一种体外色素与红细胞相互作用系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种体外色素与红细胞相互作用系统及其应用，取自生物体的红细胞与取自日本血吸虫虫体的血吸虫色素混合在培养介质中；培养介质为酸性生理盐水或醋酸钠溶液；培养介质位于细胞培养瓶或无菌EPP管中；该体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，或筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物。与现有技术相比，本发明的系统有助于观察细胞变化特点和色素总量变化，揭示色素形成与细胞裂解相互关系，便于研究色素与贫血症间的关系，同时也为阻止这种相互作用的新药研究创造条件。
【专利说明】一种体外色素与红细胞相互作用系统及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于生命医学科学领域，尤其是涉及一种用以研究血吸虫病和疟疾致贫血机制和新药研发的体外色素与红细胞相互作用系统及其应用。
【背景技术】
[0002]疟疾和血吸虫病都是我国重要的致病寄生虫。研究抗虫疫苗和药物一直是该类病防治工作的重点。研究已发现，这两种寄生虫有一共性，都生成色素(hemozoin)。该物质的生成具有重要生物学意义。目前研究已发现，在血吸虫中色素形成是虫体成熟和卵形成过程中铁转运的载体。在疟原虫中，它与抗氧化功能密切相关。因此，色素是目前多种抗虫药物作用的靶点。但是，至今人们对该物质了解不深。研究发现，该色素具有特殊而稳定的形态，如球形或逗号形。可吸附于细胞表面，利用环境中的血红素可自行装配新的色素颗粒。在新色素颗粒形成中，所吸附细胞被裂解。所以，该色素有一重要功能是一裂解细胞。
[0003]当疟原虫或血吸虫在寄生人体的过程中，大量色素颗粒被释放到人体血循环系统中，因此，它们会吸附在大量红细胞表面。目前尚未揭示这种吸附作用与疟疾和血吸虫病贫血症之间的关系。但是，根据色素形成机制，以及患者贫血特点发现:(I)疟疾贫血不是疟原虫直接破损寄生细胞所致；(2)血吸虫不会因摄入大量红细胞而致患者贫血。所以，这两种寄生虫所释放的大量可损伤红细胞的色素将与贫血症之间存在潜在的密切联系。特别是抑制色素形成的药物，如氯喹等，恰好是作用在色素，并抑制色素形成。所以，目前急需建立研究色素与红细胞相互作用的实验平台，以研究色素与贫血症间的关系，同时也为阻止这种相互作用的新药研究创造条件。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种体外色素与红细胞相互作用系统及其应用，该系统用以方便观察色素与红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，同时通过该系统，筛选可抑制二者相互作用的药物。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]一种体外色素与红细胞相互作用系统，取自生物体的红细胞与取自日本血吸虫虫体的血吸虫色素混合在培养介质中；
[0007]所述的培养介质为酸性生理盐水或醋酸钠溶液；
[0008]所述的培养介质位于细胞培养瓶或无菌EPP管中，所述的培养介质的培养温度为37。。。
[0009]所述的红细胞在培养介质中的浓度控制在(1-10) X IO4个/毫升，所述的血吸虫色素在培养介质中的浓度为0.l-100nmol/mlo
[0010]所述的红细胞通过以下方法现用现制备:
[0011](I)无菌操作下，从小鼠或兔中取新鲜红细胞；
[0012](2)用无菌酸性生理盐水洗涤红细胞3次，在转速为2000rpm下洗涤Imin ；[0013](3)洗涤后的红细胞保存在4°C的环境下，保存时间不超过2天，最好现用。
[0014]所述的血吸虫色素通过以下方法制备:
[0015](I)用日本血吸虫尾蝴感染小鼠，小鼠饲养40~45天后，用无菌预冷生理盐水灌注小鼠胸主动脉，冲取日本血吸虫成虫，并将日本血吸虫成虫的雌虫转移到无菌EPP管中，破碎虫体后，低速离心，收集上层含色素颗粒溶液；
[0016](2)将含色素颗粒溶液高速离心，弃去澄清上层液，加入无菌酸性生理盐水洗涤色素颗粒沉淀，重复离心及洗涤色素颗粒3遍；
[0017](3)洗涤后的色素悬浮液通过注射器(2-10ml)过直径为5微米的滤膜过滤；
[0018](4)滤过液在_20°C保存,备用。以上各步均为无菌操作。
[0019]用30-40只日本血吸虫尾蝴感染每I只小鼠。
[0020]低速离心的转速为2000rpm，低速离心的时间为l_2min ；
[0021]高速离心的转速为13000rpm,高速离心时间为5-10min。
[0022]所述的培养介质的pH值为4-6。
[0023]—种所述的体外色素与红细胞相互作用系统的应用，所述的体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与 红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，或筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物。
[0024]当所述的体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用或研究红细胞被色素的破坏机制时，具体包括以下步骤:
[0025](I)将所述的体外色素与红细胞相互作用系统在37°C培养箱中培养3-10天，同时以无色素红细胞悬浮液作为对照组；
[0026](2)期间通过光镜或电镜观察红细胞形态，比色法确定色素或血红素含量，用以分析作用系统中血红素变化，指示红细胞破坏程度。
[0027]当所述的体外色素与红细胞相互作用系统用于筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物时，具体包括以下步骤:
[0028](I)在所述的体外色素与红细胞相互作用系统中加入药物作为实验组，同时以无色素红细胞悬浮液作为其中一个对照组，以所述的体外色素与红细胞相互作用系统作为另一对照组；
[0029](2)将实验组与对照组在培养箱中培养3-10天，每日观察和比较实验组与对照组溶血情况(溶血程度是色素与红细胞作用强度的指标，即溶血严重者，相互作用明显；反之，相互作用小)。
[0030]对溶血情况的观察:检测前，样品先混匀，而后离心，13000rpml0min，取上层液进行血红素比色分析。计数、定量与比色方法为常规技术方法，在此省略。
[0031]与现有技术相比，本发明的系统有助于观察细胞变化特点和色素总量变化，揭示色素形成与细胞裂解相互关系，便于研究色素与贫血症间的关系，同时也为阻止这种相互作用的新药研究创造条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为红细胞与色素混合培养过程中的溶血情况；
[0033]图2为光镜观察下色素对红细胞的破坏情况；[0034]图3为光镜观察下色素对红细胞的破坏情况；
[0035]图4为透射电镜观察下色素对红细胞的破坏情况；
[0036]图5为场发射扫描电镜观察下色素对红细胞的破坏情况；
[0037]图6为光镜观察下没有日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况；
[0038]图7为活体场发射扫描电镜观察下没有日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况；
[0039]图8为光镜观察下存在日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况；
[0040]图9为活体场发射扫描电镜观察下存在日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况；
[0041]图10为红细胞-色素组与红细胞-色素-酵母细胞组在培养过程中色素情况；
[0042]图11为红细胞-色素组在培养过程中色素总量情况；
[0043]图12为单纯色素组、酵母细胞-色素组及单纯酵母细胞组在培养过程中的色素情况；
[0044]图13为药物作用下红细胞与色素组在培养过程中色素总量情况。
[0045]图2-图9中的标尺均为5微米。
【具体实施方式】
[0046]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0047]实施例1
[0048]本实施例中，细胞形态观察，如光镜、电镜技术等，为常规技术方法。色素含量测定方法同血红素测定，为常规技术方法。
[0049]一种体外色素与红细胞相互作用系统，取自生物体的红细胞与取自日本血吸虫虫体的血吸虫色素混合在培养介质中；
[0050]培养介质为酸性生理盐水；
[0051]培养介质位于细胞培养瓶中，培养介质的培养温度为37°C。
[0052]红细胞在培养介质中的浓度控制在10X IO4个/毫升，血吸虫色素在培养介质中的浓度为 0.l-100nmol/ml。
[0053]红细胞通过以下方法现用现制备:
[0054](1)无菌操作下，从小鼠或兔中取新鲜红细胞；
[0055](2)用无菌酸性生理盐水洗涤红细胞3次，在转速为2000rpm下洗涤Imin ；
[0056](3)洗涤后的红细胞保存在4°C的环境下，现用。
[0057]血吸虫色素通过以下方法制备:
[0058](1)用日本血吸虫尾蝴感染小鼠，小鼠饲养40天后，用无菌预冷生理盐水灌注小鼠胸主动脉，冲取日本血吸虫成虫，并将日本血吸虫成虫的雌虫转移到无菌EPP管中，破碎虫体后，低速离心，收集上层含色素颗粒溶液；
[0059](2)将含色素颗粒溶液高速离心，弃去澄清上层液，加入无菌酸性生理盐水洗涤色素颗粒沉淀，重复离心及洗涤色素颗粒3遍；
[0060](3)洗涤后的色素悬浮液通过注射器(IOml)过直径为5微米的滤膜过滤；
[0061](4)滤过液在_20°C保存,备用。以上各步均为无菌操作。
[0062]每I只小鼠需要感染30只尾蝴。
[0063]低速离心的转速为2000rpm，低速离心的时间为2min ；[0064]高速离心的转速为13000rpm,高速离心时间为lOmin。
[0065]培养介质的pH值为4。
[0066]—种体外色素与红细胞相互作用系统的应用，体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，或筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物。
[0067]当体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用或研究红细胞被色素的破坏机制时，具体包括以下步骤:
[0068](I)将体外色素与红细胞相互作用系统在37°C培养箱中培养10天，同时以无色素红细胞悬浮液作为对照组；
[0069](2)期间通过光镜或电镜观察红细胞形态，比色法确定色素或血红素含量，用以分析作用系统中血红素变化，指示红细胞破坏程度。
[0070]对红细胞和色素混合培养3到6天的溶血情况进行比较，如图1所示，红细胞可被色素吸附，而且，在红细胞色素混和组很快会在系统中检出更高量的血色素，提示更多的细胞被破坏。
[0071]光镜观察下色素对红细胞的破坏情况如图2、图3所示，透射电镜观察下色素对红细胞的破坏情况如图4所示，场发射扫描电镜观察下色素对红细胞的破坏情况如图5所示，从图2~图5中，看出色素颗粒吸附到红细胞表面，破坏细胞结构。
[0072]观察日本血吸虫色素对酵母细胞的相互作用，光镜观察下没有日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况如图6所示，活体场发射扫描电镜观察下没有日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况如图7所示`，光镜观察下存在日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况如图8所示，活体场发射扫描电镜观察下存在日本血吸虫色素时酵母细胞表面的情况如图9所示，从图6~图9中，看出色素颗粒吸附到酵母细胞表面，破坏细胞结构。
[0073]比较红细胞-色素组与红细胞-色素-酵母细胞组在培养过程中色素情况，如图10所示，从图10中可以看出，红细胞-色素-酵母细胞组中的色素总增加远远超过红细胞-色素组，说明在相同条件下，酵母比单纯红细胞更能促进色素形成。
[0074]比较红细胞-色素组在培养5-9天时，色素总量情况，如图11所示，从图11中看出，从5到9天的过程中，红细胞裂解，色素形成。
[0075]比较单纯色素组、酵母细胞-色素组及单纯酵母细胞组在培养过程中的色素情况，如图12所示，从图12中看出，(I)只有红细胞参与才能合成新色素；(2)色素可分解红细胞；(3)色素可分解酵母细胞。
[0076]当体外色素与红细胞相互作用系统用于筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物时，具体包括以下步骤:
[0077](I)在体外色素与红细胞相互作用系统中加入药物作为实验组，同时以无色素红细胞悬浮液作为其中一个对照组，以体外色素与红细胞相互作用系统作为另一对照组；
[0078](2)将实验组与对照组在培养箱中培养10天，每日观察和比较实验组与对照组溶血情况(溶血程度是色素与红细胞作用强度的指标，即溶血严重者，相互作用明显；反之，相互作用小)。
[0079]对溶血情况的观察:检测前，样品先混匀，而后离心，13000rpml0min，取上层液进行血红素比色分析。计数、定量与比色方法为常规技术方法，在此省略。[0080]对药物作用下，红细胞与色素组在培养过程中，色素情况如图13所示，从图13中看出，红细胞与色素混和组在培养2-4天时，色素总量增加。而且，这种增加可被加入的特异性抑制色素形成的药物氯喹抑制。进一步证实，“增加”的确是色素总量的增加。
[0081]该系统可用于研究色素与任何细胞间的关系，而对这些关系的深入认识，有助于对能合成这类色素的寄生虫(疟原虫和血吸虫)致病机制的阐明。其中，色素与红细胞的关系尤其重要，对揭示疟疾和血吸虫病的贫血症机制研究具有重要价值。
[0082]实施例2
[0083]本实施例中，细胞形态观察，如光镜、电镜技术等，为常规技术方法。色素含量测定方法同血红素测定，为常规技术方法。
[0084]一种体外色素与红细胞相互作用系统，取自生物体的红细胞与取自日本血吸虫虫体的血吸虫色素混合在培养介质中；
[0085]培养介质为醋酸钠溶液；
[0086]培养介质位于无菌EPP管中，培养介质的培养温度为37°C。
[0087]红细胞在培养介质中的浓度控制在1-2 X IO4个/毫升，血吸虫色素在培养介质中的浓度为 10-30nmol/ml。
[0088]红细胞通过以下方法现用现制备:
[0089](I)无菌操作下，从小鼠或兔中取新鲜红细胞；
[0090](2)用无菌酸性生理盐水洗涤红细胞3次，在转速为2000rpm下洗涤Imin ；
[0091](3)洗涤后的红细胞保存在4°C的环境下，保存时间不超过2天。
[0092]血吸虫色素通过以下方法制备:
[0093](I)用日本血吸虫尾蝴感染小鼠，小鼠饲养42天后，用无菌预冷生理盐水灌注小鼠胸主动脉，冲取日本血吸虫成虫，并将日本血吸虫成虫的雌虫转移到无菌EPP管中，破碎虫体后，低速离心，收集上层含色素颗粒溶液；
[0094](2)将含色素颗粒溶液高速离心，弃去澄清上层液，加入无菌酸性生理盐水洗涤色素颗粒沉淀，重复离心及洗涤色素颗粒3遍；
[0095](3)洗涤后的色素悬浮液通过注射器(2-10ml)过直径为5微米的滤膜过滤；
[0096](4)滤过液在_20°C保存,备用。以上各步均为无菌操作。
[0097]每I只小鼠需要感染35只尾蝴。
[0098]低速离心的转速为2000rpm，低速离心的时间为Imin ；
[0099]高速离心的转速为13000rpm,高速离心时间为5min。
[0100]培养介质的pH值为5。
[0101]一种体外色素与红细胞相互作用系统的应用，体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，或筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物。
[0102]当体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用或研究红细胞被色素的破坏机制时，具体包括以下步骤:
[0103](I)将体外色素与红细胞相互作用系统在37°C培养箱中培养3-10天，同时以无色素红细胞悬浮液作为对照组；
[0104](2)期间通过光镜或电镜观察红细胞形态，比色法确定色素或血红素含量，用以分析作用系统中血红素变化，指示红细胞破坏程度。
[0105]实施例3
[0106]本实施例中，细胞形态观察，如光镜、电镜技术等，为常规技术方法。色素含量测定方法同血红素测定，为常规技术方法。
[0107]一种体外色素与红细胞相互作用系统，取自生物体的红细胞与取自日本血吸虫虫体的血吸虫色素混合在培养介质中；
[0108]培养介质为醋酸钠溶液；
[0109]培养介质位于无菌EPP管中，培养介质的培养温度为37°C。
[0110]红细胞在培养介质中的浓度控制在4-5 X IO4个/毫升，血吸虫色素在培养介质中的浓度为 20-1 OOnmo I/ml。
[0111]红细胞通过以下方法现用现制备:
[0112](I)无菌操作下，从小鼠或兔中取新鲜红细胞；
[0113](2)用无菌酸性生理盐水洗涤红细胞3次，在转速为2000rpm下洗涤Imin ；
[0114](3)洗涤后的红细胞保存在4°C的环境下，保存时间不超过2天。
[0115]血吸虫色素通过以下方法制备:
[0116](I)用日本血吸虫尾蝴感染小鼠，小鼠饲养45天后，用无菌预冷生理盐水灌注小鼠胸主动脉，冲取日本血吸虫成虫，并将日本血吸虫成虫的雌虫转移到无菌EPP管中，破碎虫体后，低速离心，收集上层含色素颗粒溶液；
[0117](2)将含色素颗粒溶液高速离心，弃去澄清上层液，加入无菌酸性生理盐水洗涤色素颗粒沉淀，重复离心及洗涤色素颗粒3遍；
[0118](3)洗涤后的色素悬浮液通过注射器(2-10ml)过直径为5微米的滤膜过滤；
[0119](4)滤过液在_20°C保存，备用。以上各步均为无菌操作。
[0120]每I只小鼠需要感染35只尾蝴。
[0121]低速离心的转速为2000rpm，低速离心的时间为1.5min ；
[0122]高速离心的转速为13000rpm,高速离心时间为8min。
[0123]培养介质的pH值为6。
[0124]一种体外色素与红细胞相互作用系统的应用，体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，或筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物。
[0125]当体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用或研究红细胞被色素的破坏机制时，具体包括以下步骤:
[0126](1)将体外色素与红细胞相互作用系统在37°C培养箱中培养3-10天，同时以无色素红细胞悬浮液作为对照组；
[0127](2)期间通过光镜或电镜观察红细胞形态，比色法确定色素或血红素含量，用以分析作用系统中血红素变化，指示红细胞破坏程度。
【权利要求】
1.一种体外色素与红细胞相互作用系统，其特征在于，取自生物体的红细胞与取自日本血吸虫虫体的血吸虫色素混合在培养介质中； 所述的培养介质为酸性生理盐水或醋酸钠溶液； 所述的培养介质位于细胞培养瓶或无菌EPP管中，所述的培养介质的培养温度为37 ℃ ； 所述的红细胞在培养介质中的浓度控制在(1-10) X IO4个/毫升，所述的血吸虫色素在培养介质中的浓度为0.l-100nmol/mlo
2.根据权利要求1所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统，其特征在于，所述的红细胞通过以下方法现用现制备: (1)无菌操作下，从小鼠或兔中取新鲜红细胞； (2)用无菌酸性生理盐水洗涤红细胞3次； (3)洗涤后的红细胞保存在4°C的环境下，保存时间不超过2天，备用。
3.根据权利要求1所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统，其特征在于，所述的血吸虫色素通过以下方法制备: (1)用日本血吸虫尾蝴感染小鼠，小鼠饲养40~45天后，用无菌预冷生理盐水灌注小鼠胸主动脉，冲取日本血吸虫成虫，并将日本血吸虫成虫的雌虫转移到无菌EPP管中，破碎虫体后，低速离心，收集上层含色素颗粒溶液； (2)将含色素颗粒溶液高速离心，弃去澄清上层液，加入无菌酸性生理盐水洗涤色素颗粒沉淀，重复离心及洗涤色素颗粒3遍； (3)洗涤后的色素悬浮液通过直径为5微米的滤膜过滤； (4)滤过液在_20°C(保存，备用； 以上各步均为无菌操作。
4.根据权利要求3所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统，其特征在于，用30-40只日本血吸虫尾蝴感染每I只小鼠。
5.根据权利要求3所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统，其特征在于，低速离心的转速为2000rpm,低速离心的时间为l_2min ； 高速离心的转速为13000rpm,高速离心时间为5_10min。
6.根据权利要求1所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统，其特征在于，所述的培养介质的PH值为4-6。
7.—种如权利要求1所述的体外色素与红细胞相互作用系统的应用，其特征在于，所述的体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用，研究红细胞被色素的破坏机制，或筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物。
8.根据权利要求7所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统的应用，其特征在于，所述的体外色素与红细胞相互作用系统用于观察色素与红细胞相互作用或研究红细胞被色素的破坏机制时，具体包括以下步骤: (1)将所述的体外色素与红细胞相互作用系统在37°C培养箱中培养3-10天，同时以无色素红细胞悬浮液作为对照组； (2)期间通过光镜或电镜观察红细胞形态，比色法确定色素或血红素含量，用以分析作用系统中血红素变化，指示红细胞破坏程度。
9.根据权利要求7所述的一种体外色素与红细胞相互作用系统的应用，其特征在于，所述的体外色素与红细胞相互作用系统用于筛选可抑制色素与红细胞相互作用的药物时，具体包括以下步骤: (1)在所述的体外色素与红细胞相互作用系统中加入药物作为实验组，同时以无色素红细胞悬浮液作为其中一个对照组，以所述的体外色素与红细胞相互作用系统作为另一对昭相. (2)将实验组与对照组在培养箱中培养3-10天，每日观察和比较实验组与对照组溶血情况。
【文档编号】C12Q1/02GK103805674SQ201410022361
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】孙军 申请人:同济大学