专利名称：一种醇脱氢酶在催化生成(r)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种醇脱氢酶的应用，尤其涉及一种醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)在以4_氯乙酰乙酸乙酯为底物不对称还原反应生产0 ) -4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
背景技术：
(R) -4-氯-3 轻基丁 酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3_hydroxybutanoate,(TP)-CHBE)是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如(-)_大内酰亚胺A ((-)-macro I act in A)、L_ 肉喊(L-carnitine)和 R-Y-氨基-β -轻基丁酸(GABOB)的关键手性中间体[1，2]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(ZP)-CHBE是非常经济有效的制备途径。迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括起来主要有化学法和生物法。化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂贵的铑、釕等金属，采用化学法合成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗能闻，污染大[3]。微生物法分为酶催化和全细胞催化法，全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为 (TP)-CHBE两种。许多微生物都能还原C0BE，但绝大多数微生物的还原产物是S构型的，只有少数微生物能获得R型还原产物，如赭色掷孢酵母{Sporobolomyces salmonicolor)、麦芽糖假丝酵母{Candida maltose)、卡斯太拉德巴利酵母 Webaryomyces castellii)及掷抱圆酵母{Torulaspora nagoyaensis)等，但产物的手性选择性即对映体过量(ee)值只有8% 63%[4’5]。采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的0 )-CHBE。HiroakiYamamoto等[6]将来自于Candida parapsi1sis醇脱氧酶基因在大肠杆菌i .coli W3110中表达，重组菌在水相体系中催化COBE不对称还原(辅底物为2-propanol)，得到产物0 )-CHBE,光学纯度 99% e.e。Kataoka.M 等醒基还原酶基因{束这 Sporobolomycessalmonicolor)和葡萄糖脱氢酶基因i^^Bacillus megateriuni)在大肠杆菌中共表达将此转化菌株的细胞用于在水/乙酸正丁酯两相体系中催化COBE的不对称还原。在定期添加辅酶NADP、葡萄糖和底物以及控制pH值的条件下，得到在有机相中的产物0 )-CHBE浓度为268 g/L，摩尔转化率和产物的光学纯度分别为94.1%和91.7% e.e.。综上所述，现有催化COBE为0 ) -CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性低、成本高等问题。
本专利中涉及到的还原酶是醇脱氢酶,其包含336个氨基酸，其在Genbank中的收录号为 EEQ43320.1 (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/protein/EEQ43320.1 )，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。编码该蛋白的基因含有1011 bp碱基，其在Genbank中的收录号为 KC236900, (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/KC236900 )其基因序列如 SEQ IDNO:1所示。至今未发现该醇脱氢酶用于COBE不对称还原制备(TP)-CHBE的报道。参考文献:
[1]Yan Q Ni, Jian-He Xu.Biocatalytic ketone reduction: A green andefficient access to enantiopure alcohols.Biotechnol Adv (2011)
[2]Ying Liu, Zhinan Xu.Asymmetric reduction of ethyl4-chloro-3_oxobutanoate to ethyl (7 )-4-chloro-3-hydroxybutanoate with twoco-existing, recombinant Escherichia
coli strains.Biotechnology Letters (2005) 27: 119 - 125
[3]Zhou Y -G, Tang ff, Wang ff-B ， Li ff, Zhang X.J A m Chem Soc ， 2002 ，124 (18): 4952
[4]ShimizuS, Kataoka M, Kita K.J Mol Catal B, 1998， 5 (124): 321
[5]Kita K, Kataoka M, ShimizuS.J Biosci Bioeng, 1999, 88(6): 591
[6]Hiroaki Yamamoto , Akinobu Matsuyama , Yoshinori Kobayash1.Synthesisof ethyl (/ )-4-chloro-3_hydroxybutanoate with Recombinant Escheri chi a coliCell, 2002 ,66 (2), 481-48
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种醇脱氢酶在COBE不对称还原制备(7 ) -CHBE中的应用。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
一种氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脱氢酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯((TP)-CHBE)中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脱氢酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，不对称还原制备0 )-4-氯-3羟基丁酸乙酯。具体反应是将表达基因序列如SEQ ID NO:1所示的重组菌,25 50g/L的4_氯乙酰乙酸乙酯，在pH6.0 7.5、20-30°C、18(T280rpm条件下，与200mmol/L 2mol/L异丙醇，反应16 20h，得到0 )-4-氯-3羟基丁酸乙酯。其中，加入异丙醇可生成NADH，且使反应循环进行，降低了加入量以减少了生产成本。发明人运用现代生物信息学工具，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段从白色念珠菌Candida克隆醇脱氢酶的基因,在大肠杆菌中表达后发现其在水相中能够高效的催化COBE为0 ) -CHBE, e.e值为100%。同时，通过在水相和水/有机相中反应、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和产物对细胞和酶的抑制作用，显著的提高了转化效果。通过对醇脱氢酶的基因进行重组表达，获得了具有新型催化功能的酶蛋白，开发了该条基因的新功能——催化非天然底物COBE为高立体选择性的0 )-CHBE。有益效果:本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脱氢酶应用于COBE不对称还原制备0 ) -CHBE中，取得很好的效果，其酶活高达5.6U/mg。氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的醇脱氢酶对底物COBE的得率高(大于90%)、产物CHBE的光学活性高(e.e%为100%)，且产量高，大大降低了生产成本。
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图1为醇脱氢酶基因的构建图。
具体实施方式
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根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:重组大肠杆菌万.Rosetta (pET_22b_CA)
1、醇脱氢酶基因的获取
白色念珠菌 Candida albicansiMi^ Centraalbureauvoor Schimmelcultures (CBS)Fungal Biodiversiry Centre),培养基 YPD (g.L4):酵母提取物 IOg,蛋白胨 20g,葡萄糖20g，补蒸馏水至1L。将白色念珠菌Candida albicans接种于5mL YPD液体培养基中30 V培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试剂盒，⑶2415 Yeast gDNA Kit)提取基因组。构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下:
上游引物(CA-sense 含 NdeI)为:5’- GGAATTC CATATGTCAATTCCATCTACTCAGTACG -3’ 下游引物(CA-anti 含 BamHI)为:5’- CGC GGATCCTTATGGATTAAACACGACTCTTCCT -3’ 所有引物均由美吉生物公司合成。基因的PCR条件:
94 °C变性7 min，按如下参数循环30次:94 °C变性I min，60 °C退火50 s，72 °〇延伸 1.5 min。最后 72 °C延伸 10 min。2、表达载体的构建
用Nde I及BamH I分别酶切pET_22b (pET_22b购于Novagen (默克中国))及所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-22b与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10 uL的连接产物pET-22b-CA加入IOOuL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30 min, 42 °C热激90sec。冰上放置2min。加入预热的0.45mL LB。220 rpm 37°C Ih0将200 uL菌液加入分另IJ含有100 μ g/mL的氨苄青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB平板上，37°C过夜培养12-16，得到重组菌疋co7i Rosseta (含pET_22b_CADH)。构建图谱见图1。3、酶活的测定
挑取重组菌疋co7i Rosseta (pET_22b_CA)及出发大肠杆菌Rosseta (DE3)至含100 μ g/mL氨苄青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。然后按2 %接种量分别接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB新鲜培养基中，37 °C培养至OD6tltl约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8 mmol.Γ1，25°C，220rpm，诱导表达10 h后，离心(4°C，5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸纳缓冲(pH7.0)重悬，超声破碎细胞(功率300W,超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4°C，12000rpm, 15min)，测定上清中的酶活。酶反应体系包括IOOmM 磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM NADH, 20mM COBE, 30°C，340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化lymol NADH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，出发大肠杆菌Rosseta (DE3)的比酶活为0.12U/mg protein,而重组菌E.coli Rosseta (pET22b_CA)的比酶活为 5.6U/mg protein。实施例2:重组大肠杆菌厶coli Rosseta (pET22b_CA)的发酵
挑取重组菌万.co7i Rosseta (pET_22b_CA)至含抗生素的LB培养液，37°C振荡培养过夜。然后按2 %接种量分别接种到新鲜培养液中，37 1:培养至00_约为0.6时，加入1 丁6至终浓度 0.8 mmol.171, 25°C, 220rpm,诱导表达 10 h 后，8000 rpm, 4 °C离心 10 min,弃上清，沉淀备用。实施例3:
取实施例2的沉淀用磷酸钠缓冲(100 mmol -L-1, pH 6.5)洗涤两次，称取2g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于总体系25 mL的反应液中(pH 6.5磷酸钾缓冲与醋酸丁酯体积比为 1:1)。加入异丙醇 150mmol/L，C0BE 25g/L，30°C，180rpm，12h。产物 0 )_CHBE 的产量为20.5 g/L，产物的得率为:82%，光学纯度e.e%为100%。产物的检测方法如下(以下实施例中产物的检测方法和实施例3相同):
对于水相反应:反应结束后，8000 rpm尚;L.、10 min分尚有机层和水层。小;L.、吸取上
层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。对于水/有机两相反应:反应结束`后8000 rpm离心10 min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，保存测样。检测产物旋光性的样品处理(乙酰化):取5-10 ul样品，加入乙酸酐0.2 mL，无水吡啶0.lmL，密闭条件下沸水浴中保持I h，冷却至室温，加入I mL乙酸乙酯，用水洗涤两次(每次I mL)，然后用同样体积的饱和食盐水洗涤两次，分出有机层用无水硫酸钠干燥过夜。
测定COBE和CHB浓度以及产物的旋光性都使用气相7820A (Agi Ient)进行检测。测定 COBE 和 CHB 浓度，色谱柱为 PEG-20M 毛细管柱(HP-FFAP ; 30m X 0.32mm X 0.25mm ；Agilent)，检测器FID温度220°C，汽化室温度220°C，柱温130°C。对产物的旋光性进行分析，色谱柱CP-Chirasil-Dex CB (25m*25mm*25um ;Aglilent)，检测器FID温度 250°C，汽化室温度250°C，柱温120°C，R型和S型CHBE的出峰时间分别为:16.813min和17.413min。实施例4:
取实施例2的沉淀用磷酸钠缓冲(100 mmol.L-1, pH 6.5)洗涤两次，称取5g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于总体系25 mL的反应液中(pH 6.5磷酸钾缓冲)。加入异丙醇150mmol/L, COBE 25g/L，30°C，180rpm，12h。产物 0 )-CHBE 的产量为 23.5 g/L，产物的得率为:94%，光学纯度e.e%为100%。实施例5:
取实施例2的沉淀用磷酸钠缓冲(100 mmol.L_S pH 6.5)洗涤两次，称取5g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于总体系25 mL的反应液中(pH 6.5磷酸钾缓冲与醋酸丁酯体积比为 1:1)。加入异丙醇 300mmol/L，C0BE 50g/L，30°C，180rpm，12h。产物 0 )_CHBE 的产量为37.2g/L，产物的得率为:74.3%，光学纯度e.e%为100%。
实施例6:
取实施例4的沉淀用磷酸钠缓冲(100 mmol -L-1, pH 7.0)洗涤两次，称取2g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15 mL的pH 7.0磷酸钠缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s,间歇 5s,共 5min),加入葡萄糖 500mmol/L, COBE 50g/L(0h、2h、4h、6h、IOh 各 10g/L )，GDH 200U，NAD 0.lmmol/L，25°C，220rpm，16h。产物 0 )-CHBE 的产量为 46.5g/L，产物的得率为:93%，光学纯度e.e%为100%。实施例7:
取实施例4的沉淀用磷酸钠缓冲(100 mmol -L-1, pH 7.0)洗涤两次，称取2g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15 mL的pH 7.0磷酸钠缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇 5s，共 5min)，加入甲酸钠 500mmol/L, COBE 50g/L (0、2、4、6、IOh 各 10g/L )，FDH200U，NAD 0.lmmol/L, 25°C,220rpm, 16 h。产物(TP)-CHBE 的产量为 43.8g/L，产物的得率为:87.6%,光学纯度e.e%为100%。
权利要求
1.一种醇脱氢酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备0 )-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脱氢酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备0 )-4_氯-3羟基丁酸乙酯。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以氨基酸序列如SEQID NO:2所示的醇脱氢酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，醇脱氢酶的酶活为5.6U/mgprotein。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于表达基因序列如SEQID NO:1所示的重组菌，与200mmol/L 300mmol/L异丙醇、1.5 50g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯，在pH6.0 7.5、2(T30°C、18( T280rpm条件下反应16 20h，得到0 )_4_氯-3羟基丁酸乙酯。
全文摘要
本发明公开了一种氨基酸序列如SEQIDNO2所示的醇脱氢酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。即以氨基酸序列如SEQIDNO2所示的醇脱氢酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。本发明首次将氨基酸序列如SEQIDNO2所示的醇脱氢酶应用于4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高达5.6U/mg，其对底物的得率高达94%、产物的对映体过量值为100％，且产量高，大大降低了生产成本。
文档编号C12R1/19GK103160547SQ201310132479
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者严明, 许琳, 顾金海, 郝宁, 李艳, 魏淼 申请人:南京工业大学