专利名称：调节植物光敏素c的表达以控制植物的开花时间的制作方法
技术领域：
本发明涉及调节植物开花(抽穗)时间的PHYC基因的利用。
背景技术：
水稻是一种短日照植物，表明它在日长变短的时候开花(圆锥花序(抽穗)显露出来)。感受日长的光感受器称为植物光敏素(phy)，色素结合分子。在水稻中，有3种光敏色素编码基因，即PHYA、PHYB和PHYC(Kay S A etal.，Nucleic Acids Res.172865-2866，1989；Dehesh K et al.Mol.Gen.Genet.225305-313，1991，Tahir，M.et al.，Plant Physiol.1181535，1998)。
如同在单子叶植物如水稻的光敏色素突变体，从高粱属(sorghum)的植物中已分离出phyB突变体(ma3R)(Childs K L et al.，Plant Physiol.113611-619，1997)。该ma3R突变体不仅表现出提早开花的表型，同时表现出叶绿素含量减少、茎杆徒长、顶端优势增强，这与正常植物类型有明显的区别。最近，本发明人从水稻中分离了phyA突变体并对其表型特点进行了详细的研究。结果发现，不管在长日照还是短日照光周期条件下均没有观察到该突变植株与对照水稻即Nipponbare在开花时间上有明显的区别(Takano M et al.，Plant Cell 13521-534，2001)。水稻se5突变体中所有光敏色素含量都低于可检测水平，不管日长光周期条件如何都表现出提早开花表型(Izawa T et al.，Plant J.22391-339，2000)。尽管在质体血红素氧化酶编码基因中发现突变，然而，在该突变体中，所有的光敏色素基因，即PHYA、PHYB和PHYC没有改变(Izawa T et al.，Plant J.22391-339，2000)。
至今，甚至在非常熟知的实验模式植物-拟南芥(Arabidopsis thaliana)中还没有分离到phyC突变体的报道，也没有与植物开花时间有关的PHYC基因功能性分析的报道。
发明公开本发明通过考虑上述所提及的背景而进行的。本发明的一个目的是分离phyC突变体进而分析其表型以寻求PHYC基因的利用方法。具体而言，本发明提供开花(抽穗)的起动得到促进的phyC突变体及通过抑制PHYC基因表达以加快开花的方法。
本发明的发明人为达到上述目的进行了详尽的研究。为了阐明PHYC基因的功能，通过利用突变体面板(Panel)突变体分离方法而得到了phyC突变体(Hirochika H.InMolecular Biology of Rice，Springer-Verelag(Tokyo)，pp43-58，1999)。
在该体系中，在短日照植物-水稻的组织培养物中通过激活反转录转座子Tos17已获得插入型突变体系。已经熟知，当水稻种子进行组织培养时，在水稻基因组中的称作Tos17的反转录转座子被激活并且通过转座至其它染色体区域而将基因破坏。从种子经过形成愈伤组织而再生成成熟植物，可容易地获得大量相互独立的突变体品系。
从所获得的这些突变体系中分离出感兴趣的突变体。具体而言，980个突变体品系的每一个收集品系被置于称为突变体面板的三维矩阵中，该突变体面板类似于十个微量滴定板堆积形成有八行的Z-轴，有十二行的Y-轴和有十行的X-轴。在每个轴的突变体系库中提取DNA，并用于筛选感兴趣的突变体。这些库的DNA被用作含一套特异于PHYC基因和Tos17的LTR区域的引物的PCR体系中的模板。只有当Tos17反转录转座子存在于PHYC基因的特异性引物附近时才能获得扩增条带(即Tos17插入到PHYC基因中时)。通过这种方法，只需要8次PCR扩增可确定感兴趣的突变体是否存在于面板中，即是否存在于980个突变体系中。当特异性条带被扩增时，相同的引物组合被用于对相同面板的X和Y轴上的突变体进行PCR扩增。在每一个轴上对有扩增的行进行确认。感兴趣突变体的位置在三维矩阵内从这些行的交叉点上得到确证。
通过这些实验，成功分离出phyC突变体，其中Tos17插入到PHYC基因的第一个外显子编码区。而且，发现在长日照条件生长下，phyC突变体开始开花(抽穗)大约比对照水稻要早1周。因此，第一次阐明了PHYC基因的编码产物参与感受长日照光周期而延迟开花。至今，还没有关于PHYC基因参与了确定植物开花时间的报道。这里获得的结果显示抑制PHYC基因的表达可以在长日照条件下促进植物开花。特别地，phyC突变体与野生型植株相比，除开花时间之外，不存在其它显著区别的表型，因此通过抑制该基因的表达将非常有利于特异性的驱动开花。利用PHYC基因促进开花将非常有利于育种改良，例如，可更方便于创造有用的农业作物和装饰植物，它们具有能适应其它栽培地区和栽培时期等的新特性。此外，水稻phyC突变体，在长日照条件下开花提前，作为一种新的早熟水稻品种是非常有价值的。
也就是说，本发明涉及利用在长日照条件下控制植物开花(抽穗)的PHYC基因，以促进植物开花，具体的说，(1)一种促进植物开花的核酸，其中所述核酸选自下述(a)至(c)中任一项(a)与植物PHYC转录物互补的反义核酸；(b)具有可特异性切割植物PHYC转录物的核酶活性的核酸；和(c)通过共抑制方式而可抑制植物phyC基因表达的核酸。
(2)根据(1)的核酸，所述植物是短日照植物。
(3)根据(2)的核酸，所述短日照植物是水稻。
(4)含有(1)-(3)中的任一核酸的载体。
(5)携带有(1)-(3)中的任一核酸或(4)的载体的转化植物细胞。
(6)含有(5)所述的转化植物细胞的转基因植物。
(7)是(6)的转基因植物的后代或克隆的转基因植物。
(8)(6)或(7)的转基因植物的繁殖材料。
(9)用于产生(6)或(7)的转基因植物的方法，其中所述方法包括将(1)-(3)中的任一核酸或(4)的载体导入植物细胞和从所述植物细胞再生成植株的步骤。
(10)一种促进植物开花的方法，其中该方法包括抑制所述植物的细胞中的内源PHYC基因的表达。
(11)根据(10)的方法，其中该方法包括将(1)-(3)中的任一核酸或(4)的载体导入植物。
(12)根据(9)-(11)中任一的方法，所述植物是短日照植物。
(13)根据(12)的方法，所述短日照植物是水稻。
(14)一种水稻phyC突变体。
(15)一种水稻phyC突变体，其是(14)所述的突变体的后代或克隆。
(16)(14)或(15)中水稻突变体的繁殖材料。
本发明的发明人已经阐明了水稻phyC突变体在长日照条件下可以促进水稻开花。这表明有可能在长日照条件下通过抑制植物PHYC基因表达来启动植物开花。
本发明提供可促进植物开花的核酸。本发明的一个优选方案，植物开花是通过抑制植物PHYC基因的表达来促进的。
通常地，术语“开花”是指花的开放；然而，在本发明的上下文关系中，术语“开花”可以适用于包括水稻(rice)在内的稻类(family)作物的植物，例如，术语“开花”指圆锥花序(抽穗)的出现。在本发明中，短语“促进开花”意指开花开始的提前。在本发明中，术语“长日照条件”是指在一天中黑暗期短于光周期反应所需的阈值黑暗期(临界黑暗期)。具体而言，14小时光照/10小时黑暗的光周期被通常用作例子来说明。
在本发明中，上述所提及的PHYC基因是编码phyC蛋白的基因，是一种植物色素结合蛋白即光敏色素。PHYC基因在许多植物中均有发现。因此，在本发明中，选择用于在长日照条件下通过调节PHYC基因的表达来促进开花的植物优选的是短日照植物，更优选的是属于稻类的植物。最优选的是水稻。短日照植物是那些形成花芽或它的花芽形成在不间断黑暗时间长于临界黑暗时间的光周期条件下被促进的植物。优选地，经本发明促进开花的植物例如是有价值的农作物和装饰植物。具体而言，有用的作物可以是单子叶植物如水稻或双子叶植物如大豆。装饰植物可以是花卉植物如菊花、牵牛花、一品红(poinsettia)和大波斯菊(cosmos)。
本发明的PHYC基因包括作为实际例子的水稻PHYC基因(Genbankaccession NoAB018442)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)PHYC基因(Genbankaccession NoZ32538)。
此外，利用本领域技术人员所熟知的方法，如杂交技术(Southern E M etal.Journal of Molecular Biology 98503，1975)或聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki R K et al.Science 2301350-1354，1985，Saiki R K et al.Science239487-491，1988)，可以分离上述所提及的PHYC基因的同源物，进而获得这些基因的核苷酸序列信息。例如，利用水稻PHYC基因的核苷酸序列(Genbank accession NoAB0l8442)或其一部分序列作为探针的杂交技术，或使用能与PHYC基因杂交的特异性寡核苷酸作为引物的PCR技术可以从预期植物中分离出与PHYC基因高度同源的DNA。
为了分离这些DNA，杂交反应通常在严谨条件下进行。杂交条件是6M尿素，0.4％SDS和0.5X SSC或相当条件下作为严谨条件。也可采用更高严格的杂交条件，例如6M尿素，0.4％SDS和0.1X SSC而获得高度同源的DNA。分离到的DNA的序列可以采用已知方法来确定。
通常是基于序列同源性来确定所分离的DNA是否编码phyC蛋白。序列同源性可以用称作BLASTN(核苷酸水平)或BLAST(氨基酸水平)的程序来查找(Altschul，s.f.et al.，J.Mol.Biol.215403-410，1990)。这些程序是以Karlin和Altschul的BLAST运算法则为基础的(Proe.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。如果用BLASTN分析核苷酸序列，可以进行参数设定，例如分值(score)＝100和字长(wordlength)＝12。如果用BLASTX分析氨基酸序列，可以进行参数设定，例如分值(score)＝50和字长(wordlength)＝3。氨基酸序列可以用Altschul et al中描述的Gapped BLAST程序分析(Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。当用BLAST和Gapped BLAST程序进行序列分析时，可采用各程序的默认参数。这些特殊的分析方法已广为人知(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在本发明的方法中，为了获得促进开花的植物，是将抑制PHYC基因表达的DNA插入到合适的载体并且导入植物细胞，进而再生成完整的植株。术语“PHYC基因表达的抑制”包含转录和翻译抑制，不仅包括了完全终止DNA的表达，也包括降低其表达水平。
在本发明中，为了抑制内源植物基因的表达，本领域技术人员可以利用如反义技术来达到。Ecker et al将反义RNA通过电穿孔法导入的瞬间基因表达而第一次证实了反义技术在植物细胞中的有效性(Ecker J R andDavis R W.PNAS 835372，1986)。之后，在烟草和矮牵牛花中也观察到反义效应使靶基因的表达水平减少(Krol A R et al.Nature 333866，1988)。目前，抑制植物基因表达的技术已确立。通过反义核酸来抑制靶基因的表达存在多种机制，即形成三链抑制转录起始；RNA聚合酶形成局部开环结构的地方形成杂交而引起的转录抑制；与正在合成的RNA通过杂交而引起转录抑制；在内含子和外显子之间的接点处形成杂交而引起剪接抑制；在剪接体(spliceosome)位点形成杂交引起剪接抑制；与mRNA形成杂交而抑制mRNA从胞核转移到胞质；在加帽(capping)位点或多聚腺苷酸添加位点(polyA)处通过杂交引起剪接抑制；在翻译起始因子的结合位点处形成杂交而引起翻译起始的抑制；在起始密码子附近的核糖体结合位点处通过杂交引起翻译抑制；在mRNA上的翻译区或多核糖体结合位点内通过杂交引起多肽延长抑制；在核苷酸与蛋白质互作位点形成杂交引起基因表达的抑制；等等。这些不同的机制分别抑制靶基因的转录、剪接和翻译过程以抑制基因表达(Hirashima and Inoue，New Biochemistry Experimetn Vol.2 Nucleic acidIV，Replication and Expression of Gene，Japanese Biochemical Society ed.，Tokyo Kagaku Dojin，pp.319-347，1993)。因此，本发明提供与植物PHYC基因转录产物互补的反义核酸。上述所提及反义核酸包括反义DNA，反义RNA和编码反义RNA的DNA。
在本发明中，反义核酸能够用于上述提及的机制来抑制靶基因的表达。在一个具体实施方案中，反义核酸设计成互补于mRNA的5’非翻译区能够引起有效的翻译抑制。然而，也可利用互补于编码区或3’非翻译区的核酸。本发明包括的反义DNA不仅可从翻译区而且可从非翻译区来进行设计。使用的反义DNA连接于合适启动子的下游，而且更优选地，包含翻译终止信号的序列连接于其3′末端。
本发明的反义核酸可通过如硫代磷酸酯的方法，根据SEQ ID NO3所示DNA序列信息来制备(Stein CA et al.Nucleic Acids Res.163209-3221，1998)。制备的核酸可以通过已知的方法而用于转染目标植物。优选地，反义核酸序列与欲转染植物的内源基因或基因的一部分互补。然而，只要基因的表达能够被有效的抑制，不必要求完全互补。本发明的反义核酸优选地是90％或更高，最优选为95％或更高的与靶基因转录物互补。利用反义核酸来有效的抑制靶基因的表达，反义核酸应当至少有15或更多个核苷酸长度，优选为100或更多个核苷酸，最优选为500或更多个核苷酸长度。使用的反义核酸通常短于5kb并且优选的短于2.5kb。
另一个抑制内源基因表达的方法是核酶技术。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶已知具有许多不同类型的活性。核酶作RNA切割酶的研究使得可以设计出能够在RNA的特定位点进行切割的核酶。因此，本发明提供能够特异切割植物PHYC基因转录物的核酶活性的核酸。上述提及的本发明的核酸包括具有核酶活性的RNA和编码这些RNA的DNA。
对于核酶，如I组内含子类型和包含于RnaseP中的M1RNA，可以是比较大，具有400个核苷酸或更多，也有比较小的，如包括锤头状和发夹状的具有活性区域的约40个核苷酸的核酶(Koizumi M and Otsuke E.Tanpakushitsu Kakusan Koso 352191，1990)。例如，已知锤头状类型核酶的自我剪切结构域可以切割序列G13U14C15的C15的3′侧。对于切割活性非常重要的是第9位的A与U14形成配对。进而，研究表明当第15位碱基是A或U而不是C时也发生切割(Koizumi M et al.FEBS Lett.228225，1988)。因此，如果设计核酶具有互补于靠近靶标序列的RNA序列的底物结合位点，该核酶可以被用作限制性内切酶类似的RNA切割核酶以识别靶RNA中的序列UC，UU或UA(Koizumi M et al.FEBS Lett.228225，1988；Koizumi Mand Otsuke E.Tanpakushitsu Kakusan Koso 352191，1990；Koizumi M et al.Nucleic Acids Res.177059，1989)。
此外，发夹状类型核酶在本发明的上下文中是有用的。例如在烟草环斑病毒的卫星RNA负链中发现有发夹状类型的核酶(Buzayan J M.Nature323349，1986)。该核酶也可以设计成靶特异性切割RNA(Kikuchi Y andSasaki N.Nucleis Acids Res.196751，1992，Kikuchi H.Chemistry and Biology30112，1992)。
设计用于切割靶的核酶，例如连接于启动子如花椰菜花叶病毒35S启动子，和转录终止子序列而在植物细胞中转录。然而，如果非必要序列被加在转录RNA的5′或3′末端，核酶活性可能丧失。在这种情况下，为了准确地从包含核酶序列的转录RNA中仅切出核酶的部分，可以将另外一个顺式作用的修饰核酶置于该核酶的5′或3′侧(Taira K et al.Protein Eng.3733，1990，Dzianott A M and Bujarski J J.PNAS 864823，1989，Grosshans C A andCech R T.Nucleic Acids Res.193875，1991，Taira K et al.Nucleic Acids Res.195125，1991)。此外，可经前后排列的如此结构单元以对在靶基因中的多个位点进行切割而获得更好的效果(Yuyama N et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271，1992)。因此，可以使用这种核酶来特异性切割本发明所述的靶转录物从而抑制该基因的表达。
内源基因表达的抑制也可通过共抑制来达到，这是通过用含有与靶基因序列相同或相似的序列的核酸转化而产生的共抑制。“共抑制”是指这样一种现象，当与靶内源基因相同或相似的序列的基因通过转化导入植物时，靶内源基因和所导入的外源基因的表达均受到抑制。共抑制的机制还不完全清楚，但在植物中经常发生(Curr.Biol.7R793，1997，Curr.Biol.6810，1996)。因此，本发明提供通过共抑制而对植物PHYC基因表达有抑制效果的核酸。本发明所述核酸包括通过共抑制而产生抑制效果的DNA和RNA。
为了获得利用本发明上述提及的核酸而产生PHYC基因受到共抑制的植物，例如将能表达含有PHYC基因序列或该基因类似序列的DNA的载体DNA导入靶植物，继而选择具有phyC突变体表型的植株，即在长日照条件下能够促进开花。用于共抑制的基因不必完全相同但应当与靶基因序列有至少70％或更高，优选80％或更高，最优选90％或更高(如95％或更高)的相同性。
另外，本发明所述内源基因的抑制可以向植物导入引起相对于靶基因而言的显性阴性表型的基因来达到。术语“能引起显性阴性表型的基因”意指该基因的表达可消除或降低植物中原始存在的野生型内源基因的活性。
此外，本发明提供上述的核酸、包含所述核酸的载体、具有所述核酸或包含所述核酸的载体的转化植物细胞、含有所述转化植物细胞的转基因植物、上述转基因植物的后代或克隆的转基因植物和所述转基因植物的育种材料。
另外，本发明提供一种生产上述转基因植物的方法，包括将本发明的核酸导入到植物细胞并由植物细胞再生成植物体的步骤。
本领域技术人员可以通过已知的方法，例如农杆菌介导法、电穿孔法和粒子枪法等将本发明所述核酸导入到植物细胞。
例如Nagel et al.的方法被用作是农杆菌法(Microbiol.Lett.67325，1990)。根据该方法，用重组载体转化农杆菌并通过已知方法如叶盘法导入到植物细胞中。当本发明所述的核酸为DNA时，上述载体包含例如启动子，在导入植物后以表达指物中的DNA。通常，本发明所述的DNA被置于这种启动子的下游，同时将终止子序列置于所述DNA的下游。为了该目的的重组载体可由本领域技术人员根据所采用的转染方法或植物类型来确定。例如，上述所提及的启动子可以是来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子或来源于玉米的遍在蛋白(ubiquitin)启动子(未经审查公开的日本专利申请No.(JP-A)Hei 2-79983)。
例如，上述的终止子可以是源自花椰菜花叶病毒的终止子或胭脂碱合成酶终止子。然而，并不限于所举例子，只要在植物中能够发挥启动子或终止子功能的启动子或终止子均可选用。
用本发明所述的核酸进行转染的植物可以是外植体。任选地，从所述植物制备出培养细胞，进而用所述核酸导入该培养细胞。例如，本发明所述的“植物细胞”可以是从叶、根、茎、花、种子角质鳞片、愈伤组织和培养细胞悬浮液的细胞。
此外，为了有效的选择本发明所述核酸已经被导入的转化植物细胞，上述的重组载体优选为携带有合适的选择标记基因或与携带有选择标记基因的质粒载体一起导入植物细胞。例如，为所述目的的选择标记基因可以是赋予对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因；赋予对卡那霉素或庆大霉素(gentamycin)抗性的新霉素磷酸转移酶基因；赋予对除草剂膦丝菌素(phosphinothricin)抗性的乙酰转移酶(acetyltransferase)基因。
用重组载体进行转染的植物细胞平铺或培养于已知的选择性培养基上，其培养基中含有根据所导入的选择性标记基因而选取的合适的选择性药物。通过这种方法，可以获得转化的植物培养细胞。
接下来，本发明所述核酸已导入的转化植物细胞再生出植物体。植物的再生可采用依植物细胞类型来选择本领域已知的方法来进行(Toki et al.Plant Physiol.1001503-1507，1995)。已有几种成熟的再生转化水稻植株的技术，而且这些技术已在本发明所属领域内被广泛使用。例如，水稻植物可以在如下步骤之后进行再生(1)用聚乙二醇法将基因导入原生质体中(适合于Indica水稻品种)(Datta S K et al.，In Gene Transfer To Plants(Potrykus I andSpangenberg Eds.)pp 66-74，1995)；(2)用电脉冲法将基因导入原生质体中(适合于Japonica水稻品种)(Toki et al.Plant Physiol.1001503-1507，1992)；(3)用基因枪法(Particle gun)将基因直接导入细胞中(Christou et al.，Bio/technology，9957-962，1991)；或者(4)用农杆菌介导法将基因导入细胞(Hiei et al.Plant J 6271-282，1994)。在本发明中，这些是优选的方法。
转化植物细胞再生出的植株进而在驯化(acclimatization)培养基上培养。然后，在经过环境适应性培养基上培养后的植株在正常的栽培条件下生长，而获得促进开花的植株。当这些植株成熟和结果后而获得相应的种子。
由此再生和生长的转基因植物中导入的外源核酸可用已知的方法来验证，如PCR或Southern杂交，或通过分析来自植物的核酸的核苷酸序列。也可以用J.Sambrook et al中的已知方法来提取转基因植物中的核酸(Molecular Cloning，2ndedition，Cold Spring Harbor laboratory Press，1989)。
为了分析存在于再生植株中的含有本发明所述核酸的外源基因，通过上述方法从再生植株中提取的核酸作为模板进行扩增反应。当本发明所述的核酸是DNA时，其扩增反应可以在含有根据该DNA的核苷酸序列来合适筛选核苷酸序列设计合成的寡核苷酸作为引物的反应混合物中进行。可以通过重复DNA变性、退火和延伸步骤的数十个循环的扩增反应来获得含有本发明所述DNA序列的扩增DNA片段。各自扩增DNA片段通过如在含有扩增产物的琼脂糖凝胶中进行电泳来分离。然后即能确认与本发明的DNA相应的扩增片段。
一旦获得本发明的核酸已经插入到染色体的转基因植株，即可通过有性繁殖或无性繁殖来获得其后代。同样，也可以通过由上述植物或其后代或克隆获得可繁殖性材料(如种子、果实、插条、块茎、块根、芽、愈伤组织和原生质体)大规模生产所述植物。
在本发明中，正如上面所提及的，通过抑制PHYC基因的表达来达到植物开花的提前。
此外，本发明提供水稻phyC突变体，它们的后代或克隆和phyC突变体的可繁殖性材料。
本发明的水稻phyC突变体不仅包括可在长日照条件下促进开花的水稻phyC突变体(纯合突变体)，还包括杂合突变体。杂合突变体可用于生产纯合突变体。此外，本发明的水稻phyC突变体除包括根据本发明中所分离出的phyC突变体(纯合和杂合体突变体)，也可通过利用实施例中所描述的突变体面板的方法来新分离得到phyC突变体(纯合和杂合体突变体)。
附图的简要说明
图1显示在phyC突变体中Tos17反转录转座子的插入位点。在panel A的黑框显示Tos17插入的边界；Tos17插入在组氨酸(H)残基224和谷氨酸(E)残基245之间。Panel B表明Tos17在染色体上的插入位点。
图2显示证实phyC突变体分离的图。PhyC突变的杂合突变体进行自交，用Southern杂交对获得后代(#1-9)进行分析，其所用的探针可检测用XhoI处理后而得到包含PHYC基因的3.8kb片段。(+/+)野生型；(+/-)杂合phyC突变体和(-/-)纯合phyC突变体。
图3显示用竞争性RT-PCR方法检测出的PHYC基因转录物的表达水平。Log(Comp)表示竞争者浓度的对数值。PhyC表示PHYC转录物，Comp表示源自竞争者序列的扩增产物。(+/+)野生型；(+/-)杂合phyC突变体和(-/-)纯合phyC突变体。
图4显示在田间中生长的phyC突变体的开花(抽穗)时间。OsphyA-2phyA突变体，(+/±)野生型或自交之后分离出的杂合突变体，OsphyC-1phyA突变体。
图5显示用Nipponbare回交phyC突变体所得到的F2代分离群的基因型与开花时间之间的关系。
图6显示在长日照和短日照光周期条件下phyC突变体的开花(抽穗)时间。在水平轴上的14L/10D和10.5L/13.5D分别表示为长日照和短日照条件。
实施本发明的最佳方式本发明通过下述实施例而得到详细的解释，但并不局限于这些实施例。
phyC突变体的分离本发明通过突变体面板方法来分离phyC突变体。PHYC基因的引物是基于水稻PHYC cDNA序列(Genbank Accession NO.AB018442)来设计的。由于该基因很大，故设计了6条引物以覆盖phyC基因的整个序列(BR，DR，EF，FR，GF和HR)(表1)。同时，设计了两条针对Tos17两末端的LTR序列向外的引物(表2)。
表1
*BR1，DR1，EF1，FR1，GF1和HR1分别表示为BR，DR，EF，FR，GF和HR的嵌套引物。
**表示在水稻PHYC cDNA序列(Genbank Accession NO.AB018442)上的引物位点位置。
表2
*LTR2和LTR5分别为LTR1和LTR4的嵌套引物.
用12组引物对在突变体面板上的9600个个体进行PCR筛选(6条PHYC特异性引物)×(2条Tos17特异性引物)。当用BR和LTR4引物时可以发现特异性扩增。在用于突变体面板的DNA池中，包括了来自80(X-轴)到120(Z-轴)个个体的DNA，即由于每一个个体的DNA被稀释1/120到1/80而使每一条模板的浓度非常低。此外，一次PCR很难检测到特异性扩增，这是由于Tos17的LTR序列富含AT而使所设计的引物的Tm值非常低。因此，为了增加灵敏性和特异性，设计了与上述各引物之下游对应的额外引物(BR1，DR1，EF1，FR1，GF1，HR1，LTR2和LTR5)，并且进行两次PCR(嵌套式PCR)以检测扩增。结果，可以观察到许多非特异性条带，因此还需要用Southern杂交来鉴定特异性条带。切出鉴定出条带并提取出其中的DNA片段。对该DNA片段进行测序以确定Tos17的插入位点。Tos17插入在发色团(开环的四吡咯)结合位点(244th氨基酸)的上游(图1)，表明这是一个无义突变。
同样，可通过Southern杂交来确定Tos17的插入。根据报道的水稻PHYC基因组DNA序列，当水稻基因组DNA用XhoI消化时，预期产生来自野生型的水稻基因组3.8kb的条带(D.Basu et al.Plant Mol.Biol.4427-42，2000)。相反，Tos17插入突变体则预期分别产生7.5kb和0.4kb两条条带。从phyC杂合突变体的自交后代(#1-9)提取DNA，用能识别到用XhoI处理产生的含有PHYC基因的3.8kb的探针进行Southern杂交(对于突变体，使用的探针包含phyC cDNA的全长，可以识别7.5kb片段)。这样可以获得预期的结果。此外，发现Tos17插入突变体经过分离至纯合突变体(#2，5，6和7)和杂合突变体(#1，4，8和9)，在#3中没有发现Tos17(图2B)。从这些结果可知，获得了一个phyC突变体系(osphyC-1)。
PHYC基因转录物的RT-PCR验证为了验证在所分离的phyC突变体中PHYC基因缺少表达，杂合phyC突变体经过自花授粉，从其后代(#1-9)中提取DNA用于确定所述它们的基因型。此外，提取RNA以用在表1中所述的BR和EF引物进行竞争性RT-PCR(图3)。使用竞争性DNA，其两端携带有BR和EF序列的DNA片段，在它们之间是与phyC cDNA无关的340bp序列。结果，在野生型(#3)或杂合phyC突变体(#1，4，8和9)中扩增出PHYC基因，但在纯合phyC突变体(#2，5，6和7)并没显示预期大小的条带，这表明纯合突变体中没有PHYC基因的表达。
phyC突变体对开花(抽穗)时间的影响为了研究开花时间，Nipponbare和phyC突变体的种子于2000年6月28日进行播种，并于2000年7月14日移栽到田间。这些水稻植物在自然日长的条件下生长并观察开花的时间。如图4中所示，phyA突变体(osphyA-2)对照和由自交phyC突变体分离的杂合突变体分离体或野生型在播种后第60到61天开花，然而phyC突变体在第54天开花，比前者早约一周。
此外，为了验证phyC突变体与开花提前的时间之间的关系，phyC突变体与Nipponbare进行回交，研究分析F2代分离群的开花时间和基因型。在F2群(n＝54)和对照Nipponbare群(n＝63)于2002年5月15日播种后于2002年6月5日移栽到田间。如图5所示，分离杂合体和野生型个体(n＝45)在播种后平均93.2天开花，而没有早于播种后第91天开花的。另一方面，phyC突变体(n＝9)在平均第83.1天后开花而没有晚于第84天后才开花的。在该群体中，基因型完全与开花时间相关。Nipponbare对照平均在94.1天后开花，几乎与杂合体和野生型个体的开花时间完全一样。
而且，为了测试在短日照和长日照条件下的开花时间，将植株置于可以控制气候的人工气候室中生长(短日照10.5小时光照/13.5黑暗，长日照14小时光照/小时10黑暗)(图6)。在短日照条件下，在Nipponbare和phyA突变体及phyC突变体之间不存在区别。所有这些植株均大约在50天开花。在长日照条件下，Nipponbare和phyA突变体约需90天才能开花，然而phyC突变体在约83天后即开花，提前了约1周。因此，PHYC基因被认为具有感受长日照光周期和使开花延迟的功能。
此外，对phyC突变体的表现型，除开花时间外，包括诸如植株高度、植株特性、叶绿素含量和叶绿素a/b的比率进行了研究分析。然而，没有观察到任何显著的区别。
工业实用性本发明提供了利用植物PHYC基因促进开花(抽穗)的方法。PhyC突变体除在此所述开花时间外，并没有在其它表型上发生改变(例如在植株高度、植物特性、叶绿素含量和叶绿素a/b比率)。由此，抑制PHYC的表达以乎可以针对性的促进开花。利用PHYC基因来促进开花将充分地有助于育种改良，例如有助于创造有用的农作物和装饰植物而使其具有适合于在其它栽培地区和栽培时期的新特性。本发明也提供植物phyC突变体，其开花在长日照光周期条件下受到促进。水稻phyC突变体将是非常有前景的早熟水稻新品种。
序列表<110>独立行政法人农业生物资源研究所(National Institute of Agrobiological Sciences)生物系特定产业技术研究推进机构(Bio-oriented Technology Research AdvancementInstitution)<120>调节植物光敏素C的表达以控制植物的开花时间<130>MOA-A0103P<140>
<141>
<150>JP 2001-266330<151>2001-09-03<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>1gtgatggcag accatcaacc 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2ccagtgtctc catcatcatc c21
<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3catacctaag cgggaaaggg ac 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4aaagggacaa acctcgggct tg 22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5cgtacaagtt ccatgaggat gagc 24<210>6<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6gaggtgattg ctgagtgcaa gag 23<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>7atcgaccaga ggcttcccta tg 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8tggcttccat gacaggtaat cc 22<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>9gcctaattga gacagcaact gcg 23<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10ttggctgttg acatcactgg 20<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11acgagcttct ggcttatgta aagg24<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12tggcggaaca tctcttgtat cag 23<210>13<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13ttggatcttg tatcttgtat atac24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14gctaatacta ttgttaggtt gcaa24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15ctggacatgg gccaactata cagt24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16attagcttgt atatatattt aaca2权利要求
1.一种促进植物开花的核酸，其中所述核酸选自下述(a)至(c)中任一项(a)与植物PHYC转录物互补的反义核酸；(b)具有可特异性切割植物PHYC转录物的核酶活性的核酸；和(c)通过共抑制方式而抑制植物phyC基因表达的核酸。
2.根据权利要求1的核酸，其中所述植物是短日照植物。
3.根据权利要求2的核酸，所述短日照植物是水稻。
4.含有权利要求1-3中任意一项核酸的载体。
5.携带有权利要求1-3中任意一项的核酸或权利要求4的载体的转化植物细胞。
6.含有权利要求5所述的转化植物细胞的转基因植物。
7.一种转基因植物，其是权利要求6的转基因植物的后代或克隆。
8.权利要求6或7的转基因植物的繁殖材料。
9.用于产生权利要求6或7的转基因植物的方法，其中所述方法包括将权利要求1-3中任意一项的核酸或权利要求4的载体导入植物细胞，和从所述植物细胞再生成植物的步骤。
10.一种促进植物开花的方法，其中该方法包括抑制所述植物的细胞中的内源PHYC基因的表达。
11.根据权利要求10的方法，其中该方法包括将权利要求1-3中任意一项的核酸或权利要求4的载体导入植物。
12.根据权利要求9-11中任意一项的方法，其中所述植物是短日照植物。
13.根据权利要求12的方法，其中所述短日照植物是水稻。
14.一种水稻phyC突变体。
15.一种水稻phyC突变体，其是权利要求14所述的突变体的后代或克隆。
16.权利要求14或15的水稻phyC突变体的繁殖材料。
全文摘要
利用突变体面板(mutant panel)分离突变体的方法分离了水稻phyC基因突变体，发现在长日照条件下比对照植株开花要早1周左右。该结果表明可以通过调节phyC基因的表达来促进长日照条件下植物的开花。利用phyC基因来促进植物开花将大大有利于培育出具有适合于在其它栽培地区和栽培时期等新特性的有用的农作物和装饰植物。此外，水稻phyC基因突变体，在长日照条件下可促进开花，将是非常有前景的快熟水稻新品种。
文档编号C12N15/29GK1571840SQ0282082
公开日2005年1月26日 申请日期2002年8月30日 优先权日2001年9月3日
发明者高野诚, 广近洋彦, 官尾安艺雄 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所, 生物系特定产业技术研究推进机构