表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及伪狂犬病病毒变异株，尤其涉及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬 病病毒变异株，本发明还涉及所述重组伪狂犬病病毒变异株在制备预防或治疗猪瘟和/或 伪狂犬病的疫苗或试剂中的用途，属于伪狂犬病病毒变异株的构建及应用领域。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上主要以高热稽留、广泛性出 血和高死亡率为主要特征（Moennig，2000)。猪瘟被世界动物卫生组织（OIE)列入OIE疫病 名录（OIE-listed diseases)，为须申报的（notifiable)动物性传染病，在中国CSF被列为 "一类动物疫病"。该病呈世界范围内流行，对养猪业危害严重，造成巨大的经济损失。
[0003] 伪狂犬病（Pseudorabies，PR)又称奥耶茨基氏病，是由伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)引起的猪、羊、牛等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒 (猪除外）、脑脊髓炎、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病（Mettenleiter et al. , 2008) 〇
[0004] 在PRV基因中缺失一个或多个病毒复制非必需基因，可以使病毒毒力减弱，但同 时又不影响自身的增殖和免疫原性，这样以PRV作为载体携带其他外源抗原基因进入生 物体内，不仅可以刺激机体产生对PRV的免疫反应，同时也可以产生对外源抗原的免疫 应答。因此，这些基因缺失的PRV常常用来作为载体来表达外源基因，从而构建多价疫 苗（路明华，路迎迎，王宏俊.伪狂犬病病毒载体疫苗研宄进展.动物医学进展.2013 ; 34(6) : 136-140)。因此，开发一种安全有效的预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的新型PRV 病毒活载体多价疫苗极具应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一株表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病 毒变异株，该变异株稳定性好，外源蛋白表达水平高，具有良好的安全性和免疫原性，能够 用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] 本发明以分离的伪狂犬病流行毒株（TJ株）构建了 gE/gl双基因缺失的重 组病毒rPRVTJ-delgE/gl，以此为基础，以CSFV强毒Shimen株E2蛋白为模式抗原，在 rPRVTJ-delgE/gl中插入CSFV的主要保护性抗原E2基因，并对所获得的重组病毒进行了进 一步的克隆，筛选出一株复制特性好、稳定性好、外源蛋白表达量高的重组伪狂犬病病毒变 异株 rPRVTJ-delgE/gI-E2。
[0008] 本发明将获得的重组伪狂犬病病毒变异株rPRVTJ-delgE/gI-E2提交专利认可的 机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 10411 ;分类命名为：表达猪瘟病毒E2蛋白 的重组变异株伪狂犬病病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏时间是2015年03月19日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研宄所。
[0009] 本发明进一步公开了所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株的构 建方法，包括以下步骤：（1)构建含有猪瘟病毒E2基因的转移载体；（2)将经酶切处理的重 组病毒rPRVTJ-delgE/gl-EGFP-Neo基因组和步骤（1)构建的转移载体共转染动物细胞，收 获病毒，筛选，纯化，即得。
[0010] 本发明以特异引物对分别扩增CMV片段和CSFV E2片段，再经融合PCR获得 CMV-E2片段。然后将CMV-E2片段克隆至pOK-LR载体上，获得转移载体p0K-LR-CMV-E2。 本发明进一步将经酶切处理（经Pac I和Pme I双酶切处理）的重组病毒rPRVTJ-delgE/ gl-EGFP-Neo基因组和p0K-LR-CMV-E2质粒共转染Vero细胞，收获转染细胞产物，反复冻 融后，取上清接种PK-15细胞，进行蚀斑筛选，挑取有细胞病变但不发绿色荧光的蚀斑。进 一步对获得的重组病毒进行蚀斑纯化，随机挑取10个克隆，对每个克隆连续传20代后， 经PCR鉴定，猪瘟病毒E2蛋白基因仍然存在于所有病毒株的基因组中，对每个毒株所扩增 的E2基因测序结果均与理论序列一致，说明外源基因可以稳定存在于重组病毒中。IFA结 果显示，重组病毒不同克隆株接种PK-15细胞后都能够表达猪瘟病毒E2蛋白，在蛋白表 达量上不同毒株之间有一定的差异。流式细胞仪分析不同病毒株表达蛋白的平均荧光强 度，结果显示，有一株病毒表达外源蛋白的荧光强度要明显高于其它毒株（P〈〇. 05)，命名为 rPRVTJ-delgE/gI-E2〇
[0011] 本发明将CMV启动子置于E2基因的上游，而没有使用PRV本身的启动子，这大大 能够增加外源蛋白的表达量。在构建方法上，采用了指示病毒反向筛选与引入单一酶切位 点相结合的方法，大大加快了重组病毒的获得与纯化。本发明经过6轮的蚀斑筛选就获得 了目的病毒。
[0012] Western blot分析显示，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2插入的外源片段CSFV E2 基因能够正确的进行表达。一步生长曲线绘制结果显示，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2与 亲本毒PRV TJ株的一步生长曲线走势基本相符，说明外源片段CSFV E2的插入对病毒本身 的增殖无影响；但重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的滴度比亲本病毒PRV TJ株低约101.75， 在接毒后l〇_16h二者病毒滴度具有显著性差异（p〈0. 05)。
[0013] 本发明重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2能够应用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪 狂犬病的疫苗或试剂。
[0014] 本发明进一步公开了一种预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗组合物，包括： 免疫有效量的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株rPRVTJ-delgE/gI-E2和药 学上可接受的佐剂。
[0015] 对靶动物猪的致病性及免疫原性实验结果表明，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2 具有良好的安全性和免疫原性，免疫仔猪后能够对PRV及CSFV的攻击提供完全的保护。
[0016] rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪针对PRV TJ株的攻毒保护实验结果表明：免疫后6d， 不同剂量的rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组个别猪PRV gB抗体转为阳性，攻毒后gB抗体滴 度迅速升高，至攻毒后6d达到较高的水平，随后gB抗体水平趋于平稳。PRV gE抗体检测 结果显示，对于不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪，仅IO4TCID 5tl免疫组有2头猪于攻毒 后15d才发生gE抗体阳转，其它剂量免疫猪均没有产生gE抗体。在攻毒后6d，不同剂量 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪检测到了针对PRV TJ株的中和抗体的产生，随后逐渐升高，高 剂量免疫猪的中和抗体滴度要高于低剂量免疫组。攻击PRV TJ株后，rPRVTJ-delgE/gI-E2 不同剂量免疫猪均没有出现任何临床症状，仅104TCID50rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组有1 头猪出现排毒。
[0017] rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪针对CSFV的攻毒保护实验结果表明：以不同剂量的 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫仔猪后，最高剂量（IO6TCID5ci) -次免疫组于免疫后4w有2头猪 CSFV特异性抗体转阳，至攻毒前该组所有猪的猪瘟抗体均发生阳转；rPRVTJ-delgE/gI-E2 两次免疫组（1〇 5或10 4TCID5tl免疫组）于加强免疫后CSFV特异性抗体逐渐升高，攻毒后所 有免疫猪抗体迅速上升，并于攻毒后9d达到峰值，抗体阻断率达到80 %左右。攻毒后免 疫猪产生的CSFV中和抗体迅速上升，于攻毒后9d达到较高水平。CSFV攻击后，不同剂量 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组所有猪均没有出现发热及猪瘟特异性的临床症状，均没有检测 到CSFV核酸的存在。对存活猪进行剖检和病理解剖学观察，不同剂量免疫猪均没有出现明 显的病理变化，而PBS对照组出现明显的猪瘟特征性病变。
[0018] 在对CSFV的攻毒保护评价上，rPRVTJ-delgE/gI-E2以IO6TCID 5tl剂量一次免疫或 以IO5TCID5tl或10 4TCID5tl剂量两次免疫即可对CSFV强毒的攻击提供完全的攻毒保护，即使 在攻毒之前没有检测到猪瘟特异性的抗体或抗体滴度较低的猪在攻击CSFV之后也没有出 现任何临床反应和病理变化，而且在攻毒之后猪瘟特异性抗体迅速上升，提示产生了免疫 记忆反应。宄其原因可能与非特异性的细胞免疫反应有关，有研宄显示，PRV作为疫苗载体 构建的重组病毒免疫动物后能够诱导非常强的细胞免疫反应，这对抵抗病毒的攻击也起到 非常重要