专利名称：单抗l-ngfr免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及干细胞的分选方法，尤其涉及一种单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。脂肪间充质干细胞，是脂肪组织中一类多能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视。传统脂肪间充质干细胞的分离方法仍然采用贴壁培养法来进行，该类方法费时费力，而且分离所得的间充质干细胞纯度不高，活性差，或者只能称为基质血管部分细胞。所以，仍然需要开发更加高效的脂肪间充质干细胞分离方法。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下方案:一种单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，通过以下步骤完成: (1)免疫磁珠的制备；(2)免疫磁珠与生物素类似物偶联；(3)生物素类似物与链酶亲和素结合；(4)链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联；(5)从经胶原酶I消化后的脂肪悬液中分离脂肪间充质干细胞；(6)分离所得脂肪间充质干细胞的洗脱。作为本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法的一种优选实施方式，步骤(I)所述的免疫磁珠为超顺磁性Fe3O4磁性颗粒，直径20±5nm。作为本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法的一种优选实施方式，所述 超顺磁性Fe3O4磁性颗粒通过以下方法制备:量取等体积的IM的FeSO4.7H20溶液和1.75M的FeCl3溶液，快速混合，滴加5M NaOH溶液至pH=7，有棕色颗粒生成；再滴加0.5M NaOH溶液至pH=ll，继续搅拌，加入无水乙醇，静置IOmin后，将温度升高到80°C进行熟化；搅拌，同时加入表面活性剂十二烷基苯磺酸钠；30min后，用强磁铁来沉降，分离上层清液，用蒸馏水和无水乙醇反复洗涤沉淀物后，将沉淀物置于真空干燥箱中，就得超顺Fe3O4纳米磁粒。作为本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法的一种优选实施方式，所述步骤(2)免疫磁珠与生物素类似物偶联通过EDC方法完成。作为本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法的一种优选实施方式，所述步骤(4)中链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联通过EDC方法完成。作为本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法的一种优选实施方式，所述生物素类似物为Iminobiotin, Iminobiotin与链霉亲和素可逆结合。作为本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法的一种优选实施方式，所述步骤(6)中通过调节pH完成干细胞的可逆分选；在pH9.5-11时，Iminobiotin与链霉亲和素严密结合,在pH4时，Iminobiotin与链霉亲和素解离。本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，利用脂肪间充质干细胞特异性单抗L-NGFR，采用pH可控的蛋白可逆结合方法和免疫磁珠富集方法，有效地从人脂肪组织中分离得到间充质干细胞，该脂肪间充质干细胞分离方法简单，环境友好，成本较低；脂肪间充质干细胞的洗脱为无损洗脱，洗脱过程无需加过高浓度(8M)的盐酸胍或(4 M )的尿素，通过调节pH完成干细胞的可逆分选，大大保留细胞的活性；脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小。因此本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法具有良好的应用前景。
图1本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法示意图。
具体实施例方式为了更好的了解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。免疫磁珠(ImpetiCbead，MB简称磁珠)，是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。免疫磁珠的原理为运用核-壳的合成方法合成含有四氧化三铁超顺磁性的高分子覆盖物质，利用表面的功能集团进行抗体的偶联，可结合相应的抗原，并且在外界磁场的吸引下可做定向移动，从而达到分离，检测，纯化的目的。实施例1(I)免疫磁珠的制备:采用共沉淀法制备20±5nm粒径的超顺Fe3O4纳米磁粒。量取等体积的IM的FeSO4.7H20溶液和1.75M的FeCl3溶液，快速混合，其中，[Fe3+]: [Fe2+] =1.75:1 ;滴加5M NaOH溶液至pH=7，此时有棕色颗粒生成；再滴加0.5M NaOH溶液至PH=I I，继续搅拌，加入无水乙醇，静置IOmin后，将温度升高到80 V进行熟化；搅拌，同时加入IOOyU0.001mol/L的表面活性剂十二烷基苯磺酸钠；30min后，用强磁铁来沉降，分离上层清液，用蒸馏水和无水乙醇反复洗涤沉淀物，直至洗水的PH为7左右；将沉淀物置于真空干燥箱中，在75°C下干燥5h，就得超顺Fe304纳米磁粒。
(2)免疫磁珠与生物素类似物偶联:超顺Fe3O4纳米磁粒在适当的活化剂EDC (10 μ L)，MES (15 μ L)等催化下，偶联上生物素类似物Iminibiotin (亚氨基生物素)。其中EDC、MES试剂的配置如下:EDC:称取0.785g EDC溶于ImM的MnCl2溶液中，用1%的HCL调节ρΗ5.0，最后定容至12mL，0.22μπι过滤除菌，4°C保存。EDC需要现配现用。MES:称取4.88g MES溶于250mL水中，调pH至4.5，0.22 μ m过滤除菌，4°C保存。(3)生物素类似物与链酶亲和素结合。(4)链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联:链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联通过EDC方法完成。其中，单抗L-NGFR是最新发现的脂肪来源间充质干细胞特异性marker,并且还未应用于富集脂肪间充质干细胞。(5)从经胶原酶I消化后的脂肪悬液中分离间充质干细胞:通过调节pH完成干细胞的可逆分选；在卩!19.5-11时，Iminobiotin与链霉亲和素严密结合,而与链霉亲和素偶联的单抗L-NGFR与脂肪悬液中的脂肪间充质干细胞特异性结合，被吸附在超顺Fe3O4纳米磁粒上；脂肪悬液中不能与单抗L-NGFR结合的非干细胞成分，不会被吸附在超顺Fe3O4纳米磁粒上。所述脂肪悬液通过下述方法制备:无菌吸取脂肪抽提液，用PBS冲洗数次，去除吸脂手术中所用药物及血细胞；用0.1%1型胶原酶37°C消化I小时；400g离心5min，吸弃上层脂肪后，混匀，用200目筛网过滤获得细胞悬液。(6)脂肪间充质干细胞的洗脱:通过调节pH完成干细胞的可逆分选，在pH4时，Iminobiotin与链霉亲和素解离，洗脱可获得分离的脂肪间充质干细胞。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明·专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，通过以下步骤完成 (1)免疫磁珠的制备； (2)免疫磁珠与生物素类似物偶联； (3)生物素类似物与链酶亲和素结合； (4)链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联； (5)从经胶原酶I消化后的脂肪悬液中分离脂肪间充质干细胞； (6)分离所得脂肪间充质干细胞的洗脱。
2.根据权利要求I所述的单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(I)所述的免疫磁珠为超顺磁性Fe3O4磁性颗粒，直径20±5nm。
3.根据权利要求2所述的单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，超顺磁性Fe3O4磁性颗粒通过以下方法制备量取等体积的IM的FeSO4 · 7H20溶液和I. 75M的FeCl3溶液，快速混合，滴加5M NaOH溶液至pH=7，有棕色颗粒生成；再滴加O.5M NaOH溶液至pH=ll，继续搅拌，加入无水乙醇，静置IOmin后，将温度升高到80°C进行熟化；搅拌，同时加入100 μ L, O. 001mol/L的表面活性剂十二烷基苯磺酸钠；30min后，用强磁铁来沉降，分离上层清液，用蒸馏水和无水乙醇反复洗涤沉淀物后，将沉淀物置于真空干燥箱中，就得超顺Fe3O4纳米磁粒。
4.根据权利要求I所述的单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)免疫磁珠与生物素类似物偶联通过EDC方法完成。
5.根据权利要求I所述的单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)中链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联通过EDC方法完成。
6.根据权利要求I所述的单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述生物素类似物为Iminobiotin, Iminobiotin与链霉亲和素可逆结合。
7.根据权利要求3所述的单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(6)中通过调节pH成干细胞的可逆分选；在？!19. 5-11时，Iminobiotin与链霉亲和素严密结合,在pH4时，Iminobiotin与链霉亲和素解离。
全文摘要
本发明涉及一种单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，通过以下步骤完成(1)免疫磁珠的制备；(2)免疫磁珠与生物素类似物偶联；(3)生物素类似物与链酶亲和素结合；(4)链霉亲和素与单抗L-NGFR的偶联；(5)从经胶原酶I消化后的脂肪悬液中分离间充质干细胞；(6)脂肪间充质干细胞的洗脱。本发明单抗L-NGFR免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法，利用脂肪间充质干细胞特异性单抗L-NGFR，采用pH可控的蛋白可逆结合方法和免疫磁珠富集方法，有效地从人脂肪组织中分离得到间充质干细胞，该脂肪间充质干细胞分离方法简单，环境友好，成本较低，而且干细胞的活性高，具有较好的应用前景。
文档编号C12N5/0775GK103255104SQ20131013450
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者冯文峰, 佘志勇, 方海庆, 陈建兴 申请人:广州爱菲科生物科技有限公司