rDNA重组于PQ表达载体的多克隆位点，构建成毕赤酵母表达载体3(附图3)。在表达载体3中，三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、漆酶基因和转录终止子统称为含漆酶基因的表达框架，它们的位置是:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-MFa因子信号肽-漆酶基因-转录终止子。1.3构建毕赤酵母工程菌用常规的氯化钙方法制备大肠杆菌感受态，将以上构建的载体DNA转化于大肠杆菌，提取质粒(载体)DNA。按照常规方法制备毕赤酵母感受态，用常规的电转化方法分别将以上构建的毕赤酵母表达载体1、毕赤酵母表达载体2和毕赤酵母表达载体3分别转化毕赤酵母，将经过转化作用的毕赤酵母细胞涂布于含G418浓度为5000 μ g/ml的YPD琼脂(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖，1.5%琼脂粉)平板，30°C培养3天。将在含G418浓度为700 μ g/ml的YPD琼脂平板上生长的克隆转种于G418浓度为20000 μ g/ml的YPD琼脂平板上，30°C培养3天。挑选能在G418浓度为20000 μ g/ml的YPD琼脂平板上生长的克隆进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹:委托专业的多肽合成服务公司分别合成以上所述的锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的3种基因分别在3种毕赤酵母工程菌中表达和分泌到胞外。用常规方法进行酶活性测定，结果证明在毕赤酵母工程菌中表达分泌的重组漆酶具有漆酶活性、在毕赤酵母工程菌中表达分泌的重组木质素过氧化物酶具有木质素过氧化物酶活性和在毕赤酵母工程菌中表达分泌的重组锰过氧化物酶具有锰过氧化物酶活性。将重组了毕赤酵母表达载体I的重组子命名为毕赤酵母工程菌1，将重组了毕赤酵母表达载体2的重组子命名为毕赤酵母工程菌2，将重组了毕赤酵母表达载体3的重组子命名为毕赤酵母工程 菌3。1.4应用混合的将毕赤酵母工程菌1、毕赤酵母工程菌2和毕赤酵母工程菌3与植物作用，降解植物的木质素(I)将毕赤酵母工程菌1、毕赤酵母工程菌2和毕赤酵母工程菌3接种于YPD液体培养基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培养至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆中，混匀，于30°C放置4天。用常规的硫酸法测定其经过三种毕赤酵母工程菌作用的水稻秸杆残留木质素的含量为4.2%。(2)将具有分泌表达漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的、通常应用于植物原料发酵沼气和乙醇的预处理(降解木质素)的白腐真菌模式菌种-黄孢原毛平革菌接种于马铃薯培养基(20%马铃薯，2%葡萄糖)中培养至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆中，混匀，于30°C放置4天，用常规的硫酸法测定其经过白腐真菌作用的水稻秸杆残留木质素的含量为9.5%。(3)将毕赤酵母接种于YPD液体培养基中培养至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆中，混匀，于30°C放置4天。用常规的硫酸法测定经过毕赤酵母作用的水稻秸杆残留的木质素的含量为14.7%。(4)将2600g经过粉碎的水稻秸杆与3400mL5%氨水混匀，于30°C放置4天，用常规的硫酸法测定其经过氨水作用的水稻秸杆残留木质素的含量为10.2%。(5)用常规的硫酸法测定没有经过处理的秸杆的木质素的含量为15.0%。统计学分析结果表明，将毕赤酵母工程菌1、毕赤酵母工程菌2和毕赤酵母工程菌3混合应用降解的木质素的效果极显著强于用毕赤酵母(P < 0.001)、极显著强于白腐真菌(P < 0.001)和极显著强于氨水(P < 0.001)的降解木质素的效果。实施例二2.1获得酶基因及构建表达载体所需的相关原件(I)PCR扩增毕赤酵母的磷酸甘油醛脱氢的启动子序列用蜗牛酶裂解毕赤酵母的细胞壁，提取毕赤酵母基因组DNA，应用上游引物(5，TTTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGT3 )和下游引物(5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTT3 )进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。(2) PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因
用蜗牛酶裂解枯草芽孢杆菌的细胞壁，提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5 AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列。(3)应用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和锰过氧化物酶基因应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物I (5 AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3’ )和引物 2(5’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3，)进行 PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌(白腐真菌模式菌种-黄孢原毛平革菌)的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板,应用引物 3 (5 ’ CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 ’)和引物 4 (5 ’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的锰过氧化物酶基因序列(4)应用PCR扩增毕赤酵母的rDNA序列提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用上游引物(5’ CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，)和下游引物(5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3’ )进行 PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。说明:①毕赤酵母和枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法:将菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。②引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和HDNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基).
(5)合成如下氨苄青霉素抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因序列] 5，AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3>(6)合成如下G418抗性基因表达框架序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTT·AGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG2.2构建毕赤酵母表达载体
(I)由专业的DNA序列合成公式合成大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为PQ。(2)构建毕赤酵母表达载体1、毕赤酵母表达载体2和毕赤酵母表达载体3。①构建毕赤酵母表达载体1:通过DNA内切酶的酶切作用和T4DNA连接酶的连接作用依次将氨苄青霉素基因表达框架、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、锰过氧化物酶基因、转录终止子和G418基因表达框架重组于PQ表达载体的多克隆位点，构建成毕赤酵母表达载体I (附图
1)。在表达载体I中，三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、锰过氧化物酶基因和转录终止子统称为含锰过氧化物酶基因的表达框架，它们的位置是:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-MF a因子信号肽-锰过氧化物酶基因-转录终止子。②构建毕赤酵母表达载体2:通过DNA内切酶的酶切作用和T4DNA连接酶的连接作用先将氨苄青霉素基因表达框架、三磷酸甘油醛脱氢 酶启动子、MFa因子信号肽、木质素过氧化物酶基因、转录终止子和G418基因表达框架重组于PQ表达载体的多克隆位点，构建成毕赤酵母表达载体2 (附图
2)。在表达载体2中，三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、木质素过氧化物酶基因和转录终止子统称为含木质素过氧化物酶基因的表达框架，它们的位置是:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-MF a因子信号肽-木质素过氧化物酶基因-转录终止子。③构建毕赤酵母表达载体3:通过DNA内切酶的酶切作用和T4DNA连接酶的连接作用先将氨苄青霉素基因表达框架连接于PQ载体的多克隆位点、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MF a因子信号肽、漆酶基因、转录终止子、G418基因表达框架和rDNA重组于PQ表达载体的多克隆位点，构建成毕赤酵母表达载体3(附图3)。在表达载体3中，三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、MFa因子信号肽、漆酶基因和转录终止子统称为含漆酶基因的表达框架，它们的位置是:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-MF a因子信号肽-漆酶基因-转录终止子。2.3构建毕赤酵母工程菌用常规的氯化钙方法制备大肠杆菌感受态，将以上构建的载体DNA转化于大肠杆菌，提取质粒(载体)DNA。按照常规方法制备毕赤酵母感受态，用常规的电转化方法分别将以上构建的毕赤酵母表达载体1、毕赤酵母表达载体2和毕赤酵母表达载体3分别转化毕赤酵母，将经过转化作用的毕赤酵母细胞涂布于含G418浓度为5000 μ g/ml的YPD琼脂(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖，1.5%琼脂粉)平板，30°C培养3天。将在含G418浓度为700 μ g/ml的YPD琼脂平板上生长的克隆转种于G418浓度为20000 μ g/ml的YPD琼脂平板上，30°C培养3天。挑选能在G418浓度为20000 μ g/ml的YPD琼脂平板上生长的克隆进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹:委托专业的多肽合成服务公司分别合成以上所述的锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的3种基因分别在3种毕赤酵母工程菌中表达和分泌到胞外。用常规方法进行酶活性测定，结果证明在毕赤酵母工程菌中表达分泌的重组漆酶具有漆酶活性、在毕赤酵母工程菌中表达分泌的重组木质素过氧化物酶具有木质素过氧化物酶活性和在毕赤酵母工程菌中表达分泌的重组锰过氧化物酶具有锰过氧化物酶活性。将重组了毕赤酵母表达载体I的重组子命名为毕赤酵母工程菌1，将重组了毕赤酵母表达载体2的重组子命名为毕赤酵母工程菌2，将重组了毕赤酵母表达载体3的重组子命名为毕赤酵母工程菌3。2.4应用混合的将毕赤酵母工程菌1、毕赤酵母工程菌2和毕赤酵母工程菌3与植物作用，降解植物的木质素(I)将毕赤酵母工程菌1、毕赤酵母工程菌2和毕赤酵母工程菌3接种于YPD液体培养基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培养至OD6tltl = 6，取IOOOmL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆中，混匀，于30°C放置4天。扫描电镜观察展示，水稻秸杆的细胞壁结构已经发生明显的改变，大部分木质素已经被降解，纤维素裸露(附图4)。(2)将具有分泌表达漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的、通常应用于植物原料发酵沼气和乙醇的预处理(降解木质素)的白腐真菌模式菌种-黄孢原毛平革菌接种于马铃薯培养基(20%马铃薯，2%葡萄糖)中培养至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆中，混匀，于30°C放置4天。扫描电镜观察展示，水稻秸杆的细胞壁的结构仅部分发生改变，没有明显的纤维素裸露的现象(附图5)。(3)将毕赤酵 母接种于YPD液体培养基中培养至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接种于5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆中，混匀，于30°C放置4天。扫描电镜观察展示，水稻秸杆的细胞壁结构完整(附图6)。(4)将5000克(湿重)经过粉碎的水稻秸杆与1000mL5%氨水混匀，于30°C放置4天，扫描电镜观察展示，水稻秸杆的细胞壁结构比较完整(附图7)。(5)扫描电镜观察展示，没有经过处理的秸杆结构完整(附图8)。
权利要求
1.一种用毕赤酵母工程菌联合降解植物的木质素的方法，其特征在于:通过分子生物学技术从微生物中克隆锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因；构建含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、含木质素过氧化酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体；分别将上述构建的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母，并通过G418抗性筛选获得表达载体高拷贝重组的含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；将以上所述的三种毕赤酵母工程菌混合应用，通过表达和分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而联合降解植物的木质素。
2.根据权利要求1所述一种用毕赤酵母工程菌联合降解植物的木质素的方法，其特征在于:利用权利要求1所述的方法制备降解植物的木质素的含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的 混合菌的产品。
全文摘要
本发明公开了一种用毕赤酵母工程菌联合降解植物的木质素的方法。属生物技术领域。从微生物中克隆锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因；构建含锰过氧化物酶基因的毕赤酵母表达载体、含木质素过氧化物酶基因的毕赤酵母表达载体和含漆酶基因的毕赤酵母表达载体。分别将以上所述的三种表达载体转化毕赤酵母，用G418抗性筛选而获得含锰过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。将这三种工程菌与植物原料作用而联合降解植物的木质素。本发明的优点体现于这三种毕赤酵母工程菌对木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的天然的微生物。
文档编号C12N15/53GK103233025SQ20131013463
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者张爱联, 符仙, 杨穗珊, 尹慧祥 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所