专利名称：一种新的卵巢癌细胞株trp14-a2780及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的卵巢癌细胞株TRP14-A2780，通过脂质体的转导和稳筛，在该细胞株中实现了对TRP14基因的稳定高表达。
背景技术：
卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤，根据美国国家健康统计中心2 012年公布的数据，美国卵巢癌总的5年生存率为4 4 %，其中晚期病例仅为27 % (Siegel R，Naishadham Dj Jemal A.Cancer statistics, 2012.CA Cancer JClin.2012Jan;62(1):10-29.)。目前卵巢癌的主要治疗方式为肿瘤细胞减灭术和以钼类、紫杉醇为一线药物的联合化疗。大多数患者在治疗后2 3年内复发，几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药(Agarwal Rj Kaye SB.0varian cancer:strategies for overcomingresistance to chemotherapy.Nat Rev Cancer2003; 3:502-16.)，导致卵巢癌高致死率的主要原因是由于多数患者在首次就诊时已经处于肿瘤的晚期以及初次治疗后复发、耐药。因此研究卵巢癌化疗耐药的机制对改善卵巢癌患者的远期疗效具有重要意义。紫杉醇是一种促微管聚合和稳定，抗有丝分裂的细胞周期特异性药物。研究表明，与紫杉醇耐药相关的机制主要包括:P-糖蛋白等药物泵出蛋白表达增加，微管动态变化和tubulin同型分子表达改变，微管相关和细胞骨架调节相关蛋白阻碍紫杉醇和微管结合，纺锤体检查点蛋白BubRl及凋亡相关分子改变等(Kavallaris M.Microtubules andresistance to tubulin-binding agents.Nat Rev Cancer.2010Mar;10(3):194-204.X但根据已有报道，各种针对这些靶点的阻遏方法仅能部分逆转卵巢癌耐药，事实上迄今尚没有一种基于上述机制建立的逆转耐药方法应用于临床。卵巢癌耐药的关键机制尚有待阐明。申请人:在前期研·究中，通过药物浓度逐渐递增的紫杉醇的持续、长期作用，成功建立了紫杉醇耐药的卵巢癌细胞亚系SK0V3-TR30，其耐药指数较亲代SK0V3细胞增加27 倍(Fu Y, Ye D,Chen H.et al.Weakened spindle checkpoint with reduced BubRlexpression in pacIitaxe1-resistant ovarian carcinoma cell line SK0V3-TR30.Gynecol Oncol.2007Apr; 105 (I):66-73.)。研究显示紫杉醇耐药的细胞株与其亲代细胞相t匕，除了耐药性增加之外，其他多种表型也可发生改变。为了进一步研究耐药细胞和亲代细胞间差异表达的蛋白，我们采用LC-MS/MS-based label-free定量蛋白质组学技术进行筛选，共发现356个差异蛋白，涉及细胞代谢、生化过程调控、物质运输、组织发生、细胞分化、死亡和信号转导等多个方面。其中部分差异蛋白可能参与了卵巢癌侵袭转移和细胞增殖、死亡等其他生物学行为的调控。进一步通过定量RT-PCR和Western Blot验证我们发现硫氧还蛋白相关蛋白14 (TRP14)在耐药细胞中表达显著上调。TRP14是一种广泛表达的可溶性的胞浆蛋白，最早从Hela细胞cDNA文库中成功克隆，相对分子质量为14KD，属于Trx蛋白家族新发现的一种二硫还原酶。但目前对于TRP14的功能所知甚少。仅有的研究提示TRP14参与肿瘤坏死因子α (TNF-α)信号途径的调控。采用RNA干扰部分下调TRP14的表达，可导致Hela细胞TNF-α诱导的核因子κΒ(NF-K B)活化，丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)途径激活，和细胞凋亡增加(Jeong WJ, ChangTS, Boja ES,et al.Roles of TRP14, a thioredoxin-related protein in tumor necrosisfactor-alpha signaling pathways.J Biol Chem, 2004，279 (5): 3151-3159.)。虽然 TRP14对TNF-α的效应具有调控作用，但TRP14是否可改变卵巢癌细胞的化疗耐药性，目前未有报道。但一般瞬时质粒转染的短效性，在研究中需要多次转染，这无疑增加了人力投入及研究成本。构建该稳转细胞株可以直接用于检测实验研究中的指标，可避免多次重复转染，简化实验操作，节约实验时间和成本。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的卵巢癌细胞株，该卵巢癌细胞株可直接用于研究中各项相关指标的检测，省时省力。本发明的第二个目的是提供上述卵巢癌细胞株的建立方法。本发明的第三个目的是提供上述卵巢癌细胞株的应用。为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下技术方案:一种新的卵巢癌细胞株，该卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC C201339。为了试验上述第二个目的，本发明采用以下的技术方案:一种如所述的卵巢癌细胞株的建立方法，该方法包括以下步骤:I)合成可以有效高表达TRP14的质粒。2)转染卵巢癌A2780细胞，通过抗生素筛选获得稳转细胞。载体选用GV141载体，即合成可以有效高表达TRP14的质粒的时候选用GV141载体。所述抗生素为G418抗生素。为了实现上述第三个目的，本发明采用了以下的技术方案:上述的卵巢癌细胞株TRP14-A2780用于作为卵巢癌紫杉醇耐药机制的探讨及相关信号通路的研究的细胞模型。本发明的有益效果是:通过脂质体瞬转的方法，将TRP14高表达的质粒转导入卵巢癌A2780细胞中，经过G418抗生素稳转筛选以及单克隆的挑选及验证，从而建立了 TRP14稳定高表达的细胞株TRP14-A2780。本发明的细胞株可为研究卵巢癌紫杉醇化疗耐药机制的进一步深入研究搭建了一个良好的基础。
图1为质粒抽提，质粒电泳图。图2为双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定图。图3为质粒测序图 图4为实验组、阴性对照组提取RNA，通过Realtime PCR方法检测TRP14基因mRNA水平的表达图。图5为实验组、 阴性对照组提取蛋白质,通过Western blot方法检测TRP14基因蛋白水平的表达图。
保藏说明卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏号为=CCTCC C201339，保藏日为:2013年4月10日。
具体实施例方式一、TRP14过表达质粒构建TRP14过表达质粒是GV141，插入的序列如SEQ ID NO:1所示。阳性克隆PCR鉴定。引物序列是:
权利要求
1.一种新的卵巢癌细胞株TRP14-A2780，其特征在于该卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201339。
2.一种如权利要求I所述的卵巢癌细胞株TRP14-A2780的建立方法，其特征在于该方法包括以下步骤 1)合成有效高表达TRP14的质粒； 2)转染卵巢癌A2780细胞，通过抗生素筛选获得稳转细胞。
3.根据权利要求2所述的一种卵巢癌细胞株TRP14-A2780的建立方法，其特征在于载体选用GV141载体。
4.根据权利要求2或3所述的一种卵巢癌细胞株TRP14-A2780的建立方法，其特征在于所述抗生素为G418抗生素。
5.如权利要求I所述的卵巢癌细胞株TRP14-A2780用于作为卵巢癌紫杉醇化疗耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型。
全文摘要
本发明公开了一种新的卵巢癌细胞株，该卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201339。本发明的有益效果是通过脂质体瞬转的方法，将TRP14高表达的质粒转导入卵巢癌A2780细胞中，经过G418抗生素稳转筛选以及单克隆的挑选及验证，从而建立了TRP14稳定高表达的细胞株TRP14-A2780。本发明的细胞株可为研究卵巢癌紫杉醇化疗耐药机制的进一步深入研究搭建了一个良好的基础。
文档编号C12N5/10GK103255107SQ201310132528
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者谢幸, 傅志勤, 张松法, 吕卫国, 程晓东, 王新宇 申请人:谢幸, 浙江大学医学院附属妇产科医院