一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其中包括如下特征:来自于癌症患者外周血来源分离得到的单个核细胞，在使用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和CD 122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2作用下扩增激活，获得自然杀伤细胞；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞的试剂盒，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。
【背景技术】
[0002]自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK)数量和功能异常与肿瘤和持续性病毒感染的发生密切相关。目前NK细胞在体外加白介素2(interleukin-2，IL-2)培养扩增后，其抗肿瘤作用比LAK细胞强50-100倍，而且只需要小量的IL-2就可以发挥作用，并且因其对自身肿瘤靶细胞具有特异性，成为国内外肿瘤生物研宄的热点，并在临床治疗中得到使用。
[0003]NK细胞主要表达⑶16+、⑶56+表型，治疗对黑色素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细胞有限和培养时间过长。NK细胞体外扩增至5 X 18平均需59天，扩增至5X 19则平均需80天，NK在含IL-2的培养基中经过一段时间培养后出现选择性扩增T淋巴细胞，⑶3+占80%以上，⑶4 +和⑶8 +占50%以上，NK细胞扩增低下，占不到10%左右。因而传统使用的小剂量白介素2激活生长倍数有限，端粒酶活性降低，培养时间过长引起了 NK细胞杀伤功能低下。
[0004]本发明提供了以3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122转染并稳定表达的K562细胞为滋养层细胞，在小剂量IL-2作用下大量扩增NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞杀瘤活性在21天达到最佳，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术增殖培养NK细胞的不足，特别是因NK细胞扩增到临床治疗需要的细胞数量而培养时间过长，含IL-2的培养基选择性扩增T淋巴细胞以及NK细胞占有比例很低，因而产生的杀瘤活性低下。本发明通过前期研宄实验发现转染了 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1(3' -phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)和 CD122 并稳定表达的K562细胞，作为滋养层细胞和低剂量IL-2作用下培养NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3 X 19以上足以满足临床抗肿瘤的作用，保证癌症患者临床治疗疗效。
[0006]K562细胞转染了 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的表达载体，细胞膜上可稳定表达I3DKl和⑶122的多肽。I3DKl为AGC蛋白激酶家族的主要调节器，研宄发现TOKl是NK细胞早期发育关键分子，激活了白介素15表达升高，也活化了 CD122分子表达提高，使得NK细胞能够在不受外界“致敏”的情况下自发杀死机体中异常的细胞。因而应用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和CD122转染并稳定表达的K562细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可以促进NK细胞发育和大量增殖，抑制NK细胞中T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。
[0007]本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用roKi和CD 122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖。
[0008]本发明所述的K562细胞系转染稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的TOKl和⑶122多肽，K562细胞经培养增殖后仍稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122。经培养后的K562细胞膜上具有表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。
[0009]本发明所述方法中单个核细胞来源于癌症患者采集的外周血或骨髓等，经淋巴细胞分离液，连续密度梯度离心获得的。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
[0010]本发明所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的K562细胞与自然杀伤细胞首先共培养5天，所述K562细胞与单个核细胞的用量比例为K562细胞数:单个核细胞数=I: 0.1-1: 10，更优选地，为K562细胞数:单个核细胞数=I: 1-1: 5。
[0011]共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充10_20mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL白介素2)，在37°C、5% CO2培养箱中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL白介素2)，在37°C、5% CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到18-21天，使得细胞数达到3 X 19以上。
[0012]本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增殖倍数达2500倍以上，培养到21天自然杀伤细胞数达3 X 19以上。
[0013]本发明所述方法中培养获得自然杀伤细胞，高表达其特异标志物⑶16+/⑶56+，阳性率高于90%以上，而⑶3+阳性率低于7%以下。
[0014]本发明所述方法中培养获得自然杀伤细胞，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0015]本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入50-2000活性单位/mL白介素2和10% (体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如CellGro SCGM、A頂-V、X-VIVO和GT-T551等，含有1000活性单位/mL白介素2。
[0016]本发明还提供了一种制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0017](I)经强酸，强碱和/或辐照处理的稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和CD 122 的 K562 细胞；
[0018](2)白介素 2;
[0019](3)淋巴细胞培养基；
[0020](4)组织消化液；
[0021](5)淋巴细胞分离液；
[0022](6)生理盐水；
[0023](7)使用说明书；
[0024]其中，所述使用说明书包括权利要求1-6所述的方法。
[0025]所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的K562细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后含稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的K562滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。
[0026]本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备NK细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。
【附图说明】
[0027]图1表示为实施例二体外培养的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞数变化曲线图；
[0028]图2表示为实施例二体外培养的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞增殖倍数变化曲线图；
[0029]图3表示为实施例二制备的晚期乳腺癌患者NK细胞流式细胞检测结果图；
[0030]图4表示为实施例二制备的正常人NK细胞流式细胞检测结果图；
[0031]图5表示为实施例二制备的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞对MCF-7的杀伤毒性曲线图；
[0032]图6表示为实施例二制备的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞对H印G2的杀伤毒性曲线图；
[0033]图7表示为荷乳腺癌MCF-7小鼠模型实施例二制备的NK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线图。
【具体实施方式】
[0034]本发明发现通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122转染并稳定表达的K562细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可以促进NK细胞大量增殖，抑制NK细胞中T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。NK细胞培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3 X 19以上满足临床治疗需要，可用于多次抗肿瘤的临床应用。
[0035]对本发明涉及的一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法进行具体说明。本发明涉及采用I3DKl和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使得NK细胞大量扩增，获得具有抗肿瘤作用的NK细胞。
[0036]本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用I3DKl和CD 122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖。
[0037]本发明所述的K562细胞系转染稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶I和⑶122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的TOKl和⑶122