专利名称：一种麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于糖蛋白提取工艺技术领域，尤其是涉及一种麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方 法及其应用。
背景技术：
麒麟菜是一种在热带和亚热带海域生长的海藻，含有丰富的可溶性海藻多糖，目前主要
用于提取卡拉胶。卡拉胶是海藻可溶性海藻多糖的统称，基本提取方法为麒麟菜一碱液浸 泡一清洗一煮胶一过滤一凝胶一乙醇脱水一干燥一成品。
麒麟菜的表层组织中一种捕光色素蛋白，即藻胆蛋白。藻胆蛋白不仅是海藻进行光合作 用的主要光感受器，具有能量产生、转换与传递的功能，而且对肿瘤细胞有强烈的抑制和杀 伤作用，还可用于生物体内的荧光免疫临床诊断，在生物医学领域方面也具有广阔的应用前 景。近年来国内外对藻胆蛋白提取分离都进行了较多研究，目前提取藻胆蛋白的基本方法为 :麒麟菜一低温中性或碱性溶液浸泡一反复冻融或超声波法破碎细胞一低温离心除去细胞碎 片一收集上清液一加入固体硫酸铵充分沉淀后一低温静置过夜一低温离心收集沉淀物一溶解 透析一柱吸附层析一梯度洗脱一冷冻干燥一藻胆蛋白。由于藻胆蛋白的提取存在着工艺复杂 ，产品量低微，稳定性差等因素，因而至今未能得以开发利用。
麒麟菜天然色素糖蛋白是一种藻胆蛋白和海藻多糖以离子键方式结合的天然化合物。天 然色素糖蛋白依然保持了藻胆蛋白良好的抗肿瘤活性，且提高了稳定性和产品量，易于开发 利用。曾有国内外研究者采用生物工程技术合成藻胆蛋白，但尚未见到有活性产品的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，在温和的环境中快速提 取活性麒麟菜天然色素糖蛋白，解决现有技术存在的缺陷。 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
优选的方案是 一种麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，包括如下步骤
1)联合酶生化反应将新鲜或干燥麒麟菜置于酸性缓冲液中，加入淀粉酶反应2-3h，加入胶原蛋白酶继续反应0.5-1.0h，加入自来水并调节温度终止反应，静置沉淀，收集上清液
2) 过滤浓縮将步骤l)所述上清液用真空抽滤机减压抽滤，收集滤液用旋转蒸发仪减
压浓縮至原提取液体积的1/2 1/4;
3) 沉淀分离将步骤2)得到的浓縮液中加入稀酸调pH值，然后加入3 5倍体积的乙醇 ，搅拌，析出沉淀，沉淀放置过夜，真空抽滤，得到滤纸上的沉淀部分，分别用无水乙醇、 丙酮洗涤，室温干燥，得天然色素糖蛋白。
优选的方案是所述骤l)中酸性缓冲液为pH值5.0-5.5的、温度为40-6(TC磷酸缓冲液 ;所述的淀粉酶的用量为10-30单位/1.0g麒麟菜；所述胶原蛋白酶的用量为10-20单位 /1. Oml反应液。
更为优选的方案是在加入加入淀粉酶反应后，加入胶原蛋白酶前将所述反应液PH值调 节至6. 5-7.0;所述自来水用量为磷酸缓冲液用量的一半，所述终止反应的温度为3(TC以下
更为优选的方案是所述的终止反应的温度为2(TC 28°C 。
更为优选的方案是所述步骤2)中上清液用真空抽滤机减压抽滤，收集滤液用旋转蒸 发仪减压浓縮至原提取液体积的1 /3 1/4 。
更为优选的方案是所述步骤3)中稀酸调pH值为稀盐酸调节pH值为4.2 4.8;所述加 入3 5倍体积的乙醇为95%的乙醇。
更为优选的方案是还包括测定天然色素糖蛋白中多糖含量和/或测定天然色素糖蛋白 中蛋白质含量的步骤。
更为优选的方案是所述测定天然色素糖蛋白中多糖含量步骤为采用苯酚一硫酸法测
定，以葡萄糖为标准物质将标准葡萄糖干燥后，配制成O. 04mg/ml标准溶液，分别取O. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8ml，以水补至2. Oml，加入6%苯酚1. Oml及浓硫酸 5.0ml，静置，10min，摇匀，室温放置20min， 490nm测吸光度，绘制标准曲线，得到回归直 线；所述测定天然色素糖蛋白中蛋白质含量为采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋 白为标准物质。将牛血清白蛋白配成100ug/ml的标准溶液，各取O、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，混合，放置2min后，595nm下比色，绘 制标准曲线，得到同归直线。
本发明的另一目的在于提供前一目的所述方法提取的麒麟菜天然色素糖蛋白在制备抑制 人体肿瘤细胞药物和制备生物体内的荧光免疫临床诊断试剂中的应用。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明提取麒麟菜天然色素糖蛋白 优选的方案为采用联合酶生化反应法进行分离提取，而不是其他物理或化学法，整个反应过 程中反应条件更加温和，而且工艺简单，提取过程耗时很短，对天然色素糖蛋白活性破坏性 小；本发明得到的提取物为海藻多糖与藻胆蛋白相结合的天然色素糖蛋白，不是单纯的海藻 多糖或藻胆蛋白；麒麟菜在提取色素糖蛋白之后可以继续提取卡拉胶。本发明为制备抑制人 体肿瘤细胞药物和制备生物体内的荧光免疫临床诊断试剂奠定了坚实的基础，具有广阔的应 用前景。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明 实施例l
称取洗净晾干的麒麟菜10g，加入30mlpH值5. O的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液体积为新鲜或 干燥麒麟菜体积的2-3倍)，调节温度为5(TC，加入淀粉酶200单位，反应2.0h，再调节pH值 6.5，加入胶原蛋白酶300单位，继续反应O. 5h，加入15ml自来水，调节温度为25。C，静置沉 淀，收集上清液。将上清液用真空抽滤机减压抽滤，合并抽滤瓶里的滤液共60ml，用旋转蒸 发仪减压浓縮至30ml。浓縮液中加入稀盐酸调pH值4. 5，继续加入120ml的95。/。的乙醇，搅拌 ，析出沉淀，沉淀放置过夜，真空抽滤，将滤纸上的沉淀部分，用10ml的一次性软吸管进行 洗涤，先用30ml的无水乙醇洗涤3次、再用20ml的丙酮洗涤2次，室温干燥，得到天然色素糖 蛋白。
天然色素糖蛋白中多糖含量的测定采用苯酚一硫酸法测定，以葡萄糖为标准物质。将
标准葡萄糖干燥后，配制成O. 04mg/ml标准溶液，分别取O. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8ml，以水补至2. Oml，加入6%苯酚1. 0ml及浓硫酸5. Oml，静置，10min，摇匀，室温 放置20min， 490nm测吸光度，绘制标准曲线，得到回归直线。
天然色素糖蛋白中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白为 标准物质。将牛血清白蛋白配成100ug/ml的标准溶液，各取O、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，混合，放置2min后，595nm下比色，绘制标准 曲线，得到同归直线。
实施例2
称取洗净晾干的麒麟菜10g，加入30mlpH值5. O的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液体积为新鲜或 干燥麒麟菜体积的2-3倍)，调节温度为6(TC，加入淀粉酶100单位，反应3.0h，再调节pH值7.0，加入胶原蛋白酶450单位，继续反应1.0h，加入15ml自来水，调节温度为20。C，静置沉 淀，收集上清液。将上清液用真空抽滤机减压抽滤，合并抽滤瓶里的滤液共60ml，用旋转蒸 发仪减压浓縮至20ml。浓縮液中加入稀盐酸调pH值4.8，继续加入100ml的95。/。的乙醇，搅拌 ，析出沉淀，沉淀放置过夜，真空抽滤，将滤纸上的沉淀部分，用10ml的一次性软吸管进行 洗涤，先用30ml的无水乙醇洗涤3次、再用20ml的丙酮洗涤2次，室温干燥，得到天然色素糖 蛋白。
天然色素糖蛋白中多糖含量的测定采用苯酚一硫酸法测定，以葡萄糖为标准物质。将
标准葡萄糖干燥后，配制成O. 04mg/ml标准溶液，分别取O. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8ml，以水补至2. Oml，加入6%苯酚1. 0ml及浓硫酸5. Oml，静置，10min，摇匀，室温 放置20min， 490nm测吸光度，绘制标准曲线，得到回归直线。
天然色素糖蛋白中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白为 标准物质。将牛血清白蛋白配成100ug/ml的标准溶液，各取O、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，混合，放置2min后，595nm下比色，绘制标准 曲线，得到同归直线。
实施例3
称取洗净晾干的麒麟菜10g，加入30mlpH值5. 5的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液体积为新鲜或 干燥麒麟菜体积的2-3倍)，调节温度为4(TC，加入淀粉酶200单位，反应3.0h，再调节pH值 6.5，加入胶原蛋白酶600单位，继续反应O. 5h，加入15ml自来水，调节温度为28。C，静置沉 淀，收集上清液。将上清液用真空抽滤机减压抽滤，合并抽滤瓶里的滤液共60ml，用旋转蒸 发仪减压浓縮至15ml。浓縮液中加入稀盐酸调pH值4.2，继续加入70ml的95。/。的乙醇，搅拌， 析出沉淀，沉淀放置过夜，真空抽滤，将滤纸上的沉淀部分，用10ml的一次性软吸管进行洗 涤，先用30ml的无水乙醇洗涤3次、再用20ml的丙酮洗涤2次，室温干燥，得到天然色素糖蛋 白。
天然色素糖蛋白中多糖含量的测定采用苯酚一硫酸法测定，以葡萄糖为标准物质。将
标准葡萄糖干燥后，配制成O. 04mg/ml标准溶液，分别取O. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8ml，以水补至2. Oml，加入6%苯酚1. 0ml及浓硫酸5. Oml，静置，10min，摇匀，室温 放置20min， 490nm测吸光度，绘制标准曲线，得到回归直线。
天然色素糖蛋白中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白为 标准物质。将牛血清白蛋白配成100ug/ml的标准溶液，各取O、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，混合，放置2min后，595nm下比色，绘制标准曲线，得到同归直线。
实例4麒麟菜天然色素糖蛋在制备抑制人体肿瘤细胞药物中的应用
取人肝癌组织匀浆用1640培养基调制成细胞密度为1 X 106/1111的细胞悬液；取实施例2所 述方法制备麒麟菜色素糖蛋白，并配制成浓度为100mg/100ml的溶液并滤菌；取96孔板，每 孔加入肝癌细胞悬液100ml，共加4个孔，将l 2号孔各加入色素糖蛋白溶液100ul， 3 4号 孔各加入培养液100ml;置37。C培养箱中培养10小时，加入5mg/ml的MTT20ml，继续培养3小 时形成了蓝色颗粒；吸掉孔中溶液，加入DMSO 150ml使颗粒溶解；用酶标仪在波长492nm测 定各孔光密度；结果1 2号孔的平均光密度为0.21， 3 4号孔的平均光密度为0.43，提示 色素糖蛋白可抑制人肝癌细胞的增长。
实例5麒麟菜天然色素糖蛋在制备生物体内的荧光免疫临床诊断试剂中的应用 将Si8o肉瘤种鼠的腹水4倍稀释，取O. lml皮下注射接种于健康成年昆明种小鼠的右侧腋 下，共接种20只；将其中l 10号鼠每天经口灌胃色素糖蛋白100mg/kg体重，11 20号鼠每
只每天灌胃给予蒸馏水0.5ml;喂养10天处死动物，分离瘤体并称重；结果1 10号鼠的平
均瘤重为0.23士0. 15g， 11 20号鼠平均为0.39±0. 17g，提示色素糖蛋白对小鼠3180肉瘤的 增长有抑制作用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明 的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本 发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，包括如下步骤1)联合酶生化反应将新鲜或干燥麒麟菜置于酸性缓冲液中，加入淀粉酶反应2-3h，加入胶原蛋白酶继续反应0.5-1.0h，加入自来水并调节温度终止反应，静置沉淀，收集上清液；2)过滤浓缩将步骤1)所述上清液用真空抽滤机减压抽滤，收集滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至原提取液体积的1/2～1/4；3)沉淀分离将步骤2)得到的浓缩液中加入稀酸调pH值，然后加入3～5倍体积的乙醇，搅拌，析出沉淀，沉淀放置过夜，真空抽滤，得到滤纸上的沉淀部分，分别用无水乙醇、丙酮洗涤，室温干燥，得天然色素糖蛋白。
2 如权利要求l所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是 :所述骤l)中酸性缓冲液为pH值5.0-5. 5的、温度为40-6(TC磷酸缓冲液；所述的淀粉酶的 用量为10-30单位/1. Og麒麟菜；所述胶原蛋白酶的用量为10-20单位/1. Oml反应液。
3 如权利要求2所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是 :在加入加入淀粉酶反应后，加入胶原蛋白酶前将所述反应液pH值调节至6. 5-7.0;所述自 来水用量为磷酸缓冲液用量的一半，所述终止反应的温度为3(TC以下。
4 如权利要求3所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是 :所述的终止反应的温度为2(TC 28。C。
5 如权利要求l所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是 :所述步骤2)中上清液用真空抽滤机减压抽滤，收集滤液用旋转蒸发仪减压浓縮至原提取 液体积的1/3 1/4。
6 如权利要求l所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是 :所述步骤3)中稀酸调pH值为稀盐酸调节pH值为4.2 4.8;所述加入3 5倍体积的乙醇为 95%的乙醇。
7 如权利要求l所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是:还包括测定天然色素糖蛋白中多糖含量和/或测定天然色素糖蛋白中蛋白质含量的步骤。
8.如权利要求7所述的麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，其特征是 :所述测定天然色素糖蛋白中多糖含量步骤为采用苯酚一硫酸法测定，以葡萄糖为标准物质将标准葡萄糖干燥后，配制成O. 04mg/ml标准溶液，分别取O. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8ml，以水补至2. Oml，加入6%苯酚1. 0ml及浓硫酸5. Oml，静置，10min，摇匀， 室温放置20min， 490nm测吸光度，绘制标准曲线，得到回归直线；所述测定天然色素糖蛋白 中蛋白质含量为采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白为标准物质。将牛血清白蛋 白配成100ug/ml的标准溶液，各取O、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0. 6ml，加入5ml考马斯亮 蓝G-250试剂，盖塞，混合，放置2min后，595nm下比色，绘制标准曲线，得到同归直线。
9.如权利要求l-8任一所述麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法提取的 麒麟菜天然色素糖蛋白在制备抑制人体肿瘤细胞药物中的应用。
10.如权利要求l-8任一所述麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法提取 的麒麟菜天然色素糖蛋白在制备生物体内的荧光免疫临床诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种麒麟菜天然色素糖蛋白的提取方法，属于糖蛋白提取工艺技术领域；本发明采用联合酶生化反应提取，过滤减压浓缩后沉淀分离得到麒麟菜天然色素糖蛋白，并对麒麟菜天然色素糖蛋白进行多糖含量和/或蛋白中蛋白质含量的测定。本发明提取麒麟菜天然色素糖蛋白优选的方案为采用联合酶生化反应法进行分离提取，而不是其他物理或化学法，整个反应过程中反应条件更加温和，而且工艺简单，提取过程耗时很短，对天然色素糖蛋白活性破坏性小；本发明为制备抑制人体肿瘤细胞药物和制备生物体内的荧光免疫临床诊断试剂奠定了坚实的基础，具有广阔的应用前景。
文档编号C07K1/00GK101585868SQ20091030310
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月5日
发明者宏 钟, 钟进义 申请人:深圳市藻源生物科技股份有限公司