专利名称：实现基因高表达的系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用基因工程技术通过将基因插入到宿主生物体内表达基因的方法。本发明进一步涉及新的启动子，含有该启动子和靶基因的重组载体，含有该重组载体的转化体，以及利用该转化体制备有用基因产物或有用物质的方法。
背景技术：
当通过宿主生物体制备物质，或者改变或分析宿主生物体的功能时，使用的是基因工程技术。它包括向宿主生物体引入同源或异源基因用于表达。然而，这种基因工程技术在稳定性和高表达方面尚不充分，因而期望它能够得到改善。
例如，当宿主生物体是酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，常用使用2-μm DNA的YEP型载体。YEP载体允许引入大量的基因拷贝。不过，YEP载体在稳定性方面不能够说是充分的，因为引入的基因产物的酶活可能会由于，例如，细胞分裂期间载体的丢失而下降。为提高酶活，载体被设计成含有药物抗性标记，并向培养基中添加药物，或者当宿主菌株中已经提供营养缺陷型标记时，载体被设计成含有营养缺陷型标记，并且通过进一步利用高度纯化的基本培养基(YNB，Difco)作为培养基，可以施加选择压力。然而，所有这样的情况都是不利的，因为培养基成本昂贵。
同时，就能够将基因整合到染色体内的载体而言，利用同源重组的YIP型载体是已知的。取决于载体的设计，这种YIP载体允许转基因稳定地存在于基因组中，但是一般而言，它不能够实现转基因的高表达。
鉴于上述原因，本领域期望通过将基因稳定且低成本地引入或插入到宿主生物体中高度表达基因的方法。
此外，例如当靶基因在酵母细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达时，需要在基因上游连接能够在酵母内表达的启动子。就当前报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)启动子而言，醇脱氢酶1(ADH1)基因启动子和3-磷酸甘油酸激酶(PGK)基因启动子已知表现出强表达水平。而且，通过同源重组的基因转移导致基因的高稳定性。因此，如果靶基因能够在强启动子指导下表达，它将能有效地产生物质以及改变并分析功能。
不过，当基因通过同源重组被插入到酵母中时，利用的是上述YIP载体。在这种情况下，能够预期的拷贝数仅为1或2。因此，期望开发即便是单拷贝也允许高度表达的启动子。
发明概述本发明的目的是提供通过将靶基因稳定地引入到宿主生物体内高度表达靶基因的方法。此外，本发明的另一个目的是提供具有用于靶基因表达的强转录活性的启动子，和含有该启动子的重组载体，含有该重组载体的转化体，以及利用转化体制备靶基因的表达产物或者有用物质的方法。
作为实现上述目的而进行的彻底研究的结果，我们发现，通过将待表达靶基因连接于酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸脱羧酶1启动子上，然后将该基因整合到宿主基因组中，靶基因能够稳定地且高度地表达。
此外，我们集中于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中产生极大量乙醇的事件。我们预期丙酮酸脱羧酶1基因在乙醇发酵途径中高度表达，并分离了上述丙酮酸脱羧酶1(PDC1)基因的启动子区。此外，我们将PDC1基因启动子区连接到靶基因上，并将该基因插入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，从而得到了靶基因在该启动子指导下高度表达的发现。基于上述发现，我们完成了本发明。
具体地，本发明涉及表达基因的方法，其包括在存在自动调整机制的基因的启动子，或者对宿主生物体生长或发酵非必需的基因的启动子的控制下将靶基因插入到基因组中。启动子可以是含有由存在自动调整机制的基因的启动子的核苷酸序列或者宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子的核苷酸序列，通过缺失、替代或添加1到40个核苷酸所衍生的序列，并具有启动子活性的DNA。而且启动子可以是能够在严谨条件下与包含如下序列的DNA杂交的，并具有启动子活性的DNA，所述序列互补于全部或部分存在自动调整机制的基因的启动子的核苷酸序列，或者宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子的核苷酸序列。
在本发明中，上述存在自动调整机制的基因的启动子包括，例如，丙酮酸脱羧酶1基因的启动子。生长非必需基因的启动子包括，例如，编码硫氧还蛋白的基因的启动子。
在本发明中，宿主生物体可以是任何一种细菌、酵母、昆虫、动物或植物。特别地，优选属于酵母属(Saccharomyces)的酵母。这些宿主生物体还可以指任何个体生物(人除外)、组织和细胞。
此外，在本发明中，上述丙酮酸脱羧酶1基因的启动子是包含下列DNA(a)到(c)中任意一个的启动子(a)包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA；(b)包含由SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列，通过缺失、替代或添加1到40个核苷酸所衍生的核苷酸序列，并具有启动子活性的DNA；和(c)能够在严谨条件下与包含互补于全部或部分SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的序列的DNA杂交，并具有启动子活性的DNA。
本发明还涉及含有上述启动子的重组载体。优选本发明的重组载体可操作地连接于靶基因。在这种情况下，重组载体可以是质粒载体或病毒载体。另外，重组载体中的靶基因是，例如，选自编码蛋白的核酸或其反义核酸、编码反义RNA诱饵(RNA decoy)及核酶的核酸的核酸。
此外，本发明提供了可通过利用任何一种上述重组载体转化宿主而获得的转化体。此处所用的宿主可以是细菌、酵母、动物、昆虫或植物。特别地，宿主优选是属于酵母属(Saccharomyces)的酵母。这些宿主生物体还可以指任何个体生物(人除外)、组织和细胞。
此外，本发明提供了制备靶基因的表达产物或者由该表达产物产生的物质的方法，其包括在培养基中培养任何一种上述转化体，并从获得的培养产物中回收靶基因的表达产物或者由该表达产物产生的物质。
本发明详细说明如下。本申请要求2001年9月20日递交的日本专利申请No.2001-286637和2002年4月30日递交的，要求了前述申请的优选权的日本专利申请No.2002-128323，以及2001年9月20日递交的日本专利申请No.2001-287159和2002年4月30日递交的，要求了前述申请的优选权的日本专利申请No.2002-128286的优选权。本申请包括上述日本专利申请的说明书和/或附图中所公开的内容。
在生物世界中，有些具有存在自动调整机制的基因以及生长或发酵非必需的基因。我们致力于这一点，并选择这类基因的启动子用于基因转移和基因表达的方法。因此，本发明的基因表达方法包括将靶基因插入基因组内，该靶基因处于存在自动调整机制的基因的启动子、或者宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子的控制之下。本发明的方法概括如下。
1.启动子的选择首先，选择存在自动调整机制的基因的启动子、或者宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子。就靶标宿主生物体而言，所有期望用于产生物质、以及期望进行功能的改变或分析的生物体，都可以用作为宿主生物体。宿主生物体的例子包括细菌、酵母、昆虫、动物和植物。
(1)存在自动调整机制的基因的启动子为选择存在自动调整机制的基因的启动子，首先要确定存在自动调整机制的基因。“自动调整机制”是指这样一种机制，其中多个具有相同功能的基因存在于同一个生物体内，其中至少一个基因正常地表达而其余的被抑制，并且仅当通常表达的基因由于破坏等原因不能够行使功能的时候，其余的基因才被表达以继续该功能。例如，酵母属(Saccharomyces)的酵母的丙酮酸脱羧酶(PDC)基因是编码在乙醇合成过程中通过脱羧作用将丙酮酸转化为乙醛的酶的基因，该基因在发酵过程中起着重要作用。PDC包括PDC1、PDC5和PDC6，但正常地PDC1是活化的，而PDC5和PDC6由于PDC1的作用而被抑制。不过，当PDC1因药物作用发生基因破坏或者突变从而其功能被失活的时候，PDC5被活化，藉此酵母的乙醇产生功能不丧失(Eberhardt，I.等，Eur.J.Biochem.1999，262(1)191-201；Muller，EH.等，FEBS Lett.1999，449(2-3)245-250)。实际上，Schaaff等缺失了PDC1启动子，并随后证实了酵母的丙酮酸脱羧酶活性(Schaaff I.等，Curr.Genet.1989，1575-81)。具体地，表型几乎等价于亲本菌株。在另一方面，已经在被归类为酵母的克鲁维酵母属(Kluyveromyces)中分离到PDC1启动子(国际公开WO94/01569)。不过，在克鲁维酵母属(Kluyveromyces)中没有报道过自动调整机制。
存在自动调整机制的基因可通过确认当菌株中的基因被破坏时，该基因编码的蛋白是否依然表达来确定。选择如此确定的存在自动调整机制的基因的启动子。在本发明中，例如，可以选择PDC1的启动子(下文称之为PDC1启动子)。
(2)生长或发酵非必需基因的启动子为选择宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子，首先要确定生长或发酵非必需基因。这里，“生长”是指细胞生存以致能够增殖。“发酵”是指物质藉以产生的乙醇发酵等。此外，“非必需基因”是指不参与生长或发酵过程的基因，从而即使是在该基因被破坏或失活的时候，生长、发酵或两者仍得以维持。
生长或发酵非必需基因可通过确认该菌株宿主生物体是否，在基因被破坏的情况下，继续其生长和发酵来确定。这类基因的例子是编码硫氧还蛋白的TRX1基因，其存在于大多数生物体内。TRX1基因参与DNA复制、氧化应激应答、液泡遗传等，但并总是生长或发酵所必需的。具体地，如果在宿主生物体内TRX1基因被破坏或用其它基因取代，宿主生物体能够继续生长或发酵。选择如此确定的宿主生物体生长或发酵非必需的基因的启动子。
2.靶基因和启动子的制备制备待插入宿主生物体的上文选择的启动子和靶基因。在本发明中，“靶基因”是指为了产生物质以及改变或分析功能而期望其表达的基因，其可以是同源或异源的基因。例如，对于物质制备的目的，优选编码有用蛋白的基因作为靶基因。这类有用蛋白的例子包括干扰素、疫苗和激素。而且，靶基因还可以是编码产生有用物质的酶的基因。这种基因的例子是编码从丙酮酸产生乳酸的乳酸脱氢酶的基因。
为制备靶基因和上述启动子，可以使用本领域公知的任何技术。例如，当从原料中分离靶基因和上述启动子的时候，可通过从已由异硫氰酸胍方法制备的RNA合成cDNA的方法制备靶基因和上述启动子。此外，靶基因和上述启动子还可以利用基因组DNA作为模板，通过PCR扩增制备。如此获得的靶基因和上述启动子的DNA可以依赖于目的而直接利用，或者如果需要的话，可以在用限制酶消化后或在添加接头后利用。
在本发明中，包含由启动子核苷酸序列通过缺失、替代或添加1到40个核苷酸衍生而来的序列并具有启动子活性的DNA，也可以用作为启动子。启动子活性是指，通过将靶基因可操作地连接于启动子下游，当靶基因被插入到宿主中的时候，具有导致靶基因在宿主中或宿主体外产生基因产物的能力和功能。在这种DNA中，启动子活性所维持的水平允许该DNA在与包括全长核苷酸序列且不带任何突变(缺失、替代或添加)的启动子行使功能的条件相同的条件下实现几乎相同的应用。例如，这种DNA维持的启动子活性与全长序列相比高大约0.01到100倍、优选大约0.5到20倍、更优选大约0.5到2倍。
这种DNA可以如文献例如分子克隆(Molecular Cloning)(Sambrook等，冷泉港实验室出版社，纽约)所述制备。
例如，通过基于并起始于存在自动调整机制的基因的启动子的核苷酸序列、或者宿主生物体生长或发酵非必需的基因的启动子的核苷酸序列对1到40个核苷酸进行缺失、替代或添加的技术，例如通过定点突变方法，能够制备具有不同序列同时又维持启动子活性的变体。例如，对于可实现1到40个核苷酸替代的定点突变，可根据文献例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)5662-5666；国际公布WO85/00817；Nature 316(1985)601-605；Gene 34(1985)315-323；Nucleic Acids Res.13(1985)4431-4442；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)6409-6413或Science 224(1984)1431-1433中所描述的技术获得变体，然后可以利用该变体。另外，这些变体可利用商业上可获得的试剂盒(Mutan-G和Mutan-K(TAKARA BIO))制备。此外，易错聚合酶链式反应(易错PCR)也是公知的制备变体的方法，而且通过选择复制准确度低的条件，可以引入1到数个核苷酸的突变(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.PCR方法和应用(PCR Methods andApplications)2(1992)28-33；Malboeuf，C.M.等，Biotechniques 30(2001)1074-8；Moore，G.L.和Maranas C.D.J.Theor.Biol.7；205(2000)483-503)。
此外，利用包括与存在自动调整机制的基因的启动子、或者宿主生物4体生长或发酵非必需的基因的启动子的全部或部分核苷酸序列互补的序列的DNA作为探针(100到900个核苷酸)，在严谨条件下杂交，将允许新获得并利用与包括存在自动调整机制的基因的启动子、或者宿主生物体生长或发酵非必需的基因的启动子的核苷酸序列的DNA具有类似的功能(即，启动子活性)，并包括不同的核苷酸序列的DNA。这里，严谨条件是指其中，例如钠浓度在10到300mM之间，优选在20到100mM之间，并且温度在25到70℃之间，优选在42到55℃之间的条件。
如上所述获得的变体以及通过杂交获得的DNA是否具有启动子的活性可以通过下列操作确认。具体地，如上所述获得的DNA的启动子活性可以通过制备载体——其中优选地，将各种报道基因，例如，萤光素酶(LUC)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因和β-半乳糖苷酶(GAL)基因连接到启动子下游区域，利用载体将基因插入到宿主基因组中，然后测量报道基因的表达来确认。
3.靶基因和启动子的插入随后，上述存在自动调整机制的基因、或者宿主生物体生长或发酵非必需的基因被破坏，然后插入在该基因启动子控制下的靶基因，或者，所述基因用靶基因取代。
例如，可以将如上所述分离的靶基因可操作地连接到如上所述选择的启动子上，然后插入到宿主生物体的基因组中。“可操作地连接”是指将靶基因连接到上述启动子，从而靶基因在靶基因插入的宿主生物体中在上述启动子的控制下表达。靶基因和上述启动子可以利用本领域公知的任何技术插入。例如，靶基因和上述启动子可以利用重组载体插入到宿主生物体的基因组中。重组载体可以通过将靶基因和上述启动子连接(插入)到合适的载体中获得。用于插入靶基因的载体不特别限定，只要它们能够整合到宿主生物体的基因组中即可，所述载体包括质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA和酵母人工染色体DNA(YAC)。
质粒DNA的例子包括YIp-型大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)-酵母穿梭载体例如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135；来源于大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的质粒(ColE质粒例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A；p15A质粒例如pACYC177或pACYC184；或者pSC101质粒例如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)；以及来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的质粒(如pUB110或pTP5)。噬菌体DNA的例子包括λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11或λZAP)、fX174、M13mp18和M13mp19。反转录转座子的例子是Ty因子。YAC载体的例子是pYACC2。
为了将靶基因和上述启动子插入到载体中，举例来说，本文所用的方法包括，首先，用合适的限制性酶切割纯化的DNA，然后将该产物插入到合适的载体DNA的限制性位点或多克隆位点中，以便将产物连接到载体上。
靶基因应当掺入到载体中，从而该基因在上文所选择的启动子的控制下行使功能。因此，除了上文所选择的启动子、靶基因和终止子之外，如果需要，可以将顺式元件例如增强子、剪接信号、polyA添加信号、核糖体结合序列(SD序列)等连接到重组载体上。此外，还可以连接指示载体保留在细胞之内的选择标记。另外，选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因。另外，标记基因的例子是用于色氨酸合成的基因(TRP1基因)，但不局限于此。还可以使用其它标记基因，例如，具有营养缺陷型能力的URA3基因、ADE2基因和HIS3基因，或者具有药物抗性能力的G418抗性基因。
终止序列的例子是甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)的终止基因，但在本发明中不局限于此。可以利用任何终止序列，只要它是能够在宿主生物体内利用的终止序列即可。
如上所述，能够制备重组载体，以便可用于在宿主生物体中表达靶基因。通过利用重组载体转化宿主生物体，靶基因能够在上文所选择的启动子的控制下在宿主生物体中表达。
当利用细菌例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)作为宿主时，重组载体优选由启动子、核糖体结合序列、靶基因和转录终止子序列组成。另外，还可以含有调节启动子的基因。
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的例子包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)K12和DH1。芽孢杆菌属(Bacillus)的例子是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。将重组载体引入细菌的方法不特别限定，只要它是将DNA引入细菌的方法。这种方法的例子包括利用钙离子的方法和电穿孔法。
当利用酵母作为宿主时，举例来说，可以利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyce pombe)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)。将重组载体引入酵母的方法不特别限定，只要它是将DNA引入酵母的方法。这种方法的例子包括电穿孔法、原生质球法和醋酸锂法。
当利用昆虫或动物作为宿主时，举例来说，可使用磷酸钙法、脂转染法或电穿孔法作为将重组载体引入宿主的方法。
当利用植物作为宿主时，举例来说，可使用土壤杆菌法、基因枪法、PEG法或电穿孔法作为将重组载体引入宿主的方法。
当利用昆虫、动物(人除外)或植物个体作为宿主时，可根据本领域公知的技术引入重组载体，以产生转基因动物或植物。将重组载体引入动物个体的方法的例子包括微注射进受精卵的方法、引入ES细胞的方法以及通过核移植将已引入培养细胞的细胞核引入受精卵的方法。
对如上所述引入重组载体的宿主生物体进行有关引入了在上文所选启动子控制之下的靶基因的株系(克隆)的选择。具体地，利用上述选择标记作为指示选择转化体。
靶基因是否在上文所选择的启动子的控制之下被掺入可以通过PCR(聚合酶链式反应)或Southern杂交确认。例如，由转化体制备DNA，设计引入的DNA的特异性引物，然后利用引物和所制备的DNA进行PCR。随后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或者毛细管电泳，用溴化乙锭、SYBR绿溶液等染色，然后作为单个条带进行检测，这样可以确认引入的DNA。此外，利用预先用荧光染料等标记的引物进行PCR，从而可以检测扩增产物。此外，本文还可以使用的方法包括将扩增产物结合到固相例如微量培养板上，然后通过荧光反应、酶反应等确认扩增产物。
如上所述，在存在自动调整机制的基因的启动子、或者宿主生物体生长或发酵非必需的基因的启动子的控制下，靶基因被插入到基因组中(基因组整合)，从而靶基因在宿主生物体中表达。由于PDC1启动子是一个非常强的启动子，当选择PDC1启动子时，靶基因即使是以单拷贝的形式插入到基因组中也能获得高度表达。此外，由于启动子被选择用于本发明的内源基因是生长或发酵非必需的，即使它被破坏或用靶基因取代时，宿主生物体仍能够继续生长和发酵，从而能够长时间表达靶基因。
4.丙酮酸脱羧酶1基因(PDC1)启动子本发明的启动子是从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离的丙酮酸脱羧酶1基因的启动子(下文称之为PDC1启动子)。丙酮酸脱羧酶是参与酵母乙醇发酵途径的酶。一般地，在PDC1、PDC5和PDC6基因中，只有PDC1发挥功能(见“1.启动子的选择”部分)。我们集中于虽然丙酮酸脱羧酶仅通过PDC1的表达产生，但因为自动调整机制，乙醇仍大量产生的事实，然后确定了PCD1的启动子区。
如下文所述确定并分离PDC1启动子。首先利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的公共基因组数据库(酵母属基因组数据库)，构建同源重组载体，从而靶基因能够插入到PDC1启动子下游。引入载体，选择具有高表达量的靶基因的菌株，通过PCR获得PDC1启动子片段，然后用测序仪(ABI 310 Genetic Analyzer)确定与PDC1启动子相应的推断区域的核苷酸序列。
PDC1启动子含有包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA。在分离PDC1启动子之后，可根据核酸合成的技术通过化学合成获得此DNA。
而且，本发明的PDC1启动子还包括含有从SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列通过缺失、替代或添加1到40个核苷酸分离的核苷酸序列，并具有启动子活性的DNA。启动子活性是指，通过将靶基因可操作地连接于启动子下游，当靶基因被插入到宿主中的时候，具有在宿主中或宿主体外产生靶基因的基因产物的能力和功能。在这种DNA中，启动子活性维持在允许该DNA在与包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的启动子行使功能的条件相同的条件下实现几乎相同的应用的水平上。例如，这种DNA维持的启动子活性与包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA相比高大约0.01到100倍、优选大约0.5到20倍、更优选大约0.5到2倍。
这种DNA可以如文献例如分子克隆(Molecular Cloning)(Sambrook等编辑，(1989)冷泉港实验室出版社，纽约)所述，通过参照SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列制备。
例如，通过基于并起始于上述SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列对1到40个核苷酸进行缺失、替代或添加的技术，例如通过如上文“2.靶基因和启动子的制备”部分所描述的定点突变方法，能够制备具有不同序列同时又维持启动子活性的变体。
此外，利用包括与全部或部分SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列互补的序列的DNA作为探针(100到900个核苷酸)，在严谨条件下杂交，将允许新获得并利用与包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA具有类似的功能(即，启动子活性)，但包括不同的核苷酸序列的DNA。这里，严谨条件是指其中，例如钠浓度在10到300mM之间，优选在20到100mM之间，并且温度在25到70℃之间，优选在42到55℃之间的条件。
如上所述获得的变体以及通过杂交获得的DNA是否具有启动子的活性可以通过如上文“2.靶基因和启动子的制备”部分所描述的技术确认。
本发明的PDC1启动子能够利用自动调整机制用来表达在该启动子控制下的靶基因，而且能够用作为普通启动子。
5.重组载体的构建本发明的启动子可用作为普通启动子，从而它能够被用作为启动子以实现靶基因的高表达。本发明的重组载体可通过将本发明的PDC1启动子和靶基因连接(插入)到合适的载体中获得。“靶基因”的例子包括编码蛋白的核酸或其反义核酸，编码反义RNA诱饵(RNA decoy)及核酶的核酸。
为制备物质，编码有用蛋白的核酸优选用作为靶基因。这种有用蛋白的例子包括干扰素和疫苗。另外，编码蛋白的核酸可以是编码产生有用物质的酶的基因的核酸。这种核酸的例子是编码从丙酮酸产生乳酸的乳酸脱氢酶的基因的核酸。
反义核酸具有与任何RNA(基因组RNA和mRNA)互补的核苷酸序列，并与这种RNA形成双链，藉此抑制RNA编码的基因信息的表达(转录和翻译)。作为反义序列，可以利用任何核酸物质，只要它阻断基因的翻译或转录。这种核酸物质的例子包括DNA、RNA或任何核酸模拟物。因此，设计反义核酸(寡核苷酸)序列以便与表达待受抑制的基因的部分序列互补。
所设计的反义核酸序列的长度不特别限定，只要它能够抑制基因的表达，并且，例如，长度可以在10到50个核苷酸之间，优选在15到25个核苷酸之间。寡核苷酸能够通过已知技术容易地化学合成。
鉴于本发明的目的，还可以利用反义寡核苷酸的分子类似物。该分子类似物具有高稳定性、分布特异性等。这种分子类似物的例子是结合有化学反应基团例如乙二胺四乙酸铁(II)钠盐三水合物的反义寡核苷酸。
编码RNA诱饵(RNA decoy)的核酸是指编码转录因子结合的蛋白的基因，或者具有转录因子结合位点的序列或其类似序列的RNA。它们作为“诱饵(decoy)”被引入到细胞内，以便抑制转录因子的作用。
核酶是指能够切割特定蛋白的mRNA并抑制该特定蛋白翻译的核酸。核酶可以从编码特定蛋白的基因序列设计。例如，为设计锤-头状核酶，可利用FEBS Letter，228，228-230(1988)中描述的方法。此外，不仅锤-头状核酶，而且那些切割特定蛋白的mRNA(例如发夹-型核酶或三角形核酶)和抑制该特定蛋白翻译的核酸都能够用于本发明。
用于插入靶基因的载体不特别限定，只要它是能够被整合进染色体的载体类型，即能够如上文“靶基因和启动子的插入”部分所描述的，将靶基因整合到宿主生物体的基因组中的载体，或者是本领域公知的质粒型载体即可。这种载体的例子包括质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA和酵母人工染色体DNA(YAC)。
质粒DNA的例子包括YCp-型大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)-酵母穿梭载体例如pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123，YEp-型大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)-酵母穿梭载体例如pYES2或YEp13，YIp-型大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)-酵母穿梭载体例如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135，来源于大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的质粒(如，ColE质粒例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A；p15A质粒例如pACYC177或pACYC184；或者pSC101质粒例如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)，以及来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(如pUB110或pTP5)。噬菌体DNA的例子包括λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11或λZAP)、fX174、M13mp18和M13mp19。反转录转座子的例子是Ty因子。YAC载体的例子是pYACC2。
为了将本发明的PDC1启动子和靶基因插入到载体中，举例来说，可以利用包括首先用合适的限制性酶切割纯化的DNA，然后将该产物插入到合适的载体DNA的限制性位点或多克隆位点中以便将产物连接到载体上的方法。
本发明的PDC1启动子应当掺入到载体中，以便载体可操作地表达靶基因，以行使靶基因的功能。“可操作地表达”是指将靶基因和PDC1启动子相互连接起来，然后将它们掺入到载体中，从而靶基因在PDC1启动子的控制下在插入靶基因的宿主生物体中表达。因此，对于本发明的载体，除了PDC1启动子、靶基因和终止子之外，如果必要，可以连接顺式元件例如增强子、剪接信号、polyA添加信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。此外，选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因。
6.重组载体的转化本发明的转化体可以通过将本发明的重组载体引入宿主中获得，从而靶基因能够在PDC1启动子的控制下表达。此处宿主不特别限定，只要它能够使靶基因在本发明的PDC1启动子的控制下表达即可。这种宿主的例子包括属于埃希氏杆菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)、芽孢杆菌属(Bacillus)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的细菌。此外，宿主的例子包括酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，以及动物细胞例如COS细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。可替代地，还可以利用昆虫细胞例如Sf9和Sf21。
当利用细菌例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)作为宿主时，优选本发明的重组载体在细菌中自主复制，并且同时由本发明的启动子、核糖体结合序列、靶基因和转录终止序列组成。另外，还可以含有调节本发明的启动子的基因。
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的例子包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)K12和DH1，而芽孢杆菌属(Bacillus)的例子是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。将重组载体引入细菌的方法不特别限定，只要它是将DNA插入细菌的方法。
当利用酵母作为宿主时，举例来说，可以利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyce pombe)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)等。将重组载体引入酵母的方法不特别限定，只要它是将DNA引入酵母的方法。
当利用动物细胞作为宿主时，可以利用猿COS-7细胞和Vero细胞、CHO细胞、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。将重组载体引入动物细胞的方法的例子包括电穿孔法、磷酸钙法和脂转染法。
当利用昆虫作为宿主时，利用Sf9细胞、Sf21细胞等。就将重组载体引入昆虫细胞的方法而言，举例来说，可以利用磷酸钙法、脂转染法、电穿孔法等。
当利用植物作为宿主时，植物的例子包括，但不限于，番茄和烟草。就将重组载体引入植物细胞的方法而言，举例来说，可以利用土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等。
当利用昆虫、动物(人除外)或植物个体作为宿主时，可根据本领域公知的技术引入重组载体，以产生转基因动物或植物。
对如上所述其中引入了重组载体的宿主生物体进行选择，以便获得引入了在上文所选启动子控制之下的靶基因的株系(克隆)。具体地，利用上述选择标记作为指示选择转化体。如此获得的转化体能够在PDC1启动子的控制下高水平且稳定地表达靶基因，从而转化体能够如下文所述被用来制备靶基因所编码的蛋白，或者用于其它目的，例如靶基因的功能分析。
7.基因表达产物或者由表达产物产生的物质的制备接下来，描述制备基因表达产物或者由表达产物产生的物质的方法。在本发明中，基因表达产物或者由表达产物产生的物质可以通过培养如上文所述获得的转化体，并从获得的培养物中收集基因表达产物或者由表达产物产生的物质获得。“培养物”是指培养上清液以及，任何培养细胞或培养的生物体，或者破碎细胞或破碎的生物体。培养本发明的转化体的方法根据适用于培养宿主的常规方法进行。
就培养利用微生物例如酵母作为宿主获得的转化体的培养基而言，可以利用天然培养基或者合成培养基，只要培养基含有微生物能够利用的碳源、氮源、无机盐等，并允许有效培养转化体即可。就碳源而言，可以利用碳水化合物例如葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉，有机酸例如乙酸或丙酸，或者醇例如乙醇或丙醇。就氮源而言，可以利用无机酸或有机酸的铵盐例如氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵或磷酸铵，或者其它含氮化合物以及蛋白胨、肉膏、玉米浆等。就无机物而言，可以利用磷酸一氢钾(potassiumprimary phosphate)、磷酸二氢钾(potassium secondary phosphate)、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常通过摇瓶培养、通风搅拌培养等在有氧条件下于30℃进行6到24小时。培养期间，pH值维持在4.0和6.0之间。pH利用无机或有机酸、碱溶液等调整。培养期间，如果必要，可以向培养基中添加抗生素例如氨卡青霉素或四环素。
就培养利用动物细胞作为宿主获得的转化体的培养基而言，举例来说，利用通常所用的RPMI 1640培养基、DMEM培养基，或者补充有胎牛血清等的这些培养基之一。培养通常在存在5％CO2的条件下于37℃进行1到30天。培养期间，如果必要，可以向培养基中添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。
在培养完成后，可通过常规的蛋白纯化技术等从培养物中收集基因产物或由表达产物产生的物质。举例来说，当产生在转化细胞内时，通过标准方法例如超声波、研磨破碎法或者压力破碎法等破碎细胞，以便提取基因产物或由表达产物产生的物质。如果必要，添加蛋白酶抑制剂。此外，当产物或物质产生在培养上清液中时，可以使用培养液本身。随后，对溶液进行过滤、离心等以除去固体，然后，如果必要，通过鱼精蛋白悬浮等除去核酸。
接着，添加硫酸铵、醇、丙酮等用于分级分离。收集沉淀，然后获得粗蛋白溶液。对蛋白溶液进行各种层析、电泳等，藉以获得纯化的酶样品。纯化的感兴趣基因产物或者由表达产物产生的物质可以通过，举例来说，适当地选择或组合利用Sephadex、Ultrogel、Biogel等的凝胶过滤、离子交换层析、利用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳以及利用诸如亲合层析或反相层析等的分级分离方法获得。不过，上文的培养方法和纯化方法仅仅是例子，而此处可用的方法不局限于此。
另外，举例来说，纯化的基因产物或由表达产物产生的物质的氨基酸序列可通过氨基酸分析的公知方法，例如根据Edman降解法确定氨基酸序列的自动方法确认。
附图的简短说明
图1A到1C显示了染色体整合型载体pBTRP-PDC1-LDH的构建。
图2A到2B显示了染色体整合型载体pBTRP-PDC1-LDH的构建。
图3显示了当用载体pBTRP-PDC1-LDH转化酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时所得的菌株的基因组结构。
图4显示了染色体整合型载体pAUR-LacZ-T123PDC1(A)、pAUR-LacZ-OC2PDC1(B)和pAUR-LacZ-YPHPDC1(C)的构建。
图5A和5B显示了分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)、分离自IFO2260菌株的PDC1启动子(968bp)及分离自YPH菌株的PDC1启动子(968bp)的基因序列的比较。
图6显示了插入了分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)、分离自IFO2260菌株的PDC1启动子(968bp)及分离自YPH菌株的PDC1启动子(968bp)的转化体在传代培养前的β-半乳糖苷酶活性。
图7显示了插入了分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)、分离自IFO2260菌株的PDC1启动子(968bp)及分离自YPH菌株的PDC1启动子(968bp)的转化体在传代培养后的β-半乳糖苷酶活性。
实施本发明的最佳方式本发明将进一步通过实施例在下文具体描述。不过，本发明的范围不受限于这些实施例。
实施例[实施例1]分离PDC1P片段用以构建pBTRP-PDC1-LDH在本实施例中，确定和分离了丙酮酸脱羧酶1基因的启动子区(PDC1P)。PDC1P片段通过PCR扩增法利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH菌株(Stratagene)的基因组DNA作为模板分离。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH菌株的基因组DNA利用Fast DNA试剂盒(Bio 101)(一种基因组制备试剂盒)根据所附的操作方案制备。DNA浓度利用Ultro spec 3000分光光度计(AmershamPharmacia Biotech)测量。
在PCR反应中，利用被认为在产生扩增片段时具有高准确度的Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA BIO)作为扩增酶。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH菌株的基因组DNA(50ng/样品)通过上文的技术制备，将其与引物DNA(50pmol/样品)和Pyrobest DNA聚合酶(0.2单位/样品)配成总计50μl的反应体系。将反应液置于PCR扩增系统(Gene Amp PCR system 9700，PE Applied Biosystems)进行DNA扩增。PCR扩增系统的反应条件为96℃2分钟，接着是25个循环的96℃30秒、55℃30秒和72℃90秒，然后4℃。对PDC1引物的扩增片段进行1％TBE琼脂糖凝胶电泳以确认基因扩增片段。另外，这个反应所用的引物DNA是合成DNA(Sawady Technology)，并且引物的DNA序列如下●在PDC1P-LDH-U(31mer且Tm 58.3℃)末端添加限制性酶BamHI位点ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C(SEQ IDNO2)●在PDC1P-LDH-D(31mer且Tm 54.4℃)末端添加限制性酶EcoRI位点ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(SEQ IDNO3)[实施例2]构建含有启动子和靶基因的重组载体在本实施例中，利用分离自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的乳酸脱氢酶基因(LDH基因)作为靶基因在分离自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的丙酮酸脱羧酶1基因(PDC1)启动子序列的控制下构建重组载体。
为这个实施例新近构建了染色体-整合型载体，并命名为pBTRP-PDC1-LDH。构建这个载体的实施例将在下文详细描述。另外，本实施例的略图示于图1和2。不过，载体构建的操作不限于此。
在构建载体时，所需的基因片段(PDC1基因的971bp启动子片段(PDC1P)和PDC1基因下游区的518bp片段(PDC1D))通过PCR扩增法利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH菌株的基因组DNA作为模板分离，如上所述。PCR扩增操作描述如上。为扩增PDC1基因下游区片段，利用如下引物。
●在PDC1D-LDH-U(34mer且Tm 55.3℃)末端添加限制性酶XhoI位点ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C (SEQID NO4)●在PDC1D-LDH-D(31mer且Tm 54.4℃)末端添加限制性酶ApaI位点ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(SEQ IDNO5)上述反应中获得的PDC1P和PDC1D基因扩增片段分别通过乙醇沉淀处理纯化。然后，PDC1扩增片段和PDC1D扩增片段分别利用限制性酶BamHI/EcoRI和限制性酶XhoI/ApaI通过限制性酶反应处理。另外，下文所用的酶都是由TAKARA BIO公司生产的。此外，包括乙醇沉淀处理和用限制性酶处理的一系列操作的详细手册是根据分子克隆实验室指南第2版(Molecular CloningA Laboratory Manual second edition)(Maniatis等，冷泉港实验室出版社，1989)使用的。
在构建载体时的一系列反应操作是根据一般的DNA亚克隆方法进行的。具体地，向用限制性酶BamHI/EcoRI(TAKARA BIO)以及碱性磷酸酶(BAP，TAKARA BIO)，一种脱磷酸化酶，处理过的pBluescriptIISK+载体(TOYOBO)，通过T4 DNA连接酶反应，连接通过上述PCR法扩增并随后用限制性酶处理过的PDC1P片段(图1A)。T4 DNA连接酶反应利用LigaFast快速DNA连接系统(Promega)根据所附的方案进行。
接下来，经过连接反应的溶液然后用于转化感受态细胞。这里所用的感受态细胞是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109菌株(TOYOBO)，并且转化根据所附的方案进行。所获得的培养液接种于含有100μg/ml抗生素(氨苄青霉素)的LB板，之后过夜培养。长出的菌落通过菌落PCR法利用插入片段的引物DNA确认，而通过Miniprep制备的质粒DNA溶液通过用限制性酶处理确认，藉此分离pBPDC1P载体，它就是靶载体(图1B)。
随后，LDH基因片段通过用限制性酶EcoRI/AatII和T4 DNA聚合酶，(一种末端修饰酶)处理由TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA构建的pYLD1载体获得，并通过与上述相似的操作被亚克隆到用限制性酶EcoRI和T4 DNA聚合酶(一种末端修饰酶)类似处理过的pBPDC1P载体中，藉此制备pBPDC1P-LDH I载体(图1C)。另外，上述pYLD1载体被引入大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)中(名称“E.coli.pYLD1”)，并依据布达佩斯条约以FERM BP-7423保藏号国际保藏于国立高级工业科技研究院(National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology)(1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的国际专利生物保藏单位；(原始保藏日期1999年10月26日)。接着，该载体用XhoI/ApaI处理，然后其上连接扩增的PDC1D片段，藉此制备pBPDC1P-LDH II载体(图2A)。最后，TRP1标记片段——它通过用AatII/SspI和T4 DNA聚合酶处理pRS404载体(Stratagene)获得——被连接到用EcoRV处理过的pBPDC1P-LDH II载体上，藉此构建最终构建产物，即待引入染色体的pBTRP-PDC1-LDH载体(图2B)。
为确认如此构建的染色体整合型pBTRP-PDC1-LDH载体，测定了核苷酸序列。利用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PE AppliedBiosystems)作为核苷酸序列分析仪，并根据该分析仪所附的手册进行测序，所述手册中可以找到有关制备样品的方法、利用仪器的方法等的细节。待用作为样品的载体DNA由碱抽提法制备。DNA用GFX DNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)柱纯化，DNA浓度用Ultro spec 3000分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech)测量，然后使用。
向宿主中引入重组载体酵母色氨酸依赖型菌株，IFO2260菌株(该菌株在大阪发酵所注册)，作为宿主，在10ml YPD培养基中于30℃培养至对数生长期。在收集并用TE缓冲液洗涤后，添加0.5ml TE缓冲液和0.5ml 02.M的醋酸锂，然后于30℃振荡培养1小时。随后，添加用限制性酶ApaI和SpeI处理过的pBTRP-PDC1-LDH。
质粒悬液于30℃振荡培养30分钟，添加150ml 70％的聚乙二醇4000，然后充分搅拌溶液。于30℃振荡培养1小时之后，于42℃给予热激5分钟。细胞洗涤并悬浮于200ml水中。将悬液涂布于选择培养基上。
在用选择培养基对产生的菌落进行分离获得克隆后，通过PCR获得在PDC1启动子下游插入了LDH的菌株。此外，在形成芽孢的培养基中进行芽孢形成，利用同宗配合特性进行二倍体形成，然后得到在二倍体的两条染色体中都引入了上述载体的菌株。
酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)转化有图2所示pBTRP-PDC1-LDH并且基因插入到基因组中的事实通过PCR确认。上述载体在基因组中的结构显示于图3。
通过表达产物制备物质所获得的转化体以1％的细胞浓度接种于YPD液体培养基中(葡萄糖10％)，然后于30℃静置培养2天。对(1)未引入载体的菌株、(2)用YEP载体插入LDH的菌株(在常规GAP启动子控制下插入LDH的系统)、3)用pBTRP-PDC1-LDH插入LDH的菌株(在PDC1启动子控制下插入LDH的系统)生产的乳酸量进行比较。结果示于表1。
表1.引入LDH和传代培养的不同方法所导致的乳酸生产量的比较
虽然未引入载体的菌株(1)不生产乳酸，引入LDH的菌株(2)和(3)生产乳酸。此外，用染色体-整合型载体在PDC1启动子控制下插入了LDH的菌株(3)的乳酸生产水平比用YEP载体插入了LDH的菌株(2)的生产水平高2.5倍。
而且，为确认由该方法引入的性状的稳定性的目的，在YPD板上传代培养3次，然后通过PCR检测基因转移和生产的乳酸量。虽然用YEP载体插入LDH的系统(2)停止生产乳酸，但导致表达LDH的菌株(3)维持与传代培养前相同量的乳酸产量。
而且，通过PCR证实基因组结构没有变化。因而，通过pBTRP-PDC1-LDH表达LDH的系统(3)可以说是稳定存在并允许基因的高表达。
基于上述结果，证明LDH在利用染色体-整合型(载体)的情况下稳定且高水平地表达，其中可操作地将LDH连接于本发明的PDC1启动子上。
分离含有PDC1启动子序列的变体序列在这个实施例和以下的实施例中，分离了具有数个核苷酸差别的3种PDC1启动子序列。然后，制备了设计的在启动子之后连接LacZ基因的染色体-整合型载体。转化的酵母利用这些载体通过将启动子和1拷贝的基因插入到染色体上相同的位置构建。测量了每个转化酵母的β-半乳糖苷酶活性，并比较了3种启动子活性。
在这个实施例中，通过PCR扩增法，利用引入了pBTRP-PDC1-LDH的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(实施例3中制备的菌株)、IFO2260菌株(在大阪发酵所注册的菌株)和YPH菌株(Stratagene)的基因组DNA作为模板分离PDC1启动子序列。
每种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(引入pBTRP-PDC1-LDH的菌株、IFO2260菌株和YPH菌株)的基因组DNA的制备方法和PCR扩增方法通过与实施例1和2中所使用的那些相似的技术进行。
另外，反应所用的引物DNA的核苷酸序列如下。
扩增分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子●在PDC1 PrFrag-U2(32mer且Tm 64.4℃)末端添加限制性酶SalI位点AAA TTT GTC GAC AAG GGT AGC CTC CCC ATA AC(SEQ IDNO6)●在PDC1 PrFrag-D2(31mer且Tm 61.1℃)末端添加限制性酶SalI位点ATA TAT GTC GAC GAG AAT TGG GGG ATC TTT G(SEQ IDNO7)扩增IFO2260菌株-来源的和YPH菌株-来源的PDC1启动子●在PDC1 PrFrag-U2(32mer且Tm 64.4℃)末端添加限制性酶SalI位点AAA TTT GTC GAC AAG GGT AGC CTC CCC ATA AC(SEQ IDNO6)●在PDC1 PrFrag-D(43mer且Tm 62.5℃)末端添加限制性酶SalI位点TTT AAA GTC GAC TTT GAT TGA TTT GAC TGT GTT ATTTTG CGT G(SEQ ID NO8)[实施例6]构建含有变体启动子序列的载体用以分析β-半乳糖苷酶在这个实施例中，在3种分离的PDC1启动子序列的控制下，构建连接有报道基因的载体。就报道基因而言，利用的是β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)。
为这个实施例新近构建的待引入染色体的载体命名为pAUR-LacZ-T123PDC1、pAUR-LacZ-OC2PDC1和pAUR-LacZ-YPHPDC1。构建载体的实施例将在下文详细描述。另外，这个实施例的略图显示于图4。不过，构建载体的操作不局限于此。
构建载体的一系列反应操作根据常规DNA亚克隆法进行。用限制性酶切割pSV-β-半乳糖苷酶对照载体(Promega)以获得LacZ片断。然后，片断被钝端化，从而构建pAUR-LacZ载体。如此构建的pAUR-LacZ载体用SalI(TAKARA BIO)和碱性磷酸酶(BAP，TAKARA BIO)(一种脱磷酸化酶)处理。接着，实施例5中获得的3种启动子序列，即，分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)、分离自IFO2260菌株的PDC1启动子(968bp)以及分离自YPH菌株的PDC1启动子(968bp)，分别用限制性酶SalI(TAKARA BIO)处理，然后通过T4 DNA连接酶反应连接到pAUR-LacZ载体上。T4 DNA连接酶反应利用LigaFast快速DNA连接系统(Promega)根据所附的方案进行。
感受态细胞利用如此获得的连接反应液转化，然后通过菌落PCR法获得靶标构建载体。上述一系列操作通过与实施例2中所使用的那些类似的技术进行。
对构建的载体进行核苷酸序列分析，然后比较分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)、分离自IFO2260菌株的PDC1启动子(968bp)以及分离自YPH菌株的PDC1启动子(968bp)的基因序列。序列的比较结果显示于图5A和B。另外，核苷酸序列分析通过与实施例2中所使用的技术类似的操作进行。
分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)与包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的PDC1启动子(971bp)有12个核苷酸的差别。具体地，分离自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1启动子(983bp)由在SEQ ID NO1启动子序列的两端添加了限制性酶SalI位点(GTCGAC)的序列构成。
此外，IFO2260菌株来源的PDC1启动子(968bp)与包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的PDC1启动子有30个核苷酸的差别，其中具体地，SEQ ID NO1启动子序列的861位的鸟嘌呤(G)由胞嘧啶(C)替代，894位的胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)替代，925位的腺嘌呤由胸腺嘧啶(T)替代，并在972位核苷酸之后添加了15个核苷酸的序列(GATCCCCCAATTCTC)。此外，IFO2260菌株来源的PDC1启动子序列由在SEQ ID NO1启动子序列的两端添加了限制性酶SalI位点(GTCGAC)的序列构成。
YPH菌株来源的PDC1启动子(968bp)与包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的PDC1启动子有37个核苷酸的差别，其中具体地，SEQID NO1启动子序列的179位的胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)替代，214位的腺嘌呤(A)由鸟嘌呤(G)替代，216位的鸟嘌呤(G)由腺嘌呤(A)替代，271位的胸腺嘧啶(T)由胞嘧啶(C)替代，344位的鸟嘌呤(G)由腺嘌呤(A)替代，490位的腺嘌呤(A)由鸟嘌呤(G)替代，533位的胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)替代，566位的胸腺嘧啶(T)由胞嘧啶(C)替代，660位的鸟嘌呤(G)由胞嘧啶(C)替代，925位的腺嘌呤(A)由胸腺嘧啶(T)替代，并在972位核苷酸之后添加了15个核苷酸的序列(GATCCCCCAATTCTC)。此外，YPH菌株来源的PDC1启动子序列由在SEQ ID NO1启动子序列的两端添加了限制性酶SalI位点(GTCGAC)的序列构成。
向宿主中引入重组载体酵母色氨酸依赖型菌株，IFO2260菌株(该菌株在大阪发酵所注册)，作为宿主，在10ml YPD培养基中于30℃培养至对数生长期。在收集并用TE缓冲液洗涤后，添加0.5ml TE缓冲液和0.5ml 02.M的醋酸锂，然后于30℃振荡培养1小时。随后，添加用限制性酶Bst11 07I(TAKARABIO)处理过的pAUR-LacZ-T123PDC1P、pAUR-LacZ-YPHPDC1 P和pAUR-LacZ-OC2PDC1P。
质粒悬液于30℃振荡培养30分钟，添加150μl 70％的聚乙二醇4000，然后充分搅拌溶液。于30℃振荡培养1小时之后，于42℃给予热激5分钟。细胞于30℃在1ml YPD培养基中培养12小时。洗涤培养液，然后悬浮于200μl无菌水中。将悬液涂布于aureobasidin A选择培养基上。向培养基中添加的aureobasidin A浓度为0.4μg/ml。
获得的菌落利用aureobasidin A选择培养基分离，然后对得到的菌落进行PCR方法，藉此获得靶标菌株。
测量基因重组菌株中β-半乳糖苷酶活性对上述转化体和非转化体测量β-半乳糖苷酶活性。每种菌株在2mlYPD液体培养基(葡萄糖2％)中于30℃培养20小时。收集它们并加入500μl 50mM的Tris-HCl和玻璃珠(425到600微米，酸洗的，SIGMA)，并于4℃震荡15分钟。
通过离心收集该溶液的上清，然后测量这些上清中的β-半乳糖苷酶活性。活性测量利用β-半乳糖苷酶酶分析系统(Promega)根据所附的方案进行。计算活性值(ABS 600nm＝1.0)，结果显示于图6(传代培养前)和图7(传代培养后)。
基于上述结果，揭示即使其上添加了数十个核苷酸、或者具有不同序列的PDC1启动子序列仍具有稳定的启动子活性。所以，可以说存在自动调整机制的基因的启动子、或者宿主生物体生长或发酵非必需的基因的启动子能够被利用，即使它不具有全长的序列。
兹将本文引用的所有出版物、专利和专利申请全文并入作为参考。
工业实用性根据本发明，基因能够稳定地引入宿主生物体中并在其中高水平表达，而不影响宿主的生长和发酵。因此，提供了制备物质及改变或分析功能的有效工具。此外，根据本发明，提供了在宿主中激活转录的启动子。本发明的启动子允许以小的拷贝数引入宿主的基因得以高表达，从而它有效地提高了所制备的物质的量。
序列表说明
SEQ ID NO1合成DNASEQ ID NO2合成DNASEQ ID NO3合成DNASEQ ID NO4合成DNASEQ ID NO5合成DNASEQ ID NO6合成DNASEQ ID NO7合成DNASEQ ID NO8合成DNA
序列表<110>丰田自动车株式会社(TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA)<120>实现基因高表达的系统<130>PH-1638PCT<150>JP 2001-286637<151>2001-09-20<150>JP 2001-287159<151>2001-09-20<150>JP 2002-128323<151>2002-04-30<150>JP 2002-128286<151>2002-04-30<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>971<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>1aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg60aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca120aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct180ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa240taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa300tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt360tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg420gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc480gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg540ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga600atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg660tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta720actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac780ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatataa acaaggctct ttcactctcc840ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc900aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc960
ccccaattctc 971<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c31<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31
<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6aaatttgtcg acaagggtag cctccccata ac 32<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7atatatgtcg acgagaattg ggggatcttt g31<210>8<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8tttaaagtcg actttgattg atttgactgt gttattttgc gtg 4权利要求
1.表达基因的方法，其包括在存在自动调整机制的基因的启动子，或者宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子的控制下将靶基因插入到基因组中。
2.权利要求1的表达基因的方法，其中启动子是含有如下序列并具有启动子活性的DNA，所述序列为由存在自动调整机制的基因的启动子的核苷酸序列，或者由宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子的核苷酸序列，通过缺失、替代或添加1到40个核苷酸衍生而成的序列。
3.权利要求1的表达基因的方法，其中启动子是能够在严谨条件下与包含如下序列的DNA杂交的，并具有启动子活性的DNA，所述序列互补于全部或部分的存在自动调整机制的基因的启动子的核苷酸序列或者宿主生物体生长或发酵非必需基因的启动子的核苷酸序列。
4.权利要求1至3中任何一项的表达基因的方法，其中存在自动调整机制的基因的启动子是丙酮酸脱羧酶1基因的启动子。
5.权利要求1至3中任何一项的表达基因的方法，其中对生长非必需的基因的启动子是编码硫氧还蛋白的基因的启动子。
6.权利要求1至5中任何一项的表达基因的方法，其中宿主生物体是细菌、酵母、昆虫、动物和植物中的任一种。
7.权利要求6的表达基因的方法，其中酵母属于酵母属(Saccharomyces)。
8.包含下列DNA(a)、(b)和(c)中任意一个的启动子(a)包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA，(b)包含由SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列通过缺失、替代或添加1到40个核苷酸所衍生而成的核苷酸序列、并具有启动子活性的DNA，和(c)能够在严谨条件下与包含互补于全部或部分的SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的序列的DNA杂交、并具有启动子活性的DNA。
9.重组载体，其含有权利要求8的启动子。
10.权利要求9的重组载体，其中靶基因可操作地与重组载体连接。
11.权利要求9或10的重组载体，它是质粒载体或病毒载体。
12.权利要求10或11的重组载体，其中靶基因是选自编码蛋白的核酸或其反义核酸、编码反义RNA诱饵及核酶的核酸中的任何一种核酸。
13.转化体，它可通过利用权利要求9至12中任何一项的重组载体转化宿主获得。
14.权利要求13的转化体，其中宿主是细菌、酵母、动物、昆虫或植物。
15.权利要求13的转化体，其中酵母属于酵母属(Saccharomyces)。
16.制备靶基因的表达产物或者由该表达产物产生的物质的方法，其包括在培养基中培养权利要求13至15中任何一项的转化体，并从获得的培养产物中回收靶基因的表达产物或者由该表达产物产生的物质。
全文摘要
本发明涉及利用基因工程技术将基因插入到宿主生物体内并表达该基因的方法。本发明进一步涉及新的启动子，含有该启动子和靶基因的重组载体，含有该重组载体的转化体，以及利用该转化体制备有用基因产物或有用物质的方法。
文档编号C12N1/21GK1571838SQ0282080
公开日2005年1月26日 申请日期2002年9月13日 优先权日2001年9月20日
发明者斋藤聪志, 早乙女理, 保谷典子, 松尾康生, 石田亘广, 平井正名, 北本胜彦 申请人:丰田自动车株式会社