专利名称：一种提取胡萝卜花粉小孢子的方法
技术领域：
本发明的目的是提供一种提取胡萝卜花粉小孢子的方法。
背景技术：
游离小孢子培养技术是一项发展较快的细胞工程技术，在多种作物中得到应用，如小麦、甘蓝、大白菜等，该技术能够利用花粉小孢子的离体培养快速获得纯合二倍体，从而创制出用于培育品种的新种质。胡萝卜游离小孢子培养技术已有研究(李金荣，欧承刚，庄飞云等.胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究，园艺学报，2011，38(8):1539-1546.)，并获得胚状体植株，但数量较少，限制了该技术在胡萝卜生产中的广泛应用。产生这个问题的一个主要原因是胡萝卜花器官小，适宜培养时期的花蕾长约1_，花药直径小于1mm，采用报道中所述方法很难充分挤压到花药并释放小孢子，因此获得的游离小孢子数量及诱导产生的胚状体数量较少，相应的最终获得的胚状体植株数也减少；并且在提取过程中，会产生大量体细胞组织杂质，影响最终的提取质量和培养效果。现有胡萝卜花粉小孢子提取方法存在提取数量少、提取效率低等问题。目前，急需一种能够快速、高效、高质量分离胡萝卜花粉小孢子的提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种胡萝卜花粉小孢子的新型提取方法。该方法可以快速、高效分离胡萝卜花粉小孢子，提高单位操作中花粉小孢子的提取数量，增加培养数量，最终提闻胚状体植株的获得量。本发明所提供的提取胡萝卜小孢子的方法，具体可包括如下步骤:(I)将经过消毒的胡萝卜花序置于直径为70 90mm (如90mm)的研钵(如陶瓷研钵)中，加入B5液体培养基，用锤头直径为25 30mm (如25mm)的研锤挤压花蕾释放小孢子，得到悬浮液；(2)用400目孔径的滤网过滤步骤(I)所得的悬浮液，收集滤液；(3)对步骤(2)所得的滤液依次按照如下(a) - (c)的步骤进行梯度离心，获得小孢子:(a) 150 155g (如153g)离心4 6min (如5min),弃上清，收集沉淀；(b)用所述B5液体培养基悬浮步骤(a)所得沉淀，125 130g (如129g)离心4 6min (如5min),弃上清,收集沉淀；(C)用所述B5液体培养基悬浮步骤(b)所得沉淀，105 IlOg (如106g)离心4 6min (如5min),弃上清,收集沉淀。在所述方法的步骤(I)中，所述胡萝卜花序以小孢子处于单核晚期的胡萝卜花序为最佳。 在所述方法的步骤(I)中，所述胡萝卜花序与所述B5液体培养基的配比为15-20个所述胡萝卜花序:2mL所述B5液体培养基。
在本发明的一个实施例中，步骤(I)中，加入到所述直径为70 90mm的研钵中的所述胡萝卜花序具体为15-20个，加入的所述B5液体培养基具体为2mL。在本发明的一个实施例中，所述方法的步骤(2)中，所述400目孔径的滤网为双层滤网。在实际操作中，为了减少小孢子的损失，在所述方法中，在步骤(2)所述用400目孔径的滤网过滤步骤(I)所得的悬浮液之后，还包括如下步骤:用所述B5液体培养基冲洗所述研钵和过滤所述悬浮液后剩余的滤渣，得到冲洗液，并用所述400目孔径的滤网对所述冲洗液进行过滤，将此处所得滤液与前面过滤所述悬浮液所得的滤液合并。在所述方法中，在步骤(I)所述挤压花蕾释放小孢子之后，还包括向所述研钵中加入所述B5液体培养基充分悬浮小孢子的步骤。在本发明的一个实施例中，此处所述B5液体培养基的加入量为5mL。在所述方法中，在步骤(3)之后还包括用NLN液体培养基悬浮步骤3中步骤(C)所得沉淀，调整小孢子密度(如1.5X105f/mL)以备用于培养的步骤。在所述方法中，步骤(I)中，所述胡萝卜花序具体是按照包括如下步骤的方法进行消毒的:将待消毒的胡萝卜花序用清水洗净后，置于体积百分含量为75%的乙醇水溶液中浸泡30±5s (如30s)后,用为体积百分含量为10%的次氯酸钠水溶液浸泡15±2min (如15min)，再用无菌水浸泡冲洗，得到步骤(I)中所述的经过消毒的胡萝卜花序。在本发明的一个实施例中，所述提取胡萝卜小孢子的方法，具体包括如下步骤:(al)将小孢子处于单核晚期的胡萝卜花序用自来水冲洗后，用体积百分含量为75%的乙醇水溶液浸泡30s,用体积百分含量为10%的次氯酸钠水溶液浸泡15min,再用无菌水浸泡冲洗4次，每次lmin，得 到消毒后的所述胡萝卜花序；(a2)取15 20个消 毒后的所述胡萝卜花序，放入直径为90mm的陶瓷研钵中，力口2ml的B5液体培养基，用锤头直径为2.5cm的研锤挤压花蕾分离小孢子，再加入5ml的所述B5液体培养基悬浮小孢子，得到悬浮液；(a3)用双层400目孔径的滤网过滤所述悬浮液(由于胡萝卜小孢子直径15 25 μ m,采用孔径为38 μ m的400目双滤网过滤，可以最大程度的阻挡较大组织碎片);用5ml的B5液体培养基冲洗所述研钵和过滤后的滤渣3次，用50ml离心管收集全部滤液。(a4)梯度离心:将所述滤液153g离心5min,弃上清,收集沉淀,用35ml的B5液体培养基重新悬浮沉淀，混匀；129g离心5min，弃上清，收集沉淀，用35ml的B5液体培养基重新悬浮沉淀，混勻；106g离心5min,弃上清，收集沉淀,用NLN液体培养基将沉淀悬浮,调整小孢子密度为1.5 X IO5个/ml个小孢子(通过梯度离心将质量小于小孢子的碎片冲洗掉)。在所述方法中，所述B5液体培养基具体可参照文献“李俊明编译.2002.植物组织培养教程.北京:中国农业大学出版社”中所述进行配制。。在所述方法中，所述NLN液体培养基具体可参照文献“Lichter, R.1982.1nduction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus.Z.PflanzenPhysiol, 105:427-434.” 中所述进行配制。在本发明的一个实施例中，所述胡萝卜具体为如下胡萝卜中的任一种:(松滋野生X阿姆斯特丹)-36 (BC2S3)、(松滋野生X阿姆斯特丹)-39 (BC2S3)、7262BXHCMA.C.(F7)、早春红冠(F1)、时田5寸X7262B (F2)、两头齐X早春红冠(BC1S2)、早春红冠X两头齐(FI)、HnOOl (自交系)、FN2_9 (自交系)、黑田5寸(自交系)和HCM A.C.(自交系)。本发明提供的提取胡萝卜花粉小孢子的方法可以增加小孢子提取数量，提高培养效率，操作简便易行，同时还能最大程度的减少组织碎片等杂质对小孢子离体培养的影响。
图1为为显微镜观察100X视野下花粉小孢子的数量。其中，A为本发明方法提取的小孢子。B为对照方法提取的小孢子。图2为本发明游离小孢子培养获得的胚状体及其再生植株。其中，A为胚状体；B为再生植株。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中共涉及11份胡萝卜供试材料，除Hn001、FN2_9、黑田5寸、HCMA.C.为自交系，早春红冠为自交的Fl代外，其它的采用人工去雄的方法通过杂交或回交等得到的杂交后代或回交后代，详见表2。共涉及如下10个胡萝卜品种:松滋野生、阿姆斯特丹、7262B、HCM A.C.、早春红冠、时田5寸、两头齐、HnOOl、FN2-9和黑田5寸。其中，阿姆斯特丹、HCM A.C.、早春红冠、时田5寸、两头齐和黑田5寸记载在“李金荣，欧承刚，庄飞云，赵志伟，胡鸿，毛笈华.胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究.园艺学报,2011,38(8): 1539 - 1546.” 一文中；7262B记载在“庄飞云，裴红霞，欧承刚，胡鸿，赵志伟，李金荣.胡萝卜小孢子胚状体和愈伤组织的诱导.园艺学报，2010,37(10):1613 -1620” 一文中；松滋野生 从国家蔬菜种质资源中期库获得、HnOOl从北京华耐农业发展有限公司获得，FN2-9从美国农业部蔬菜研究中心(VCRU，ARS-USDA)获得；公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得各个材料。B5液体培养基:参照文献“李俊明编译.2002.植物组织培养教程.北京:中国农业大学出版社”中所述进行配制。NLN 液体培养基:参照文献“Lichter, R.1982.1nduction of haploid plantsfrom isolated pollen of Brassica napus.Z.Pflanzen Physiol, 105:427-434.，，中所述进行配制。。实施例1、提取胡萝卜花粉小孢子的方法本实施中共涉及11份胡萝卜供试材料，除HnOOl、FN2-9、黑田5寸和HCM A.C.为自交系外，早春红冠为Fl代，其它的采用人工去雄的方法通过杂交或回交等得到的杂交后代或回交后代，详见表2。本发明提取胡萝卜花粉小孢子的方法(实验组)以李金荣等在“李金荣，欧承刚，庄飞云等.胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究，园艺学报，2011，38(8):1539-1546.”一文中公开的胡萝卜花粉小孢子的提取方法作为对照(对照组)。本发明提取胡萝卜花粉小孢子的方法(实验组)，具体如下:一、胡萝卜花序的消毒在胡萝卜花序展开时，取小孢子处于单核晚期的胡萝卜花序，用清水洗净。在超净工作台上用75% (体积分数)酒精水溶液浸泡30s后，用10% (体积百分含量)次氯酸钠水溶液浸泡15min，再用无菌水浸泡冲洗4次，每次lmin，得到消毒后的花序，待用。二、胡萝卜小孢子的游离取15 20个步骤一得到的消毒后的胡萝卜花序放入直径为90mm的陶瓷研钵中，加2ml B5液体培养基，用锤头直径2.5cm的研锤充分挤压花蕾，释放小孢子。三、胡萝卜小孢子的收集向研钵中加入5ml B5液体培养基将小孢子悬浮，用双层400目孔径滤网静置过滤，再用5ml B5液体培养基冲洗研钵和上述过滤后的滤渣3次，过滤，用50ml离心管收集全部滤液。1200rpm (相当于153g)转速离心5min,弃上清；加30ml B5液体培养基冲洗沉淀，混勻，IlOOrpm (相当于129g)转速离心5min,弃上清；加30ml B5液体培养基冲洗沉淀，混匀，IOOOrpm (相当于106g)转速离心5min，弃上清；加NLN液体培养基，调整小孢子密度
1.5 X IO5个/ml用于培养。图1为本发明提取方法和对照方法，在上述离心后加入相等的少量NLN液体培养基后小孢子悬浮液的100倍下的显微镜图。从图中可以看出，本发明提取方法所提取的小孢子数量多于对照方法，且杂质少，净度较高。另外，当用NLN液体培养基将两方法提取的小孢子同调整为1.5X IO5个/ml的培养密度下，本发明方法(实验组)获得悬浮液的平均体积显著高于对照方法(表I)。以上结果表明，本发明所提供的方法与对照方法相比，胡萝卜花粉小孢子的提取效率大大提高了。表I不同基因型胡萝卜获得相同密度小孢子悬浮液的体积(单位:ml)
权利要求
1.一种提取胡萝卜花粉小孢子的方法，包括如下步骤: (1)将经过消毒的胡萝卜花序置于直径为70 90mm的研钵中，加入B5液体培养基，用锤头直径为25 30mm的研锤挤压花蕾释放小孢子，得到悬浮液； (2)用400目孔径的滤网过滤步骤(I)所得的悬浮液，收集滤液； (3)对步骤(2)所得的滤液依次按照如下(a)-(c)的步骤进行梯度离心，获得小孢子: (a)150 155g离心4 6min,弃上清,收集沉淀； (b)用所述B5液体培养基悬浮步骤(a)所得沉淀，125 130g离心4 6min,弃上清，收集沉淀； (c)用所述B5液体培养基悬浮步骤(b)所得沉淀，105 IlOg离心4 6min,弃上清，收集沉淀。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述胡萝卜花序为小孢子处于单核晚期的胡萝卜花序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述胡萝卜花序与所述B5液体培养基的配比为15-20个所述胡萝卜花序:2mL所述B5液体培养基。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述400目孔径的滤网为双层滤网。
5.根据权利要求1-4 中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在步骤(2)所述用400目孔径的滤网过滤步骤(I)所得的悬浮液之后，还包括如下步骤:用所述B5液体培养基冲洗所述研钵以及过滤所述悬浮液后剩余滤渣，得到冲洗液，并用所述400目孔径的滤网对所述冲洗液进行过滤。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在步骤(I)所述挤压花蕾释放小孢子之后，还包括向所述研钵中加入所述B5液体培养基的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，步骤(3)之后还包括用NLN液体培养基悬浮步骤(c)所得沉淀，调整小孢子密度的步骤。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述胡萝卜花序是按照包括如下步骤的方法进行消毒的:将待消毒的胡萝卜花序置于体积百分含量为75%的乙醇水溶液中浸泡30±5s后,用体积百分含量为10%的次氯酸钠水溶液浸泡15±2min,再用无菌水浸泡冲洗，得到权利要求1步骤(I)中所述的经过消毒的胡萝卜花序。
全文摘要
本发明公开了一种提取胡萝卜花粉小孢子的方法。该方法包括如下步骤1)将经过消毒的胡萝卜花序置于直径为70～90mm的研钵中，加入B5液体培养基，用锤头直径为25～30mm的研锤挤压花蕾释放小孢子，得到悬浮液；2)用400目孔径的滤网过滤步骤1)所得悬浮液，收集滤液；3)对步骤2)所得滤液依次按照如下a)-c)的步骤进行梯度离心，获得小孢子a)150～155g离心4～6min，弃上清，收集沉淀；b)用所述B5液体培养基悬浮步骤a)所得沉淀，125～130g离心4～6min，弃上清，收集沉淀；c)用所述B5液体培养基悬浮步骤b)所得沉淀，105～110g离心4～6min，弃上清，收集沉淀。本发明方法可增加小孢子提取数量，提高培养效率，操作简便，同时还能最大程度减少组织碎片等杂质对小孢子离体培养的影响。
文档编号C12N5/04GK103194422SQ201310133308
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者欧承刚, 庄飞云 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所