分泌s100a9单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时还涉及由该杂交 瘤细胞株分泌产生的S100A9单克隆抗体，以及该单克隆抗体的应用，属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] S100A9是SlOO妈结合蛋白家族的一个重要成员，又称妈粒蛋白B(calgranulin B，CAGB)、骨髓相关蛋白 _14(myeloid related protein of molecular weight 14kDa， MRP-14)、迁移抑制因子相关蛋白 _14(migration inhibitory factor-related protein of molecular weight 14kDa，MRP-14)等。S100A9主要分布于脾脏、肺脏和皮肤等器官，表达 于嗜中性粒细胞、单核细胞、角化细胞等的胞浆和细胞外液中，是一种与炎症、创伤、肿瘤关 系密切的钙结合蛋白。S100A9结合Ca 2+、Zn2+、花生四烯酸、角蛋白中间丝、晚期糖基化终产 物受体（RAGE)、Toll-样受体4(TLR4)、基质金属蛋白酶（MMPs)等，具有细胞内、外调节活 性，参与炎症反应和肿瘤发展过程。
[0003] 近年来，研宄发现S100A9与多种疾病相关，例如其在肿瘤及炎症组织中呈高表 达，在急性和慢性炎症中扮演重要角色。S100A9蛋白的检测对研宄多种疾病的发生、发展、 治疗及预后均有指导意义，其潜在应用价值正逐渐突出，有可能成为这些疾病临床诊断的 新指标。目前，S100A9相关抗体药物的研发已成为国内外研宄的热点，例如开发在炎性疾 病或癌症位点（如前列腺癌、皮肤癌、动脉粥样硬化等）阻止S100A9和/或其活动的治疗 策略等。因此，获得表达量更多、亲和性更好、稀释度更高、特异性更好的S100A9单克隆抗 体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株对临床诊断和科学研宄具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种能稳定分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该 杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体滴度高、亲和性好、特异性强，单克隆抗体与S100A9 重组蛋白特异性结合，与钙结合蛋白S100家族的S100A8、S100A12和S100A13均无交叉反 应。
[0005] 同时，本发明还提供一种由上述杂交瘤细胞株分泌产生的S100A9单克隆抗体。
[0006] 最后，本发明还提供一种S100A9单克隆抗体的应用。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为杂交瘤细胞II D4B10,保藏编 号：CGMCC No. 10596,保藏日期：2015年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄 所。
[0009] S100A9单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞CGMCC No. 10596分泌产生。
[0010] S100A9单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将分泌S100A9单克隆抗体的杂交 瘤细胞CGMCC No. 10596接种至小鼠腹腔，采集腹水，提取（纯化）抗体，即得。
[0011] S100A9单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。编码重链可变区氨基酸 序列的DNA分子序列如SEQ ID NO. 3所示，编码轻链可变区氨基酸序列的DNA分子序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0012] S100A9单克隆抗体的应用，包括单克隆抗体在免疫组化检测中的应用，如检测人 乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌等癌症组织中S100A9蛋白的表达等。还包括利用单克隆抗 体的重链可变区序列和轻链可变区序列构建基因工程抗体。
[0013] 基因工程抗体，包含如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 本发明应用人外周血白细胞为免疫原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技 术，通过免疫细胞化学对杂交瘤细胞进行阳性筛选，应用免疫沉淀-质谱法对单克隆杂交 瘤细胞进行特异性鉴定，经Western Blot验证，获得一株能稳定分泌抗人S100A9蛋白的杂 交瘤细胞株，其名称为杂交瘤细胞II D4B10,保藏编号：CGMCC No. 10596,保藏日期：2015年 05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0016] 本发明采用动物体内诱生法制备单抗，亚型鉴定抗体为IgGl型，轻链为Kappa链。 采用Protein A亲和层析法对S100A9单抗进行纯化，SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯 度在95%以上，分子量大小符合鼠源抗体的特点。ELISA测定单抗的滴度均在1:10000以 上，抗体亲和常数Ka为3. 54X 108L/m〇L，亲和力较高，特异性鉴定中该单克隆抗体能够与 S100A9重组蛋白特异性结合，与钙结合蛋白S100家族S100A8、S100A12和S100A13均无交 叉反应。人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织石蜡切片经抗S100A9抗体免疫组化染色，可 于光镜下观察到胞浆内出现呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，免疫组 化结果表明该单克隆抗体能识别人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织中的S100A9蛋白。
[0017] 本发明中高效价、高纯度、较高亲和力和高特异性的S100A9单克隆抗体对细胞内 S100A9蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测，例如检测人乳腺癌、结肠 癌、肝细胞性肝癌组织中S100A9蛋白的表达。另外，本发明提供的鼠抗人S100A9单克隆抗 体的可变区序列能够为基因工程抗体的构建奠定基础。
[0018] 保藏证明和存活证明说明
[0019] 保藏菌株：杂交瘤细胞II D4B10,保藏编号：CGMCC No. 10596,保藏日期：2015年05 月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1中免疫细胞化学检测杂交瘤细胞培养上清抗体分泌；
[0021] 图2为实施例1中免疫沉淀获得与II D4B10细胞分泌抗体结合的抗原；
[0022] 图3为实施例1中Western Blot验证S100A9抗体性质；
[0023] 图4为实施例2中SDS-PAGE鉴定纯化后S100A9单克隆抗体的纯度及分子量；
[0024] 图5为试验例中ELISA法测定S100A9单克隆抗体滴度；
[0025] 图6为试验例中S100A9单克隆抗体交叉反应性分析；
[0026] 图7为试验例中S100A9单克隆抗体的亲和常数测定曲线图；
[0027] 图8为实施例3中免疫组织化学检测S100A9单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片 图；
[0028] 图9为实施例3中免疫组织化学检测S100A9单克隆抗体染色人结肠癌石蜡切片 图；
[0029] 图10为实施例3中免疫组织化学检测S100A9单克隆抗体染色人肝细胞性肝癌石 蜡切片图。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0031] 实施例1
[0032] 分泌小鼠抗人S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备，包括以下步骤：
[0033] 1、免疫原制备
[0034] 河南省红十字血液中心成分室取回的健康人外周血改良白膜法制备血小板过程 中的白膜（富含白细胞），用两倍体积的PBS稀释混匀，取15mL离心管加4mL淋巴细胞分离 液，将SmL稀释的血液缓慢平稳加于淋巴细胞分离液液面上，水平低温离心机（500X g，缓 升缓降，18°C )离心20min，收集环状乳白色层至新的离心管中，加 PBS离心洗涤2次，重悬 后台盼蓝染色计数并调整浓度，制备成细胞悬液；经流式细胞术检测，淋巴细胞约占50%， 单核细胞约占5 %，粒细胞约占10 % ;
[0035] 2、单抗的制备和纯化
[0036] (1)免疫动物
[0037] 选用7周龄（6~8周龄均可）雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行 四次免疫，首次免疫以约I X IO6个细胞、200 y L背部皮下分点注射，二次免疫（间隔三周） 以约I X IO6个细胞、200 μ L腹腔注射，三次、四次免疫均同二次免疫，采集每次免疫后小鼠 血清，用建立的免疫细胞化学法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合，融合前3天加强 免疫，以约IX IO7个细胞、300 y L腹腔注射，3天后取脾脏融合；
[0038] (2)细胞融合
[0039] 小鼠摘眼球取血收集血清，拉颈处死，无菌操作取出脾脏并研磨，制备脾细胞悬 液，将准备好的骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按1:9的比例混合（1:8~1:10均可），加 入促融合剂聚乙二醇1500,采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选；
[0040] 用免疫细胞化学方法检测杂交瘤细胞培养上清：制备白细胞悬液（含有淋巴细 胞、粒细胞、单核细胞等成分），以每孔IX IO5个细胞接种至96孔板中，无血清1640培养基 37°C培养2h，离心后吸取上清，甲醇：双氧水=100:1固定，弃上清，PBS-T(含0.05%的吐 温-20)洗4次，5%脱脂奶37°C封闭lh，PBS-T洗4次；加一抗：免疫后血清或细胞培养上 清100 μ L/孔，37 °C孵育Ih，弃上清，PBS-T洗4次；加二抗：100倍稀释的HRP标记的山羊抗 鼠 IgG，50 μ L/孔，37°C孵育lh，弃上清，PBS-T洗4次；AEC显色液室温避光显色IOmin (5~ 15min均可），倒置显微镜下观察并记录（见图1，AEC显色X 100,图中A为阳性对照，B为 阴性对照，C为阳性样品）；设加强免疫后血清阳性对照和未免疫血清阴性对照，选取强着 色阳性孔杂交瘤细胞扩大培养，经检测仍为阳性者予以冻存，并分批进行有限稀释法亚克 隆；
[0041] 经3次亚克隆后，为确定阳性单克隆细胞分泌抗体的性质，进行免疫沉淀-质谱 法鉴定，用NP40细胞裂解液裂解白细胞，每IO 7个细胞加入ImL裂解液，冰上裂解Ih后， (4°C，1000 OXg)离心20min，收集上清，BCA法测定蛋白质浓度，-20°C保存；将50 μ L 50% Protein G-Agarose 加入 I. 5mg (1 ~2mg 均可）裂解的蛋白中，4 °C 混合 30min，1000 r/ min，4°C离心3min，沉淀与Protein G非特异性结合的蛋白；收集上清至新的EP管中，加 200 以1^细胞培养上清，4°〇混合211，再加5(^1^?1'(^6丨116,4°〇混合211，（4°〇，10001·/!^!!) 离心30s，沉淀与细胞培养上清中的抗体结合的抗原蛋白；弃上清，PBS洗3次，加5X SDS 上样缓冲液，95°C加热5min，10000 X g离心3min，每个泳道取20 μ L进行SDS-PAGE，剩余样 品-80 °C保存；在进行SDS-PAGE的同时，以HRP标记的山羊抗小鼠 I gG为二抗，ECL显色，进 行Western Blot