一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿 瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发 生。
[0003] NK细胞是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞。活化 的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的 作用。目前，NK细胞已经广泛运用于临床进行肿瘤患者的治疗，同时，NK细胞治疗对病毒或 细菌感染、免疫调节相关疾病以及抗衰老也有一定的疗效。
[0004] 目前，体外促进NK细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养， 也有研宄者将K562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激NK细 胞的生长。上述方法虽然能够刺激NK细胞高效扩增，但是动物血清成分复杂，取材过程中 有可能带入支原体、病毒，对NK细胞培养造成不确定性以及不安全性；K562本身作为一个 肿瘤细胞，在临床安全性方面存在很大的质疑，不适用于临床NK细胞治疗。
[0005] 因此，进一步开发安全且能保证NK细胞增殖速度和肿瘤细胞的杀伤效果的培养 基十分必要。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，本发 明提供的NK细胞培养基安全，采用其培养的NK细胞快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好 的杀伤活力。
[0007] 本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：
[0008] 无血清基础培养基 83~93重量份； 血浆 4~6重量份； 白细胞介素-2 0.5~1.5重量份；
[0009] 抗CD3单克隆抗体 0.5~L5重量份； 类胰岛素一号增长因子 1~5重量份； 和柏杞多糖 1~3重量份。
[0010] 优选地，所述无血清基础培养基为无血清的RPMI 1640培养基。
[0011] 优选地，所述NK细胞培养基包括以下组分：
[0012] 无血清基础培养基 84~88重量份； 血浆 4.5~5重量份； 白细胞介素-2 0.8~1重量份； 抗CD3单克隆抗体 0.8~1重量份； 类胰岛素一号增长因子 2~3重量份； 和构杞多糖 1.5~2重量份。
[0013] 优选地，所述NK细胞培养基包括以下组分：
[0014] 无血清基础培养基 88重量份； 血浆 5重量份； 白细胞介素-2 1重量份； 抗CD3单克隆抗体 1重量份； 类胰岛素一号增长因子 3重量份； 和枸杞多糖 2重量份。
[0015] 本发明提供了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0016] 将NK细胞接种于上述技术方案所述的NK细胞培养基进行培养。
[0017] 优选地，所述NK细胞按照以下方法分离得到：
[0018] 将外周血进行分离，得到PBMC细胞；
[0019] 将所述PBMC细胞进行磁珠分选，得到NK细胞。
[0020] 优选地，所述培养的条件为37°C和体积浓度为5%的C02。
[0021] 优选地，所述培养的时间为13~15天。
[0022] 优选地，所述接种的细胞密度为4. 5 X IO5个/mL~5. 5 X 10 5个/mL。
[0023] 优选地，所述培养的过程中每3天补加上述技术方案所述的NK细胞培养基。
[0024] 本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：无血清基础培 养基83~93重量份；血浆4~6重量份；白细胞介素-2 0. 5~1. 5重量份；抗⑶3单克隆 抗体〇. 5~1. 5重量份；类胰岛素一号增长因子1~5重量份；和枸杞多糖1~3重量份。 本发明提供的NK细胞培养基安全性较好，在上述组分的培养基下培养的NK细胞快速稳定 增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：本发明提供的NK细胞培养基培 养NK细胞两周后，增殖倍数将近翻了 50倍；对K562的杀伤活性在40:1的效靶比时达到了 91%〇
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；
[0026] 图2为本发明实施例1培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图；
[0027] 图3为本发明实施例2制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；
[0028] 图4为本发明实施例2培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图；
[0029] 图5为本发明实施例3制备的NK细胞培养基培养NK细胞的增殖曲线图；
[0030] 图6为本发明实施例3培养的NK细胞对K562的杀伤活性曲线图。
【具体实施方式】
[0031] 本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括以下组分：
[0032] 无血清基础培养基 83~93重量份； 血浆 4~6重量份； 白细胞介素-2 0.5-1.5重量份； 抗CD3单克隆抗体 0.5~1.5重量份； 类胰岛素一号增长因子 1~5重量份； 枸杞多糖 1~3重量份。
[0033] 本发明提供了一种NK细胞培养基，以重量份数计，包括无血清基础培养基83~93 重量份，优选为88~88重量份。在本发明中，所述无血清基础培养基中无任何动物血清， 不会带入任何支原体和病毒。在本发明中，所述基础培养基优选为无血清的RPMI 1640培 养基、高糖DMEM和DMEM/F12中的一种或多种，更优选为无血清的RPMI 1640培养基。本发 明对无血清基础培养基的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的无血清基础培 养基即可，如可以采用其市售商品。
[0034] 本发明提供的NK细胞培养基包括血浆4~6重量份，优选为4. 5~5. 5重量份。 本发明对所述血浆的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的血浆即可，如可以 采用其市售商品。在本发明的某些实施例中，所述血浆优选按照以下方法制得：
[0035] 将外周血进行离心，过滤，得到血浆。
[0036] 本发明优选将外周血在800g下离心10min，得到上层液体。本发明优选将上层液 体再次在3000g下离心10min，然后过滤，得到血浆。
[0037] 本发明提供的NK细胞培养基包括白细胞介素-2 0.5~1.5重量份，优选为0.8~ 1重量份。白细胞介素-2 (IL-2)是由多细胞来源，主要由活化T细胞产生，又具有多向性作 用的细胞因子，主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化；白细胞介素-2对机体的免疫应答和抗 病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；白细胞 介素-2能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞 因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。本发明对所述白细 胞介素-2的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的白细胞介素_2即可，如可以 采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述白细胞介素-2购买于上海麦约尔生物技 术有限公司。
[0038] 本发明提供的NK细胞培养基包括抗⑶3单克隆抗体0. 5~1. 5重量份，优选为 〇. 8~1重量份。本发明对所述抗CD3单克隆抗体（0KT-3)的来源没有特殊的限制，采用本 领域技术人员熟知的抗CD3单克隆抗体即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实 施例中，所述抗CD3单克隆抗体购买于上海麦约尔生物技术有限公司。
[0039] 本发明提供的NK细胞培养基包括类胰岛素一号增长因子1~5重量份，优选为 2~3重量份。在本发明中，所述类胰岛素一号增长因子（IGF-I)是人体内肝细胞、肾细胞、 脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物，是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂， 同时对维持与细胞分化有关蛋白质水平具有重要作用，与一些生长因子何用能够促进细胞 分化成熟。本发明对所述类胰岛素一号增长因子的来源没有特殊的限制，采用本领域技术 人员熟知的类胰岛素一号增长因子即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例