专利名称：表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒及应用，属于基因工程领域。
背景技术：
小菜蛾属于鱗翅目菜蛾科，英文名:Diamondback moth ；学名-,Plutellaxy1ste I la (L.)，是世界性迁飞害虫，主要为害甘蓝、青花菜、白菜、油菜等十字花科植物。自1953年首次报道小菜蛾对DTT产生抗性以来，到目前为止，小菜蛾已对50多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性，几乎涉及到所有的防治用药。精氨酸激酶(ArginineKinase, AK) (ATP: Argine N-phosphotransferase EC
2.7.3.3)属于磷酸原激酶家族，广泛存在于无脊椎动物及软体动物中，类似于脊椎动物中的肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶(张元 臣等.烟夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析[J]，昆虫学报，54 ( 7):754-761.)。苏云金芽孢杆菌(ifeci77i/5.thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛地革兰氏阳性芽孢杆菌，在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体，且伴胞晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有杀毒活性(Wight A P, Davis M E.Design and preparationof organic-1norganic hybrid catalysts[J].Chem Rev, 2002, 102(10): 3589-3614.)，是目前应用最广泛，研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。虽然Bt杀虫剂具有对人畜安全无害、不污染环境，有一定的特异性和选择性的杀虫作用等优点，但也存在稳定性差、残效期短、杀虫谱窄等问题，严重影响了 Bt的实际应用。这使得改造Bt成为一种必然。现阶段由于穿梭质粒载体、整合载体、Bt转座一解离载体等的成功构建，已经成功的将一些外源基因转入到苏云金芽孢杆菌中。但这些改造都集中在苏云金芽孢杆菌本身改造，特别是对其毒蛋白的改造。RNA 干扰(即 RNAi)就是利用双链 RNA (double strain RNA, dsRNA)介导相对应的基因的沉默(Geley, S.，Muller C.RNA1: ancient mechanism with a promisingfuture.Exp Gerontol, 2004, 39 (7): 985-998)。它的干扰机制是 RNaseIII 核酶家族的成员Dicer酶特异性地与双链RNA结合并将其剪切成23 nt大小的小分子RNA片段。双链的小分子RNA片段随后与RNA引起的沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex,RISC)结合，解旋成单链，并在RISC的介导下与具有互补序列的mRNA结合，从而引起mRNA的降解。通过注射和喂食dsRNA试验研究昆虫的功能基因，发现一些基因的沉默对昆虫的生长发育有显著的影响。因此，利用RNAi效应来抑制昆虫中必需基因的功能进而导致其死亡，以保护植物免受害虫的危害，这在理论上是可行的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可在苏云金芽孢杆菌中表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒，为小菜蛾的控制提供新途径。本发明的质粒，是在质粒pHT305a的及丽Y I和I酶切位点之间插入SEQ IDN0.1所示的DNA得到的重组质粒，命名为质粒pHT305AKR。本发明还保护了所述的质粒pHT305AKR构建的工程菌。本发明还保护了所述的质粒pHT305AKR构建的苏云金芽孢杆菌工程菌。本发明还保护了所述的苏云金芽孢杆菌工程菌在制备Bt生物杀虫剂中的应用。
详述如下:
所述的质粒PHT305AKR中，外源基因为小菜蛾精氨酸激酶部分基因，核苷酸序列具体如 SEQ ID N0.4 所示。所述的质粒PHT305AKR可在大肠杆菌中大量拷贝，可在苏云金芽孢杆菌菌株中表达。用质粒pHT305AKR作为质粒构建的工程菌也属于本发明的保护范围。用质粒PHT305AKR作为出发质粒构建得到的表达基因dsRNA的质粒也属于本发明的保护范围；所述质粒PHT305AKR中含有正向启动子pro3a (+)和反向启动子pro3a (-)；所述正向启动子pro3 a (+)和反向启动子pro3a (-)是苏云金芽孢杆菌cry基因的启动子，二者是反向互补序列；所述的正向启动子pro3 a (+)序列如SEQ ID N0.2所示,所述的反向启动子pro3a (-)序列如SEQ ID N0.3所示。用质粒pHT305AKR作为出发质粒获得的新的质粒并利用该新质粒获得的工程菌也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种利用所述的质粒进行RNA干扰的方法，是将干扰的靶标基因作为外源基因插入穿梭质粒PHT305AKR的Sal I和Sph I酶切位点间，得到表达靶标基因的dsRNA,使得相应的靶标基因沉默。本发明还保护一种利用所述穿梭质粒pHT305AKR改造苏云金芽孢杆菌而获得的Bt生物杀虫剂的方法。本发明具有如下优点:
1、本发明利用平滑末端随机连接和限制性内切酶酶切得到了可表达精氨酸激酶基因的dsRNA的质粒。2、本发明提供的质粒不仅实现了在苏云金芽孢杆菌表达dsRNA的研究，为把RNAi技术应用于苏云金芽孢杆菌基因的功能鉴定和苏云金芽孢杆菌功能基因组的研究提供强有力的手段，也可以利用宿主细菌合成dsRNA，降低了获得dsRNA的成本。3、本发明为苏云金芽孢杆菌的改造提供了新的思路，为提高苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂的杀虫效果，研制苏云金芽孢杆菌生物农药开拓了一个新的方向。4、本发明通过研究小菜蛾精氨酸激酶基因的RNAi方法和效果，为小菜蛾的控制提供新途径，也为RNAi理论和技术在害虫控制提供借鉴，开创害虫控制的新领域。
图1为pHT305a的结构示意图。图2为pHT305AKR的结构示意图。图3为正向启动子、反向启动子和目的基因片段的电泳示意图；泳道1: pro3a( + )，泳道 2:AK 片段,泳道 3 -.pro3a (_)。图4为RNA电泳图；其中泳道1:工程菌，泳道2:原始菌。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述具体实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述具体实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。酶切所用的限制性内切酶、酶连接所用的T4连接酶、PCR所用的Taq酶均购自TAKARA公司，胶回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒和PUM-T载体试剂盒均购自Bio Teke公司，动物组织总RNA提取试剂盒和培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司，反转录用的M-MLV反转录酶购自invitrogen公司，出发载体pHT305a(结构示意图见图1)由福建农林大学重点实验室关雄老师所赠，氨苄青霉素(以下简写为Amp)购自生工生物工程有限公司，红霉素(以下简写为Erm)购自Solarbio公司。实施例1、质粒pHT305AKR构建
一、苏云金芽孢杆菌基因的启动子片段的制备
1.1提取质粒pHT305a
取含有质粒pHT305a菌株的单菌落于LB液体培养基(含有50ng/ml Amp和50ng/mlErm)中过夜培养，用高纯质粒小量制备试剂盒(产品目录:DP1002)提取质粒pHT305a。1.2 PCR扩增苏云金芽孢杆菌cry III A基因的pro3 α (+)启动子片段
以质粒pHT305a为模板，设计一对弓I物(两个弓I物V端分别弓I入BamH I和Sph I酶切识别序列和保护碱基)。上游引物OlF:5' -GTCTGGATCCGAAATTAGTTATACAAGCATT-3 ;(下划线为及丽Y I识别序列)；
下游引物 OlR:5' - ACATGCATGCTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3 ;(下划线为 5^1 识别序列)。用上述引物进行PCR，得到1072bp的PCR产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收。回收产物进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。1.3 cry III A基因的pro3 α (+)启动子片段的酶切
将pro3a (+)启动子片段用I和5於I内切酶进行双酶切反应(37°C 6小时)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，即为酶切后的基因的ρΓ03α (+)启动子片段。1.4 PCR扩增苏云金芽孢杆菌cry III A基因的pro3 α㈠启动子片段
以质粒pHT305a为模板，设计一对引物(两个引物5 ^端分别引入I和I酶切识别序列和保护碱基)。上游引物-TGCACTGCAGGAAATTAGTTATACAAGCATT-3 ;(下划线为 I识别序列)；
下游引物 021^:5' -AGATGTCGACTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3 ;(下划线为 I 识别序列)。用上述引物进行PCR，得到1072bp的PCR产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂(产品目录:DP1602)进行纯化回收。回收产物进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。1.5 cry III A基因的pro3 α (-)启动子片段的酶切
将pro3a (-)启动子片段用I和I内切酶进行双酶切反应(37°C 6小时)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，即为酶切后的基因的ρΓ03α (-)启动子片段。二、小菜蛾精氨酸激酶基因片段的制备
2.1提取小菜蛾总RNA
取小菜蛾幼虫(来自本实验饲养的品系)，使用动物组织总RNA提取试剂盒(产品目录:DP431)提取总 RNA。2.2反转录得到cDNA
使用M-MLV逆转录酶，将步骤2.1中得到的总RNA反转录成cDNA。2.3 PCR扩增目 的基因片段
根据小菜蛾AK全基因序列(GenBank:HQ327310.1 )，确定大小为325bp的基因片段。利用Primer Premier 5.0软件设计如下引物,并在其中一条引物的一端加上5於I酶切位点和保护喊基。上游引物-ACATGCATGCCCGCCAACGCTTGCCGCTT-3;(下划线为 5於 I 识别序列)；
下游引物 031^:5' -TGGTACTTGGACGCCACCT-3 ;。用上述引物进行PCR，得到325bp的PCR产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收。回收产物进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。2.4目的基因片段于PUM-T载体的连接
用PUM-T载体试剂盒(产品目录:DP6701)连接目的片段。2.5目的基因片段的酶切
将上述步骤2.4中用I内切酶进行酶切反应(37°C 6小时)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，即为酶切后的目的基因片段。三、载体骨架的制备
3.1提取质粒pHT305a
取含有质粒pHT305a菌株的单菌落于LB液体培养基(含有50ng/ml Amp和50ng/mlErm)中过夜培养，用高纯质粒小量制备试剂盒(产品目录:DP1002)提取质粒pHT305a。3.2将质粒pHT305a用BamH I内切酶进行酶切反应(30°C 6小时)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Bio Teke胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，即为酶切后的载体骨架。四、质粒pHT305AKR 构建4.1将上述步骤一得到的酶切后的正向启动子pro3a (+)片段与上述步骤二得到的酶切后的目的基因片段用T4连接酶进行连接(16°C 12小时)。酶连产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Bio Teke胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，得到正向启动子与目的基因片段的连接产物。4.2将上述步骤4.1中得到的连接产物用Sph I内切酶进行酶切反应(37°C 6小时)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收。4.3将上述步骤4.2得到的连接产物与载体骨架用T4连接酶进行连接(16°C 12小时)。酶连产物琼脂糖凝胶电泳，用Bio Teke胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，得到含有正向启动子与目的基因片段的连接产物。4.4将上述步骤4.3中的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态，涂板，37°C过夜培养。4.5 挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，用Bio Teke的高纯质粒小量制备试剂盒(产品目录:DP1002)提取质粒，以提取的质粒为模板，用01引物对和03引物对组合成的引物进行PCR扩增，得到2027bp的PCR产物。4.6提取上述步骤4.5中的质粒用Pst I和Sal I内切酶进行双酶切反应(37°C6小时)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Bio Teke胶回收试剂盒(产品目录:DP1602)进行纯化回收，即为后续连接酶切后的反向启动子pro3a (-)片段的载体骨架。4.7将上述步骤一得到的酶切后的反向启动子pro3a (-)片段与上述步骤4.6得到的酶切后的载体骨架用T4连接酶进行连接(16°C 12小时)。4.8将上述步骤4.7得到的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态，涂板，37°C过夜培养。4.9挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，用Bio Teke的高纯质粒小量制备试剂盒(产品目录:DP1002)提取质粒，以提取的质粒为模板，用OlF和02R组成的引物对进行PCR扩增，得到2.5kb左右的PCR产物JfPCR产物进行测序，测序结果表明PCR产物中含有如SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。质粒pHT305AKR的结构示意图见图2。实施例2、苏云金芽孢杆菌工程菌的构建和应用 一、质粒提取
取含有质粒PHT305AKR菌株的单菌落于LB液体培养基(含有50ng/ml Amp和50ng/mlErm)中过夜培养，用高纯质粒小量制备试剂盒(产品目录:DP1002)提取质粒pHT305AKR。二、苏云金芽孢杆菌BMB171感受态制备
2.1将BMB171于30 0C，200r/min摇床过夜培养。2.2按1%接种量转入LB培养基中，30°C，220r/min培养至OD6tltl为1.2-1.5为止。2.3将步骤2.2中的培养液于冰上放置lOmin，转入冰预冷的大离心管，6000r/η η、4。。离心 lOmin。2.4弃去上清,加入IOml冰预冷的SG缓冲液,6000r/min、4°C离心IOmin,去上清。
重复3次。2.5用SG缓冲液从悬菌体，分装于Ep管中，_80°C保存。三、工程菌构建
3.1将5ul质粒加入200ul BMB171感受态细胞中，混匀后转移至电击杯中，冰上放置30min让其彻底冷却。3.2电转:电转条件为2.5kv, 25uF, 200 Ω，电击后冰浴5min。3.3复苏:将电击杯中的菌液转至EP管中，并加入SOC培养基，30°C振荡培养2h。3.4涂板:回收菌体，涂布于LB平板(含Erm和Amp)上，30°C倒置培养过夜。3.5挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，以菌落为模板，以引物对Ol和02组成的引物对进行菌落PCR验证。用上述引物进行PCR，得到2497bp的PCR产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂(产品目录:DP1602)进行纯化回收。回收产物进行测序，测 序结果表明PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。四、苏云金芽孢杆菌工程菌的应用
4.1提取重组菌株和原始菌株的总RNA。挑取阳性单菌落，于液体LB培养液中摇床过夜培养，利用养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(产品目录:DP430)提取工程菌总RNA。4.2将上述步骤4.1中提取得到的总RNA分别用核酸酶SI处理30min。4.3将上述步骤4.2中得到的酶处理产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图4所示，证明了本发明提供的质粒可实现在苏云金芽孢杆菌中表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA。4.4喂食试验
将萝卜叶浸泡在4.1处理后的菌液中，然后放置在培养瓶中，饲养小菜蛾幼虫。观察其死亡情况。统计小菜蛾在第2天、第4天和第6天的死亡率，分别为70 %、82.22 %、97.78 %。说明改造后的工程菌具有明显的杀虫效果，为小菜蛾的控制提供新途径。
权利要求
1.一种表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒，其特征在于:所述表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒是在质粒pHT305a饱BamH I和I酶切位点之间插入SEQ IDN0.1所示的DNA得到的重组质粒，命名为质粒pHT305AKR。
2.如权利要求1所述的质粒PHT305AKR构建的工程菌。
3.如权利要求1所述的质粒PHT305AKR构建的苏云金芽孢杆菌工程菌。
4.如权利要求3所述的苏云金 芽孢杆菌工程菌在制备Bt生物杀虫剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的质粒及应用，属于基因工程领域。本发明提供了质粒pHT305AKR，是在质粒pHT305a的BamHI和PstI酶切位点之间插入SEQIDNO.1所示的DNA得到的重组质粒。质粒pHT305AKR不仅实现了在苏云金芽孢杆菌表达dsRNA的研究，为把RNAi技术应用于苏云金芽孢杆菌基因的功能鉴定和苏云金芽孢杆菌功能基因组的研究提供强有力的手段，也可以利用宿主细菌合成dsRNA，降低了获得dsRNA的成本。本发明还为外源改造苏云金芽孢杆菌，研制苏云金芽孢杆菌生物农药提供了方向，具有广阔的应用前景。同时本发明为小菜蛾的控制提供新途径，开创害虫控制的新领域。
文档编号C12N1/21GK103215299SQ20131013447
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者杨广, 尤民生, 陈金芝, 徐秀凤, 汪淑燕 申请人:福建农林大学