一种用于培养间充质干细胞的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞与组织培养领域，特别是一种用于培养间充质干细胞的培养基。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells (MSC)，是指单个或一群符合 国际统一标准的细胞（Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006 ;8 (4):315-7)〇
[0003] 在骨髓中，MSC属于非造血干细胞，具备向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力， 具有免疫调节和造血支持作用。最近的研宄表明，MSC也存在于其它组织，包括脂肪、脐带、 胎盘和肌肉等。体外培养的MSC可以分泌多种生物活性物质，具有促进新生血管形成，促进 神经组织、骨组织、肝脏组织和胰岛组织损伤修复的作用。
[0004] 因此，自体或异体MSC已经用于临床试验研宄，以治疗移植物抗宿主病、肝脏纤维 化、脊髓损伤、糖尿病、外周血管病等多种疾病。另外，作为组织工程化骨和软骨构建中重要 的种子细胞，MSC也用于股骨头坏死、骨折后骨不连和软骨损伤的治疗。
[0005] 然而，涉及多种疾病的细胞治疗需要一定的细胞量。为进行以MSC为基础的细胞 治疗，人们通常获取少量的骨髓，或获取脐带、脂肪或胎盘组织，在体外通过贴壁生长筛选 并扩增MSC，待细胞量达到治疗所需量时，收获MSC用于以上疾病的治疗，体外扩增MSC是实 施MSC细胞治疗的关键步骤之一。
[0006] 通常，人们利用经筛选、适于人MSC生长的牛血清，作为细胞增殖的主要刺激物， 体外培养扩增MSC。然而，研宄表明，在培养过程中，MSC可以吞噬培养体系中的牛蛋白，使 异种_+
[0007] 蛋白内在化，每IO8MSC中牛蛋白含量达到10_30mg (Spees几 ，Gregory CA, Singh H，Tucker HA, Peister A, Lynch PJ, Hsu SC, Smith J, Prockop DJ. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Mol Ther 2004;9:747-56)。
[0008] 因此，使用牛血清培养人MSC用于细胞治疗，不仅将使病人暴露于罹患人畜共患 病的风险，也可能因移植MSC死亡释放牛蛋白，引起机体免疫反应，造成血清病或其它免疫 性疾病。
[0009] 此外，每批次血清的活性是不同的，对批次间收获的细胞的稳定性，有一定影响。 因此，利用一种无动物血清成分的培养基，培养扩增MSC，对治疗的安全性和有效性，都是十 分必要的。
[0010] 为此，人们一直在寻找动物血清替代物，用于人MSC的培养。
[0011] 有人用血清替代物Ultroser G替代牛血清，培养人骨髓MSC，获得了较好的效 果(Meuleman N, Tondreau T,Delforge A, Dejeneffe M, Massy M, Libertalis M, Bron Dj Lagneaux L. Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical alpha-MEM medium. Eur J Haematol 2006 ； 76:309 - 16)〇
[0012] 然而，Ultroser G本身就含有牛血清成分，这种方式的替代并不能从根本上 角军决异体蛋白污染问题（Korhonen M. Culture of human mesenchymal stem cells in serum-free conditions:no breakthroughs yet. Eur J Haematol 2006 ;78:167)〇
[0013] 之后，有人提出应用人血小板浓缩液替代牛血清，并获得了较好的效果。但是，血 小板供者是否完全正常，这种使用方式能否引起传染病的传播，以及能否保障所获得MSC 的批次间稳定性等，都是必须考虑的问题。
[0014] 因此，研制化学成分清晰明确、无动物血清成分的MSC培养基，是很有必要的。
[0015] 有人曾报道一种人脐带血MSC的无血清体系，血清替代成分为碱性成纤维细胞生 长因子（bFGF)、人白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSE)和氢化可的松，可简称为 FAITH，据报道效果较好（Liu CH, Wu ML, Hwang SM. Optimization of serum free medium for cord blood mesenchymal stem cells. Biochemical Engineering Journal, 2007 ； 331 - 9)〇
[0016] 然而，利用该体系进行人脐带MSC培养，发现细胞呈球形生长方式（见图I);而 且，随着培养时间的延长，细胞出现自发分化现象，细胞的本质发生了变化。这可能与加 入高浓度的氢化考的松有关。皮质类激素，包括地塞米松和氢化考的松，在一定浓度下虽 然能刺激MSC增殖，也能使MSC发生非特异性分化（Williams JT，Southerland SS，Souza J,Calcutt AF, Cartledge RG. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Am Surg. 1999 ； 65:22-6)。因此可以认为，以bFGF-ITSE和氢化可的松等为主的血清替代物进行MSC培养， 其本身的稳定性和对干细胞多能性的维持，可能存在诸多不肯定的因素。
【发明内容】
[0017] 针对现有的牛血清培养基及人血清培养培养间充质干细胞存在的问题，本发明 的目的是提供一种无血清、化学成分清晰的适用于培养间充质干细胞的培养基。
[0018] 其解决问题的技术方案是：
[0019] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0020] 所述的培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生 素类物质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0021] 上述培养基中每类物质组成特点描述如下：
[0022] (1)基础培养基頂DM，是在商售頂DM基础上，添加至少包括生物素（1-50 μ M) 和谷氨酰胺（l-50yM)在内的水溶性化合物；所述水溶性化合物还可包括氯化铬 (0· 1-10 μ g/L)、硫酸铜（0· 1-lmg/L)、氯化猛 0· 01-0. lmg/L 和硫酸锌 0· l-10mg/L。进行改 良后间充质干细胞增殖速度增加。
[0023] (2)所述细胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，I-IOOng/ mL)和表皮生长因子（EGF，l-100ng/mL)，还可包括激活素 A(activin A，l-100ng/ml)、转 化生长因子-MTGF-β，l-100ng/mL)、骨形成蛋白（BMP，l-100ng/mL)、白血病抑制因子 (LIF，Ι-lOOng/mL)、干细胞生长因子（SCF，Ι-lOOng/mL)、肝细胞生长因子（HGF，I-IOOng/ mL)、胰岛素样生长因子-I (IGF-1，Ι-lOOng/mL)、促红细胞生成素（EP0,0. l-50U/mL)、血清 素（l-100nM/L)、血小板源生长因子 BB(PDGF-BB，l-100ng/mL)、白介素-6(IL-6,1-IOOng/ mL)。这些细胞因子和生长因子，是始动间充质干细胞增殖的重要组成部分。
[0024] (3)所述胰岛素添加量为5-500 μ g/mL，可为临床级用药或重组蛋白。
[0025] 胰岛素参与细胞糖代谢。
[0026] (4)所述微量元素至少包括硒（IO-IOOnM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提 供，所述微量元素组合还可包括氯化铬（〇.1-1(^8/1)、氯化铜（0.1-1 11^/1)、氯化锰 0· 01-0. lmg/L、氯化锌 0· 1-10 μ g/L 以及钼酸钠（100-1000ng/mL)。
[0027] 微量元素不但促进细胞增殖，也是细胞结构组成必要的成分。
[0028] (5)所述脂类物质可为胆固醇（10-100 μ g/mL)，还可为亚油酸（l-50mg/L)、亚麻 酸（1-50 μ g/mL)、中链甘油三酯（1-500 μ g/mL)、卵磷脂（0· 1 - 20 μ g/mL)和注射用大豆 油（1-500 μ g/mL)〇
[0029] 脂类是细胞膜结构的主要成分。
[0030] (6)所述维生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种，包括维生素 B组如 Vit-B