专利名称：一种肿瘤细胞转移能力评价方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种肿瘤细胞转移能力评价方法。
背景技术：
在过去的几十年里，抗肿瘤药的筛选主要是考察其对快速生长细胞的毒性作用。随着肿瘤生物学研究的发展，人们认识到:肿瘤细胞不仅具有旺盛的增殖能力，而且还具有破坏自身组织、浸润相邻组织以及浸润血管或淋巴管并随着血液或淋巴液转移到其他组织的能力。肿瘤和正常组织的相互作用与肿瘤的血管生成、侵袭和转移等特性有很大的关系。肿瘤转移已成为近年来的研究热点之一，现有肿瘤转移的研究主要包括体外或体内模型。体内模型主要采用免疫功能低下的小鼠或大鼠来研究，主要包括:1.自发模型；
2.基因工程模型；3.肿瘤移 植模型。其中，自发模型的模型低重复性和基因工程模型的高价格以及高技术要求使得这两种模型更多的应用于肿瘤病因和药物预防研究中。可移植肿瘤模型以其良好的相似性和重复性广泛应用于抗肿瘤药的临床前筛选，但该模型有重要的缺陷，即皮下移植很少转移，侵袭力也很弱，不适合用于针对原发灶的自发转移进行新药筛选。另外，抗肿瘤转移的临床药效学评价，最直接的支持依据应该是对转移灶的影响结果。但在对转移灶出现的时间、部位、病理类型，尤其是微小转移灶的检测方面，目前存在有相当大的困难。因此很难获得抗肿瘤转移的直接指标。通常的采用的肿瘤缓解率、增长速度、辅助性的肿瘤转移生化指标等，难以为抗肿瘤转移作用提供客观的直接依据，更难以将抗肿瘤转移作用与抗肿瘤作用区别开来。这些都给受试药物抗肿瘤转移作用的判断带来了挑战。体外模型主要集中于单个分子的机制研究和侵袭转移能力的检测，现有测试方法不仅不方便，而且仅考虑单个分子，造成测试结果不准确。在任何国家新药研发都是一个高投入，高风险耗时长但一旦成功便会有巨大效益的艰苦过程。如何在较短的研发周期内研发出高效、安全的抗肿瘤药物是一个世界性难题。特别是我国长期以仿制国外药品为主，由于研究经费短缺，技术、设备落后、供筛样品过少等原因，使新药筛选与相关基础研究成为新药研究系统工程中最薄弱的环节。因此，本专利涉及的用于评价抑制肿瘤细胞生长和转移的抗肿瘤药物的方法在抗肿瘤药物研发领域有着广阔的推广应用前景。
发明内容
发明目的:本发明的第一目的是提供一种工艺简单、效率高的肿瘤细胞转移能力评价方法。本发明的第二目的是提供了利用上述方法筛选的转移能力强的肿瘤细胞。本发明的第三目的是提供了上述转移能力强的肿瘤细胞在抗肿瘤转移药物筛选中的应用。技术方案:本发明提供的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，包括以下步骤:
(I)肿瘤细胞的采集与培养:采集待评价肿瘤细胞得细胞悬液，培养细胞悬液；(2)肿瘤细胞转移能力评价:将培养后的细胞悬液于聚丙烯酰胺培养基底上继续培养，给予抗肿瘤细胞转移药物后，观察细胞形态，定量分析细胞层的面积、细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度、细胞间连接的强度并作为肿瘤细胞转移能力评价标准，药物刺激后Colo205细胞面积大于20 μ m2、细胞间强度变化10倍以上者即判定为有效体。步骤(I)中，肿瘤细胞的采集方法为:取待评价肿瘤细胞进行单克隆化，并制成细胞悬液；优选地，本发明采用以下方法，以进一步提高筛选精度:取待评价肿瘤细胞进行单克隆化得待评价肿瘤细胞的单克隆细胞，以10 μ M Staurosporin对单克隆细胞进行刺激诱导单克隆细胞之间恢复细胞连接，选取刺激前后细胞面积变化最大的单克隆细胞制成细胞悬液；更进一步优选地，所述肿瘤细胞为Colo205细胞，肿瘤细胞的采集方法为:取Colo205细胞进行单克隆化，以ΙΟμΜ Staurosporin对单克隆细胞进行刺激诱导恢复细胞连接,选取刺激前后细胞面积变化最大的克隆为实验对象，并制备细胞悬液。步骤(I)中，肿瘤细胞的培养方法为:离心细胞悬液，沉淀加入DMEM10%血清培养基于C02培养箱中培养，培养温度为37°C，培养时间24-48h，pH为7.0-7.2，CO2浓度为5%。步骤(2)中，抗肿瘤转移药物为Nocodazole、Staurosporin。步骤(2)中，细胞形态、细胞层面积的测定方法为:通过细胞膜免疫荧光染色、生物显微镜成像来对细胞形态，细胞层面积进行测定。步骤(2)中，细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度的测定方法为:对细胞与基底部连接的蛋白标识物分子Vinculin的信号数量进行定量测定。步骤⑵中，细胞间连接的强度:通过对细胞间连接分子E-cadherin蛋白质进行免疫染色，继而进行定量测定。本发明还给出了 上述的肿瘤细胞转移能力评价方法在抗肿瘤转移药物筛选中的应用，以肿瘤细胞转移能力评价的结果作为抗肿瘤转移药物筛选的依据进行抗肿瘤转移药物筛选。有益效果:本发明提供的肿瘤细胞转移能力评价方法成本低廉、操作简便、结果易判、快速准确。本发明利用上述方法，以分子生物学以及细胞生物学手段为基础，筛选出转移性较强肿瘤细胞，并建立体外癌细胞转移模型，能够高效筛选出对癌症细胞的转移具有潜在抑制作用的药物，为高通量药物筛选提供简单易行的方法，缩短新药的开发周期，该方法具有成本低廉、操作简便、结果易判、快速准确的特点。传统新药开发方法通常需要确定化合物、研发、临床一二三期，通常需要经历10-15年才能开发出新的药物，采用本方法利用转移能力强的肿瘤细胞可直接高通量筛选现有药物，筛选后仅需进行临床三期评价即可得到抗肿瘤转移新药，开发周期大大缩短。
:图1为药物刺激前后大肠癌上皮细胞Colo205的变化。图2为药物刺激前后大肠癌上皮细胞Colo205的变化；图中存在绿色的E-cadherin免疫荧光染色。
图3为药物刺激前后大肠癌上皮细胞CaCo2的变化；图中存在绿色的E-cadherin免疫荧光染色。图4为进行药物筛选的96孔板。图5为利用本发明转移能力强的肿瘤细胞筛选抗肿瘤转移药物流程图。
具体实施方式
:根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明所用试剂及其来源为:Staurosporiin S4400Sigma-AldrichNocodazole ml404Sigma-AldrichDMEM 培养基 I2491-Ol5InvitrogenE-cadherin 抗体 abl416AbcamVinculin 抗体 V4319Sigma-Aldrich本发明所用软件及其来源为:本项目所采用软件来源为imagej软件进行定量分析。参考:http: //rsb.1nfo, nih.gov/i i/实施例1利用肿瘤细胞转移能力评价方法筛选转移能力强的肿瘤细胞对肿瘤细胞Colo205、CaCo2评价其转移能力，包括以下步骤:(I)肿瘤细胞的采集与培养:取Colo205、CaCo2细胞进行单克隆化，以10M Staurosporin对单克隆细胞进行刺激诱导恢复细胞连接，选取刺激前后细胞面积变化最大的克隆为实验对象，并制备细胞悬液；也可以采用下述方法采集肿瘤细胞:取待评价肿瘤细胞进行单克隆化，并制成细胞悬液；或，取待评价肿瘤细胞进行单克隆化得待评价肿瘤细胞的单克隆细胞，以Staurosporin对单克隆细胞进行刺激诱导单克隆细胞之间恢复细胞连接,选取刺激前后细胞面积变化最大的单克隆细胞制成细胞悬液；离心细胞悬液，沉淀加入DMEM10%血清培养基于CO2培养箱中培养，培养温度为37°C，培养时间为 24-48h, pH 为 7.0-7.2，CO2 浓度为 5%。(2)肿瘤细胞转移能力评价:将细胞悬液于聚丙烯酰胺培养基底上培养，给予抗肿瘤细胞转移药物后，观察细胞形态，定量分析细胞层的面积、细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度、细胞间连接的强度，所述抗肿瘤细胞转移药物可选择Nocodazole或Staurosporin中的一种，具体而言:a.细胞形态和细胞层面积的测定方法为:通过细胞膜免疫荧光染色、生物显微镜DIC成像来对细胞形态，细胞层面积进行测定；当细胞层面积小于20 μ m2即认为其对细胞细胞连接无影响。细胞面积测定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/cell-counter, html
b.细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度的测定方法为:对细胞与基底部连接的蛋白标识物分子Vinculin的信号数量进行定量测定。测定细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度测定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/particle-analyzer.htmlc.细胞与细胞间连接的强度:通过对细胞间连接分子E-cadherin蛋白质进行免疫染色，以细胞连接处与细胞质中E-cadherin的免疫荧光强度之比作为细胞连接的强度指标，继而进行定量测定。细胞连接强度测定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/radial-profiIe.html测定结果(表一):
权利要求
1.一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)肿瘤细胞的采集与培养:采集待评价肿瘤细胞得细胞悬液，培养细胞悬液； (2)肿瘤细胞转移能力评价:将培养后的细胞悬液于聚丙烯酰胺培养基底上继续培养，给予抗肿瘤细胞转移药物后，观察细胞形态，定量分析细胞层的面积、细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度、细胞间连接的强度并作为肿瘤细胞转移能力评价标准。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(I)中，肿瘤细胞的采集方法为:取待评价肿瘤细胞进行单克隆化，并制成细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(I)中，肿瘤细胞的采集方法为:取待评价肿瘤细胞进行单克隆化得待评价肿瘤细胞的单克隆细胞，以ΙΟμΜ Staurosporin对单克隆细胞进行刺激诱导单克隆细胞之间恢复细胞连接,选取刺激前后细胞面积变化最大的单克隆细胞制成细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(I)中，所述肿瘤细胞为Colo205细胞，肿瘤细胞的采集方法为:取Colo205细胞进行单克隆化，以10 μ M Staurosporin对单克隆细胞进行刺激诱导恢复细胞连接,选取刺激前后细胞面积变化最大的克隆为实验对象，并制备细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(I)中，肿瘤细胞的培养方法为:离心细胞悬液，沉淀加入DMEM10%血清培养基于培养箱中培养，培养温度为370C，培养时间为24-48h，pH为7.0-7.2，CO2浓度为5%。
6.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞形态和细胞层面积的测定方法为:通过细胞膜免疫荧光染色、生物显微镜成像对细胞形态、细胞层面积进行测定。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度的测定方法为:对单位细胞的基底部连接的蛋白标识物分子Vinculin的信号数量进行定量测定。
8.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞转移能力评价方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞间连接的强度:通过对细胞间连接分子E-cadherin进行荧光免疫染色，继而进行定量分析。
9.权利要求1所述的肿瘤细胞转移能力评价方法在抗肿瘤转移药物筛选中的应用，其特征在于:以肿瘤细胞转移能力评价的结果作为抗肿瘤转移药物筛选的依据进行抗肿瘤转移药物筛选。
全文摘要
本发明提供了一种肿瘤细胞转移能力评价方法，包括以下步骤肿瘤细胞的采集与培养采集待评价肿瘤细胞得细胞悬液，培养细胞悬液；肿瘤细胞转移能力评价给予抗肿瘤细胞转移药物后，检测细胞形态、细胞层面积、细胞与聚丙烯酰胺培养基底连接的强度、细胞间连接的强度，并作为肿瘤细胞转移能力评价标准。本发明提供的肿瘤细胞转移能力评价方法具有成本低廉、操作简便、结果易判、快速准确的特点。本发明利用上述方法，以分子生物学以及细胞生物学手段为基础，筛选出转移性较强癌细胞，并建立体外癌细胞转移模型，能够高效筛选出对肿瘤细胞转移具有潜在抑制作用的药物，为高通量药物筛选提供简单易行的方法，缩短新药的开发周期。
文档编号C12Q1/02GK103184263SQ20131013384
公开日2013年7月3日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者孟文翔, 滕文臣 申请人:孟文翔