专利名称：获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录弓I物。
背景技术：
微小RNA (microRNA, miRNA)是一类小分子非编码RNA，约为22碱基大小。其通过结合靶基因的3’非翻译区(3’ UTR)造成靶基因mRNA的降解或靶蛋白翻译的抑制。研究表明miRNA的生物功能是通过调控靶基因而实现的，miRNA通过作用于相应靶mRNA，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。控制着包括动、植物器官形成、发育、代谢以及某些疾病的发生。miRNA以不完全配对方式与靶基因相结合，这种不完全配对模式使得miRNA及其靶基因的调控网络非常复杂，即一条miRNA可以同时作用若干甚至上百个功能基因，一个功能基因也可能受高达数十条miRNA所调控。很难通过分子生物学实验加以一一验证。Bartel 等(Friedman, R.C., K.K.Farh, C.B.Burge, and D.P.Bartel.2009.Most mammalianmRNAs are conserved targets of microRNAs.Genome Resl9:92-105)研究发现 miRNA 的5’端第2-8个碱基的种子序列与靶基因序列精确配对，基于这一结合特性相续开发出了一系列miRNA靶基因生物信息学预测软件。寻找miRNA 的靶基因的方法主要分为生物信息学方法和生物学实验方法。生物学实验方法获得数据较为准确，其缺点是一次只能证明一条靶基因，通量不够。生物信息方法获得数据通量较大，但准确率较低。两种方法各有特点但都必须有一个硬性前提，即所分析物种的基因组信息需较为完整。绵羊基因组虽已发布第二版(V2.0)，第四版至今没有公布，参见官方测序网站(http://www.animalgenome.0rg/sheep/),由于版本较低,测序质量不高，存在很多没有测通的片段(gap)，基因组数据不够完整，大量基因的3’UTR序列未知。因此利用以上两种方法很难批量获得绵羊骨骼肌miRNA及其靶基因调控网络的完整信息。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种获取miRNA候选靶基因的方法、获取miRNA与mRNA的候选结合位点的方法及其专用反转录引物。本发明所提供的获取miRNA候选靶基因的方法，包括:I)以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链,得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件:所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57-62%，环部不配对碱基数< 6个，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是Y至Y方向单链DNA序列的反向序列:所述:V至Y方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；2)以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链,得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14_2(l,所述特异接头满足如下条件:所述特异接头的CG含量为50% 60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数< 5个，最大串联配对碱基数目小于< 4个；3)合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为Ai库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B'库；将所述A'库和所述B'库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物Al和引物BI扩增所述杂交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物Al是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物Al的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物BI的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。本发明所提供的获取miRNA与mRNA的候选结合位点(候选结合区)的方法，包括:I)以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链,得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件:所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57-62%，环部不配对碱基数< 6个，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是Y至Y方向单链DNA序列的反向序列:所述:V至Y方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方 向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；2)以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链,得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14_2(l,所述特异接头满足如下条件:所述特异接头的CG含量为50% 60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数< 5个，最大串联配对碱基数目小于< 4个；3)合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A'库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B'库；将所述A'库和所述B'库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物Al和引物BI扩增所述杂交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA与mRNA的候选结合位点；所述引物Al是选自所述反转录引物A的单链DNA,所述引物Al的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物BI的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。上述方法中，所述mRNA对应的cDNA第一条链是指由所述mRNA反转录得到的cDNA第一条链。所述引物Al和所述所述引物BI均为单链DNA。上述方法中，所述真核生物目的组织具体可为羊、猪或牛骨骼肌，所述目的miRNA可为在骨骼肌中表达的miRNA。在本发明的一个实施例中，所述真核生物目的组织为羊骨骼肌，所述反转录引物A的核苷酸序列是 CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X,其中 miR-X 是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向单链DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述引物Al的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG ;和/或，所述反转录引物B 的核苷酸序列是 AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT，其中AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTA为特异接头的核苷酸序列，所述引物BI的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT (其与特异接头序列中的黑体部序列同向互补)。生物信息学比对结果表明所述反转录引物A、所述引物Al、所述反转录引物B、所述引物BI也可用于构建牛和猪骨骼肌中的miRNA的候选靶基因文库。在本发明的一个实施例中，所述目的miRNA是mir-133，其:V至Y方向的核苷酸序列为⑶CGACCAACUUCCCCUGGUUU,所沭反转录弓I物A的5'至3'方向的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGCCCCTGGTTT。上述方法中，当所述反转录引物A的茎环结构的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAG,所述反转录A可在37-42 °C (如42 °C )进行，此温度下，茎环处序列呈二级结构状态，只有种子序列成单链状态，可以特异性进行反转录，最大程度保证了目的基因反转录的保真性；所述合成所述A库的cDNA第二条链在15°C 25°C (如16°C )进行。上述方法中，当所述引物Al的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG,所沭引物BI的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT,所沭步骤3中，所沭扩增为PCR扩增，所沭PCR扩增采用的引物退火条件为65°C退火30s。进一步，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可为:94°C预变性Imin ;94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸2_3min,30个循环；72°C延伸IOmin0上述获取miRNA的候选靶基因的方法可用于构建获取miRNA候选靶基因的文库。上述方法中所述的反转录引物A也属于本发明的保护范围。本发明还要求保护用于获取miRNA候选靶基因的成套反转录引物。该用于构建miRNA的候选靶基因文库的成套反转录引物，由独立包装的上述方法中所述的反转录引物A和上述方法中所述的反转录引物 B组成。本发明还要求保护如下用于获取miRNA候选靶基因的成套引物:由独立包装的上述方法中所述的反转录引物A、上述方法中所述的引物A1、上述方法中所述的反转录引物B和上述方法中所述的引物BI组成。
本发明可用于大批量获取真核生物目的组织中所表达的miRNA的候选靶基因，采用核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X的反转录引物A、核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT的反转录引物B可以获得绵羊、猪、牛所表达的miRNA的候选靶基因，为家畜骨骼肌功能基因相关研究提供基因信息，所获得的关键靶标基因将可直接运用于肉羊、肉猪和肉牛分子育种。本发明的方法特别适合于构建哺乳动物各组织miRNA候选靶基因文库。
图1为反转录引物A的结构。图2为本发明的原理图。图3为阳性PCR产物的电泳结果。图4为mir-133的候选靶基因序列。图5为Myogl的序列。图6为Myog2的序列。图7为双荧光检测mir-133的候选靶基因结果。图8为Myog基因全靶标序列。图9 为 Big-pr1-miR-133b 的 DNA 序列。图10 为 pr1-miR_133b 的 DNA 序列。
图11 为 pr1-miR-133a_l 的 DNA 序列。图12 为 pr1-miR-122 的 DNA 序列。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。可采用图1所示的反转录引物A、核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT的反转录引物B (带下划线的序列为特异接头)、核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG 的引物 Al、核苷酸序列是 AGCGCAGCTCATCATCTGCAT 的引物 BI 构建于羊、牛、和猪的骨骼肌miRNA的候选靶基因文库。反转录引物A的茎环结构的茎颈部完全配对，结构稳定，能够保证在反转录时茎颈部呈双链状态，只允许10碱基的种子序列区可以特异性地捕获靶标基因序列。反转录引物A的茎环结构(核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAG)是发明人经历数次实验验证证明效果最佳，优于同类茎环结构，其序列不同于任何报道文献，能值较低，结构非常稳定。其效果见表I。表1.茎环结构
权利要求
1.获取miRNA候选靶基因的方法，包括: 1)以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件:所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57%-62%，环部不配对碱基数彡6个，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向单链DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸； 2)以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14_2(l，所述特异接头满足如下条件:所述特异接头的CG含量为50% 60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数< 5个，最大串联配对碱基数目小于< 4个； 3)合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A,库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B'库；将所述A'库和所述B'库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物Al和引物BI扩增所述杂交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物Al是选自所 述反转录引物A的单链DNA，所述引物Al的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物BI的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。
2.获取miRNA与mRNA的候选结合位点的方法，包括: 1)以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件:所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57%-62%，环部不配对碱基数彡6个，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向单链DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸； 2)以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20，所述特异接头满足如下条件:所述特异接头的CG含量为50% 60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数< 5个，最大串联配对碱基数目小于< 4个； 3)合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A,库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B'库；将所述A'库和所述B'库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物Al和引物BI扩增所述杂交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA与mRNA的候选结合位点；所述引物Al是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物Al的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物BI的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述真核生物目的组织为羊、猪或牛骨骼肌，所述目的miRNA为在骨骼肌中表达的miRNA。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述反转录引物A的核苷酸序列是 CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X,所述 miR-X 是所述目的 miRNA 种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向单链DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞 嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述引物Al的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG ;和 / 或， 所述反转录引物 B 的核苷酸序列是 AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT,其中AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTA为特异接头的核苷酸序列，所述引物BI的核苷酸序列是 AGCGCAGCTCATCATCTGCAT。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述反转录A在42°C或37-42°C进行；所述合成所述A库的cDNA第二条链在16°C或15 25°C进行。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述步骤3)中，所述扩增为PCR扩增，所述PCR扩增采用的引物退火条件为65°C退火30s。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序:94°C预变性Imin ;94°C变性30s，65。。退火30s，72。。延伸2_3min,30个循环；72°C延伸IOmin0
8.权利要求1-3中任一所述的反转录引物A。
9.用于获取miRNA的候选靶基因的成套反转录引物，由独立包装的权利要求1-4中任一所述的反转录引物A和权利要求1-4中任一所述的反转录引物B组成。
10.用于获取miRNA的候选靶基因的成套引物，由独立包装的权利要求1-4中任一所述的反转录引物A、权利要求1-4中任一所述的引物Al、权利要求1-4中任一所述的反转录引物B和权利要求1-4中任一所述的引物BI组成。
全文摘要
本发明公开了获取miRNA的候选靶基因的方法及其专用反转录引物。该方法包括1)以带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，获取与目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；2)以带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，获取真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20；3)将所述A库和所述B库合成双链cDNA后进行杂交得到杂交DNA分子，扩增所述杂交DNA分子上所述目的miRNA种子序列和所述特异接头之间的DNA片段，根据所述扩增产物得到目的miRNA的候选靶基因。
文档编号C12N15/10GK103194441SQ20131013458
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者甘尚权, 高蕊, 王立民, 沈敏, 王新华, 刘守仁 申请人:新疆农垦科学院