专利名称：一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种染色体重组增效蛋白基因(Enhancin)苏云金杆菌工程菌的构建方法，尤其是一种以转属主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-Ι将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因，从而构建稳定表达增效蛋白基因、无抗性标记基因的增效Bt工程菌的方法。
背景技术：
长期以来，农业病虫害的危害主要依赖化学农药防治。我国农田化学农药有效含量年用量超过250000吨，致使农产品农药残留增加、害虫危害加重、生态环境破坏。推广应用生物农药，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。苏云金杆菌(feci77w5.Bt)是研究、应用范围最广的生物杀虫剂，其主要作用成分为具体代谢产生的杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)或δ -内毒素(delta-endotoxin)。ICPs对多种重要的农林业害虫具毒杀作用，Bt已作为有效的微生物农药广泛应用于害虫的生物防治。然而受本身生物学特性的限制，在实际使用中存在毒力不强、杀虫谱窄、杀虫速度慢等影响大面积推广应用的问题，同时害虫对苏云金杆菌抗药性的产生和发展也越来越受到人们的关注，因此构建广谱、高效Bt杀虫工程菌成为苏云金杆菌杀虫剂研究与开发的新方向。增效蛋白(Enhancin)最早是在粘虫颗粒体病^iPseudaletiaunip皿ctagranulovirus, PuGV)包涵体中发现的能提高核型多角体病毒侵染能力的生物增效因子，目前已在PuGV、粉纹夜蛾颗粒体病毒(rricAoWttsia ni GV，TnGV)、棉铃虫颗粒体病毒{Helicoverpa armigera, HaGV)等8种颗粒体病毒、4种痘病毒、2种多角体病毒中发现这类增效作用的蛋白存在 。增效蛋白对Bt毒力同样具有显著增强作用。将TnGV包涵体中纯化的增效蛋白加入Bt后饲喂试虫，测试的6种不同鳞翅目幼虫的死亡率提高了 2-10倍；4种不同的Bt商品制剂中加入TnGV增效蛋白对粉纹夜蛾的防效提高了 3-6倍。江苏里下河地区农科所自2000年开展转属主颗粒体病毒PuGV-Ps对Bt增强作用研究，证明PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，微量PuGV-Ps对Bt增效作用显著，同时可提高Bt对害虫的作用速度。颗粒体病毒增效蛋白的杀虫增效活性，在杆状病毒、苏云金杆菌等微生物农药的研究应用上具有广阔的前景。目前构建Bt工程菌的主要途径是通过增加ICPs基因拷贝数、消除冗余质粒、辅助蛋白利用等手段提高ICPs基因的表达量。这种改造虽提高了 Bt工程菌的杀虫活性，但某种意义上讲是通过提高ICPs使用浓度而提高防效，同样也存在由于增加ICPs选择压力带来的害虫抗药性风险
发明内容
本发明的目的是提供一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法，本发明利用增效蛋白基因构建增效基因，在ICPs正常使用浓度下，通过增效蛋白的协同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，从而增强防效，产品毒力强、杀虫谱宽、杀虫速度快，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-Ι将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。上述染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法:
(1)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室内人工饲养东方粘虫，以PuGV感染寄主，分离纯化获得PuGV-Ps，提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En ;扩增基因En与克隆载体pET-15b经酶切连接并转化大肠杆菌DH5 α，氨苄青霉素LB平板筛选克隆子，酶切鉴定重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En ；
(2)增效蛋白整合载体的构建:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因；以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接扩增的增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel双酶切鉴定增效蛋白基因的插入位点和方向，获得增效蛋白基因整合载体pLTVl-En ；
(3)苏云金杆菌感受态细胞的制备及整合载体的转化:LB液体培养基接种苏云金杆菌活化，以LB+0.5M山梨醇为培养基转接培养制备苏云金杆菌感受态细胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pL TVl-En，电击法将整合载体pLTVl-En转化至苏云金杆菌感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子，获得转化子Bt-En-1 ；
(4)转化子的高温转接和筛选:将转化子Bt-En-1接种于LB培养液中，40_50°C培养并转接5-7次后涂氨苄青霉素LB平板产生单菌落，分别点种在氨苄青霉素单抗平板和无抗平板的对应位置，置28-30°C培养48h后，挑选无抗培养基中失去抗性的单菌落，显微镜镜检是否产生伴胞晶体蛋白，再通过提取质粒和PCR扩增，最后得到染色体重组增效蛋白苏云金杆菌工程菌Bt-En。步骤(I)中所述提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En的方法为:碱裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，设计上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAAGTG ATT GTA CCC GC T-3，，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TATCAT T -3’，引入!,Xho I两个酶切位点，PCR扩增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR扩增的反应条件:先94°C预变性4min，然后依次94°C变性30sec、56°C复性30sec、72°C延伸3min，30个循环；最后72°C延伸IOmin ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。步骤(2)中所述以重组增效蛋白基因质粒pET-15b_En为模板，扩增增效蛋白基因为:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，设计上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位点，PCR 扩增增效蛋白基因，PCR扩增反应条件:先95°C预变性5 min，然后依次97°C变性30sec、55°C复性30sec、72°C延伸3min，35个循环；最后72°C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。步骤(2)中所述以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO的方法为:以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，5.湖 7酶切线性化后与所述扩增增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反应15min，将增效蛋白基因连接到整合载体pLTVl Saml酶切位点上，CaCl2法到转化大肠杆菌感受态细胞ToplO。步骤(3)中所述ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pLTVl-En的方法为:ToplO-3菌株氨苄青霉素LB培养液培养，小量质粒提取法提取增效蛋白基因整合载体PLTVl-En0步骤(3)中所述电击法采用BIO-RAD电击仪电击转化，电击条件为20KV/cm。步骤(4)中所述转接参数为:1次/12 h，100-120代。步骤(4)中所述PCR扩增反应条件为:先94 °C预变性4 min，然后依次94 °C变性30 sec,56 °C复性30 sec,72 °C延伸3 min，30个循环；最后72 °C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
第一，增效蛋白是昆虫病毒基因编码的一类具有增效作用的新蛋白，对苏云金杆菌、核型多角体病毒等昆虫病原微生物的杀虫效率具有增强作用，利用增效蛋白基因构建增效基因，在ICPs正常使用浓度下，通过增效蛋白的协同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，从而增强防效。第二，增效蛋白对Bt毒力具有显著增强作用，增强Bt的毒性，杀虫谱范围扩大；PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，可提高Bt对害虫的作用速度。第二，本法明不仅可以降低农药残留、减少农广品农药残留、提闻农广品品质、减轻害虫危害，而且生态环保、保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。
图1是PCR扩增的2.7kb PuGV-Ps增效蛋白基因；
图2是克隆载体pET-15b图谱；
图3是质粒pET-15b-En的酶切鉴定；
图4是含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl图谱；
图5是增效蛋白基因整合载体pLTVl-En的酶切鉴定。
具体实施例方式一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-Ι将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。
上述染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法:
(I)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室内人工饲养东方粘虫，以PuGV感染寄主，分离纯化获得PuGV-Ps，提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En ;扩增基因En与克隆载体pET-15b经酶切连接并转化大肠杆菌DH5 α，氨苄青霉素LB平板筛选克隆子，酶切鉴定重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En ；
(2)增效蛋白整合载体的构建:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因；以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接扩增的增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel双酶切鉴定增效蛋白基因的插入位点和方向，获得增效蛋白基因整合载体pLTVl-En ；
(3)苏云金杆菌感受态细胞的制备及整合载体的转化:LB液体培养基接种苏云金杆菌活化，以LB+0.5M山梨醇为培养基转接培养制备苏云金杆菌感受态细胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pLTVl-En，电击法将整合载体pLTVl-En转化至苏云金杆菌感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子，获得转化子Bt-En-1 ；
(4)转化子的高温转接和筛选:将转化子Bt-En-1接种于LB培养液中，40_50°C培养并转接5-7次后涂氨苄青霉素 LB平板产生单菌落，分别点种在氨苄青霉素单抗平板和无抗平板的对应位置，置28-30°C培养48h后，挑选无抗培养基中失去抗性的单菌落，显微镜镜检是否产生伴胞晶体蛋白，再通过提取质粒和PCR扩增，最后得到染色体重组增效蛋白苏云金杆菌工程菌Bt-En。步骤(I)中所述提取颗粒体病毒DNA为:碱裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，设计上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GC T-3’，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CAT T -3’，引入I,IAo I 两个酶切位点，PCR扩增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR扩增的反应条件:先94 °C预变性4 min,然后依次94 °C变性30 sec,56 °C复性30 sec,72 °C延伸3 min，30个循环；最后72 °〇延伸10 min。琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。步骤(2)中所述以重组增效蛋白基因质粒pET-15b_En为模板，扩增增效蛋白基因为:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，设计上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位点，PCR 扩增增效蛋白基因，PCR扩增反应条件:先95 °C预变性5 min，然后依次97 °C变性30 sec,55°C复性30 sec,72 °C延伸3 min，35个循环；最后72 °C延伸10 min，琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。步骤(2)中所述以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO的方法为:以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，5.湖 7酶切线性化后与所述扩增增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反应15min，将增效蛋白基因连接到整合载体pLTVl Saml酶切位点上，CaCl2法到转化大肠杆菌感受态细胞ToplO。步骤(3)中所述ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pLTVl_En的方法为:ToplO-3菌株氨苄青霉素LB培养液培养，小量质粒提取法提取增效蛋白基因整合载体PLTVl-En0步骤(3)中所述电击法采用BIO-RAD电击仪电击转化，电击条件为20KV/cm。
步骤(4)中所述转接参数为:1次/12 h，100-120代。步骤(4)中所述PCR扩增反应条件为:先94 °C预变性4 min，然后依次94 °C变性30 sec,56 °C复性30 sec,72 °C延伸3 min，30个循环；最后72 °C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。实施例1
粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因的克隆:以PuGV为原始病毒，感染2龄人工饲养的东方粘虫幼虫,收集感病的虫尸研磨匀浆,3层纱布过滤，滤液经差速离心(5000 r.HiirT1 10min, 15000 r.mirT1 40 min),弃去组织残洛,用无菌的生理盐水多次洗漆沉淀,再反复差速离心，制得纯化的PuGV-Ps。碱裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，设计上游引物:5’ - GC CAT ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GC T-3’，下游引物:5’ - GC CTCGAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CAT T -3’，引入MZe I,IAo I 两个酶切位点，PCR 扩增PuGV-Ps增效蛋白基因。反应条件:先94 °C预变性4 min，然后依次94 °C变性30 sec、56 °C复性30 sec,72 °C延伸3 min，30个循环；最后72 °C延伸10 min。琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段，获得2.7kb的增效蛋白基因，见图1。图1中I为2.7 kb增效蛋白基因，M为DNA Marker。PCR产物与克隆载体pET_15b (图2)经Λ汝1、沿ο I双酶酶切后分别回收，连接转化DH5 α，氨苄青霉素的LB平板筛选。Xho I单酶切及!,Xho I双酶酶切鉴定重组质粒。质粒DNA双酶切片段与预期大小(2.7 kb)相符的质粒是重组正确的质粒，命名为质粒pET-15b-En，见图3。图3是质粒pET-15b_En的酶切鉴定，其中1、2、3、4为!,Xho I双酶切片段，5、6、7、8为沿ο I单酶切片段，M为DNA Marker。实施例2
增效蛋白基因整合载体的构建 :以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，设计上游引物:5，-AG MT TCG AGC TCG GTA CCC GGG ATG TCG TAC MA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入5)^7酶切位点，PCR扩增增效蛋白基因。反应条件:先95 °C预变性5 min，然后依次97 °C变性30 sec,55 °C复性30 sec,72 °C延伸3 min，35个循环；最后72 °C延伸10min。琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体(图Ol酶切线性化后与上述扩增纯化的增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反应15min，将增效蛋白基因连接到整合载体pLTVl Saml酶切位点上，CaCl2法到转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子ToplO-3，Xhol和Nhel双酶切鉴定增效蛋白基因的插入位点和方向，获得增效蛋白基因整合载体pLTVl-En，见图5。图5是增效蛋白基因整合载体pLTVl-En的酶切鉴定，其中M为DNA Marker，I为2.7 kb增效蛋白基因；2 为 pLTVl/small 酶切；3 为 pLTVl-En/small 酶切；4 为 pLTVl/Xhol、BamHl 双酶切。实施例3
整合载体的转化及工程菌的筛选:ToplO-3菌株氨苄青霉素LB培养液培养，小量质粒提取法提取增效蛋白基因整合载体pLTVl-En。苏云金杆菌(Bt)接种LB培养液过夜摇菌活化，LB+0.5M山梨醇为培养基转接培养至OD6tltl ^ 0.3 0.5时，以电击缓冲液(10%甘油、0.5M山梨醇、0.5M甘露醇)漂洗四次后分装400 μ 离心管中，加入提取的整合载体pLTV_En，BIO-RAD电击仪电击转化，电击条件:20KV/cm。电击后恢复培养4h，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子，获得转化子Bt-En-1。将转化子Bt-En-1接种于20 ml LB培养液中，42 °C下培养并转接6次(I次/12 h，约120代)，最后取2 5μ1菌液涂布于LB平板，待其上长出单菌落后，再挑出1000个菌落对点于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB平板上，置28-30°C培养48h后，挑选丢失氨苄青霉素抗性的菌落镜检观察伴胞晶体蛋白。转接LB培养液培养，提取质粒并按实施案例I法PCR扩增增效蛋白基因，获得染色体重组增效蛋白苏云金杆菌工程菌Bt-En 。
权利要求
1.一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，其特征是，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌Bt为受体菌，通过含转座子的衍生载体PLTVl将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。
2.权利要求1所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是: (1)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室内人工饲养东方粘虫，以PuGV感染寄主，分离纯化获得PuGV-Ps，提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En ;扩增基因En与克隆载体pET-15b经酶切连接并转化大肠杆菌DH5 α，氨苄青霉素LB平板筛选克隆子，酶切鉴定重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En ； (2)增效蛋白整合载体的构建:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因；以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接扩增的增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel双酶切鉴定增效蛋白基因的插入位点和方向，获得增效蛋白基因整合载体pLTVl-En ； (3)苏云金杆菌感受态细胞的制备及整合载体的转化:LB液体培养基接种苏云金杆菌活化，以LB+0.5M山梨醇为培养基转接培养制备苏云金杆菌感受态细胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pLTVl-En，电击法将整合载体pLTVl-En转化至苏云金杆菌感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子，获得转化子Bt-En-1 ； (4)转化子的高温转接和筛选:将转化子Bt-En-1接种于LB培养液中，40_50°C培养并转接5-7次后涂氨苄青霉素LB平板产生单菌落，分别点种在氨苄青霉素单抗平板和无抗平板的对应位置，置28-30°C培养48h后，挑选无抗培养基中失去抗性的单菌落，显微镜镜检是否产生伴胞晶体蛋白， 再通过提取质粒和PCR扩增，最后得到染色体重组增效蛋白苏云金杆菌工程菌Bt-En。
3.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(I)中所述提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En的方法为:碱裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，设计上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAAGTG ATT GTA CCC GC T-3，，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TATCAT T -3’，引入!,Xho I两个酶切位点，PCR扩增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR扩增的反应条件:先94 °C预变性4 min，然后依次94 °C变性30 sec,56 °C复性30 sec,72 °〇延伸3 min, 30个循环；最后72 °C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。
4.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(2)中所述以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因为:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，设计上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位点，PCR 扩增增效蛋白基因，PCR扩增反应条件:先95 °C预变性5 min，然后依次97 °C变性30 sec,55°C复性30 sec,72 °C延伸3 min，35个循环；最后72 °C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。
5.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(2)中所述以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，酶切线性化连接增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO的方法为:以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化后与所述扩增增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反应15min，将增效蛋白基因连接到整合载体pLTVl Saml酶切位点上，CaCl2法到转化大肠杆菌感受态细胞ToplO。
6.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(3)中所述ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pLTVl-En的方法为:ToplO-3菌株氨苄青霉素LB培养液培养，小量质粒提取法提取增效蛋白基因整合载体PLTVl-En0
7.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(3)中所述电击法采用BIO-RAD电击仪电击转化，电击条件为20KV/cm。
8.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(4)中所述转接参数为:1次/12 h，100-120代。
9.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤(4)中所述PCR扩增反应条件为:先94 °C预变性4 min，然后依次94 °C变性30 sec,56 °C复性30 sec,72 °C延伸3 min，30个循环；最后72 °C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。
全文摘要
本发明公开了一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法以转属主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-1将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因，从而构建稳定表达增效蛋白基因、无抗性标记基因的增效Bt工程菌。本发明利用增效蛋白基因构建增效基因，在Bt毒蛋白(ICPs)正常使用浓度下，通过增效蛋白的协同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，从而增强防效，产品毒力强、杀虫谱宽、杀虫速度快，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。
文档编号C12N15/63GK103205392SQ20131013298
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者徐健, 韩光杰, 赵松, 刘琴, 李传明, 马谈斌 申请人:江苏里下河地区农业科学研究所