专利名称：修饰高等植物基因组的方法
技术领域：
本发明涉及用于基于同源重组的修饰高等植物基因组的基因构建体，及其利用携带该基因构建体的植物转化载体来生产具有基因组被修饰的高等植物的方法。本发明涉及一种有效的和可重复的方法，其中以植物的内源基因组序列为靶标来产生没有改变其原始基因座的同源重组体。
相关
背景技术：
在高等植物中，将基因导入到双子叶植物中通常使用的方法是以Ti质粒中的T-DNA在细胞间进行转移和染色体整合为基础的，这发生在病原菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的侵染过程中。为了实现该目的，构建了比较小型的双元载体，被设计成只含有Ti质粒上的为转移基因所需要的那些区域，并且能够在E.coli与根癌农杆菌之间进行穿梭。在单子叶植物中，经常采用电穿孔法或其它技术直接将DNA导入到原生质体中，但也有一些成功利用农杆菌侵染法进行基因转移的报道。
然而，这些策略没有能够控制所导入的基因在染色体上的位置和拷贝数，因而很难获得导入基因的预期表达，这是由于多种现象包括导入的外源基因的位置效应、共抑制和基因沉默等的存在。
另一方面，也有利用反转录转座的基因破坏法，其中植物基因被TOS17所破坏(Applications of retrotransposons as genetic tools in plant biology.2001Trends in Plant Science 6127-134)。该方法可以对基因组修饰，但由于反转录转座子在基因组上的转座位置不具有特异性，因而要获得具有预期修饰基因的整株植物要求大量的劳动。而且，该方法虽也可以进行基因破坏，但不能随意的对任何位点进行突变或取代。
T-DNA标记(tagging)法涉及通过农杆菌感染将T-DNA插入而产生基因破坏(Plant tagnology.1999 Trends in Plant Science 490-96)。与利用TOS17的情况一样，该方法也要求大量的劳动以获得预期修饰的基因的整株植物，因为T-DNA在插入到基因组上的位置也不具有特异性。而且，该法虽也可以进行基因破坏，但不能随意的对任何位点进行突变或取代。
Zhu T等报道了利用嵌合RNA/DNA寡聚核苷酸技术，其中嵌合RNA/DNA寡聚核苷酸被用于对玉米基因组的基因中引入单核苷酸取代，因而赋予了玉米对除草剂的抗性(Targeted manipulation of maize genes in vivousing chimeric RNA/DNA oligonucleotides.Proc Natl Acad Sci USA 199996(15)8768-8773)。该技术可以对内源基因的非常小的区域中导入突变，但不能适用于对大区域的修饰。
就上面所述而言，基于同源重组的基因组修饰方法已发展成为用于表达预期外源基因的潜在方法。这种方法的特征是被插入的外源基因是夹在同源区域的中间以在外源基因两侧诱导同源重组。同源重组是指两个同源DNA链之间的交换。
另一方面，植物基因组结构包含比动物更多的重复序列。尤其是，已认为同源重组在植物体细胞中是受到抑制的。在拟南芥和烟草中，用人为插入到基因组的标记基因作为同源重组的靶标，其同源重组的频率估计在10-4到10-6之间(Gene targeting in plants.EMBO J 1988 74021-4026.Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cellsafter Agrobacterium mediated transformation.EMBO J 1990 93077-3084，Nonreciprocal homolgous recombination between Agrobacterium transferredDNA and a plant chromosomal locus.Proc Natl Acad Sci 1993 907346-7350)。
然而，这些基于同源重组的修饰高等植物基因组的策略中，如下所述，只有关于初步实验结果的少数报道。这些实验结果可以分成下述两种情况i)利用人为插入的遗传标记和ii)以植物的内源基因组序列为靶标。
对利用人为插入的遗传标记基因第i)种情况，下面列出的报道是已知的。
据报道，通过表达大肠杆菌的RecA或RuvC基因或者通过导入提高同源重组的频率的酵母HO或I-SceI内切核酸酶基因的方式进行DNA双链断裂来增强人为插入到烟草或拟南芥的标记基因的同源重组(RecA proteinstimulates homologous recombination in plants.Proc Natl Acad Sci USA 1996933094-3098，Stimulation of homologous recombination in plants by expressionof the bacterial resolvase RuvC.Proc Natl Acad Sci USA 1999 967398-7402，Enhancement of somatic intrachromosomal homologous recombination inArabidopsis by the HO endonuclease.The Plant Cell 1996 82057-2066，Homologous recombination in plant cellis enhanced by in vivo induction ofdouble strand breaks into DNA by a site-specific endonuclease.Nucleic AcidResearch 1993 215034-5040)。
Paszkowski J等报道了在烟草原生质体中通过同源重组成功地对基因组进行修饰。这是第一个在植物中成功的例子，使通过同源重组对植物基因组进行修饰成为了可能。该报道采用了一个选择体系，首先将缺失的不具有功能的卡那霉素抗性基因(正选择标记)导入到基因组中，然后用基因的再次导入所获得的细胞中以恢复所缺失的区域，继而进行对卡那霉素的抗性筛选(Gene targeting in plants.EMBO J 1988 74021-4026)。
Risseeuw E等报道了通过农杆菌介导转化而产生同源重组的一烟草培养细胞系。他们首先将GUS和codA基因整合到基因组，然后对所获得的转化细胞用基因进行再次转化，其能够通过同源重组造成GUS基因的部分缺失和codA基因的全部缺失并重新整合进卡那霉素抗性基因。他们通过对5-氟胞嘧啶的敏感性、对卡那霉素的抗性、GUS活性和PCR等进行筛选来选择同源重组体，接着进行Southern印迹进一步验证(Gene targeting andinstability of Agrobacterium T-DNA loci in the plant genome.Plant J 1997，11(4)717-728)。
Offringa R等报道了通过农杆菌介导转化而获得了一个发生同源重组的烟草培养细胞系。这使得农杆菌介导转化应用于通过同源重组的对植物基因组进行修饰的成为可能。但没有关于该方法的可重复性的讨论。他们先将部分缺失的卡那霉素抗性基因整合到基因组中，然后对所得到的细胞再次用弥补了缺失区的基因进行转化。他们也通过卡那霉素抗性和PCR和进一步Southern印迹的确证而获得了同源重组体(Extrachromosomalhomologous recombination and gene targeting in plant cells after Agrobacteriummediated transformation.EMBO J 1990，9(10)3077-3084)。
Halfter U等报道通过PEG的方法对拟南芥(Arabidopsis)原生质体进行遗传修饰而获得了发生同源重组的4个克隆。他们先将部分缺失的潮霉素抗性基因整合到基因组中，然后用弥补了缺失区的基因再次转化所得到的细胞。他们也通过潮霉素抗性和PCR及进一步Southern印迹的证实而选择同源重组体(Gene targeting in Arabidopsis thaliana..Mol Gen Genet 1992，231(2)186-193)。
相反，只有如下所述的两篇报道是关于第ii)情况的，即以植物内源基因组序列为靶标通过同源重组来获得对基因组的修饰。
Miao ZH等通过农杆菌介导转化拟南芥的根而从2580个培养转化细胞系中获得发生了同源重组的一个细胞系。他们将卡那霉素抗性基因通过同源重组而插入到基因组的TGA3基因座。这是第一次通过同源重组而达到修饰植物内源基因组的成功例子。除了对卡那霉素抗性的筛选外，他们还尝试了在细胞中表达通过非同源重组而整合外源基因的β-葡糖酸醛酶，因而提高了选择效率。此外，用PCR和Southern印迹以验证同源重组。然而，这个细胞系没有能够再生成完整的植株，因而未能得到对于同源重组区是纯合的个体(Targeted disruption of the TGA3 locus in Arabidopsis thaliana.Plant J 1995，7(2)359-365)。
Yanofsky MF等报道在对拟南芥进行农杆菌介导的转化时以获得了发生同源重组的一个细胞系。他们将卡那霉素抗性基因插入到基因组的AGL5基因中，并用卡那霉素抗性和PCR选择而从750个卡那霉素抗性系中获得了一个系，继而通过Southern印迹和PCR进行了最终的验证(Targeteddisruption in Arabidopsis.Nature 1997，389(6653)802-803)。
同时，如下所述的报道表明，利用同源重组企图获得发生了同源重组的细胞，但没有成功。
Thykjaer T等企图用农杆菌来使Lotus japonigus中发生同源重组。为了达到这个目的，他们用codA基因作为负选择标记而制备了数个载体，例如设计成在T-DNA的一侧或两侧携带该标记。然而，他们未能获得发生了同源重组的细胞(Gene targeting apoproaches using positive-negative selectionand large flanking regions.Plant Mol Biol 1997，35(4)523-530)。
Gallego ME等在拟南芥的转化中利用了卡那霉素抗性基因作为正选择标记，codA基因作为负选择标记。然而，他们也没有从1×105个转化细胞中获得同源重组的细胞(Positive-negative selection and T-DNA stability inArabidopsis transformation.Plant Mol Biol 1999，39(1)83-93)。
发明概述如上所述，基于同源重组的基因组修饰具有许多优点。然而，由于在高等植物中的同源重组率非常低，如上所提及的只有两篇关于在高等植物中通过同源重组对其内源基因组序列修饰成功的报道(Miao ZH等和Yanofsky MF等)。而且这两篇均没有提出一种可重复和可靠的同源重组方法。此外，也没有关于在单子叶植物上成功的报道，虽然单子叶植物对农业生产是非常重要的。因此，非常需要研究出一种在高等植物中可以重复的并且可靠的同源重组方法。
考虑到以往的技术，本发明的目的是克服高等植物细胞包括单子叶植物(如水稻(rice))细胞的常规转化中的各种问题。这些问题包括与外源基因转移相关的问题，如导入的外源基因的拷贝数和位置效应或由于共抑制、基因沉默等导致的表达不稳定。因此，本发明提供一种基因构建体和用于对植物基因组进行修饰的载体，意在将其用于这样一种方法，即除了要被修饰的基因区域外并不导致基因组中的任何其它改变，以及用上述方法得到的转化细胞产生整个转化植株的方法。
附图简述
图1显示用水稻Waxy基因作为例子来说明的对高等植物基因组进行修饰的概念性图解。图1a是所导入的基因和Waxy基因之间进行同源重组的示意图，图1b是同源重组之后Waxy位点的示意图。
图2显示基因组修饰载体的示意图。图2a、2b和2c分别是对照载体、pINA134基本载体和用于Waxy基因修饰的载体的示意图。在图2中，缩写的定义分别如下pUbi为玉米遍在蛋白1启动子；iUbi玉米遍在蛋白1的第一内含子；DT为白喉毒素蛋白A链；lox为噬菌体Cre/lox重组体系的lox序列；pAct为水稻激动蛋白启动子；iAct为水稻激动蛋白的第一内含子；hph为潮霉素抗性基因；t35S为花椰菜花叶病毒35S终止子；En/Spm为En/Spm型转座子的转录终止区；iCat为蓖麻子过氧化氢酶基因的第一内含子；p35S为花椰菜花叶病毒35S启动子；tNos为胭脂碱合成酶终止子。
图3是pUbip-int-DT-A、p35Sp-int-DT-A和pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)的示意图。
图4为pGS-SalI和pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)的示意图。
图5显示pINA134载体的构建即pAch1-En/Spm和pAch1-En/Spm2的示意图。
图6为Waxy基因座、靶向载体以及同源重组之后的物理图谱。
图7显示对同源重组体的分析。图7a显示利用HIF和W2R引物进行的PCR分析。除此之外，图7还表明了Southern分析结果，其中DNA是从PCR一阳性克隆所再生出的整株植株的绿叶中分离的，并用HindIII或MunI进行消化。图7b显示利用HindIII的基因组的Southern分析。图7c显示利用MunI基因组的Southern分析。在图7中，RCV表示阳性对照载体，N表示的是非重组体，而A1、A2、B、C、E和F分别表示从A-I、A-II、B、C、E和F系再生出的完整植株。
图8显示碘染色结果。
图9显示同源重组体的再生过程。图9a显示潮霉素抗性愈伤组织，图9b显示再生水稻植株，图9c显示穗期后的再生水稻植株。
发明的详细描述本发明提供一种用于通过同源重组来修饰高等植物基因组的基因构建体，其在T-DNA的BR(右边界序列)和BL(左边界序列)之间以下述的方向自BR包含如下元件(1)可表达状态的，优选是可高效表达状态的第一负选择标记基因；(2)第一克隆位点，用于整合欲与宿主基因组中靶基因发生同源重组的基因的5`区；(3)可表达状态的，优选是可高效表达状态的正选择标记基因；(4)第二克隆位点，用于整合欲与宿主基因组中靶基因发生同源重组的基因的3`区；及(5)可表达状态的，优选是可高效表达状态的第二负选择标记基因，可与第一负选择标记基因相同。本发明也提供包含上述基因构建体的植物转化载体。
本发明的基因构建体设计为，在T-DNA的BR和BL之间，位于可表达的正选择标记(优选为可高度表达状态)5`上游和3`下游具有可表达的负选择标记(优选为可高度表达)，并且在正选择标记和负选择标记之间具有克隆位点(优选为多克隆位点)以用于整合欲进行同源重组的序列。该构建体还进一步整合进用于农杆菌介导植物转化的载体中，所得到的载体在本发明中被称为“基本载体”(图2b)。
T-DNA是农杆菌的内源Ti质粒的一部分。当植物受到农杆菌感染时，细菌细胞本身并没有进入到植物细胞，但作为细菌细胞中的Ti质粒的部分的T-DNA区被转移进入植物细胞。T-DNA由BR(右边界序列)和BL(左边界序列)所界定。每一个边界序列由约25bp的不完全重复序列所组成。
本发明的基因构建体包含负和正选择标记。这是由于高等植物中非同源重组介导的转化率很高，因此有必要从这些非同源重组体中有效的选择出同源重组体。为了这个目的，这些标记被用作负和正选择。
正选择是在基因转移之后，在允许只有表达基因产物的细胞存活条件下选择转化细胞的技术。例如，如果导入的是新霉素抗性基因，则可基于对新霉素的类似物，G418的抗性来选择导入基因的细胞。
在基因转移之后选择转化细胞的负选择技术中，只要表达了基因产物即导致细胞死亡。例如，如果导入的是人疱疹病毒的胸(腺嘧啶脱氧核)苷激酶基因，则可用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(它是一种胸(腺嘧啶脱氧核)苷的类似物)进行筛选，那些表达了胸(腺嘧啶脱氧核)苷激酶基因的细胞被杀死。
在本发明中，正—负选择(即将正和负选择结合起来)用作筛选程序。该筛选程序涉及基于正选择标记的第一选择转化体，然后除去非同源重组体而选择性挑选出同源重组体，这基于负选择标记可以导致通过非同源重组所产生的转化体的死亡来达到。该程序达到了提高选择效率之目的。
负选择标记应当对植物细胞有毒性，但对用于载体操作的大肠杆菌和农杆菌没有毒性。这样的标记优选的是白喉毒蛋白A链基因。除此之外，可用作负选择标记的包括codA基因、细胞色素P-450基因和芽孢杆菌RNA酶(barnase)基因。
下面是已知的关于负选择标记的报道。Koprek T等报道codA基因和细菌P-450基因在大麦中可以用作负选择标记(Negative selection systems fortransgenic barley(Hordeum vulgare L.)comparison of bacterial codA-andcytochrome P450 gene-mediated selection.Plant J 1999，19(6)719-726)。Terada等报道白喉毒蛋白基因(DxT-A)在水稻中用作负选择标记(Negative selectioneffects of the diphtheria toxin protein(DxT-A)gene in rice and its application togene targeting.22ndAnnual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan，1999，2P-0343)。
优选的正选择标记实例包括潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、咪唑啉(imidazoline)抗性基因、草甘膦抗性基因、杀稻瘟菌素S抗性基因、bar基因和glyphosinate抗性基因。
本发明的特点是在同源重组率非常低的高等植物中，确保正和负选择标记的表达(优选为高水平表达)以有效的选择出发生了同源重组的植物细胞。如在图2b和2c中所示，为了增强负选择标记的表达，可以将启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)连接内含子以达到增强表达的目的，或者，可以使用在单子叶植物中能够启动强表达的遍在蛋白启动子。同样的，正选择标记的增强表达也是所希望的。为了该目的，当潮霉素抗性基因被用作正选择标记时，期望使用激动蛋白启动子，它能够启动潮霉素抗性基因强表达。为了保证这些选择标记的高水平表达，也可以使用其它的一些元件，包括玉米遍在蛋白启动子、水稻PLD内含子和蓖麻子过氧化氢酶内含子。
本发明的另一个特点是，在BL和BR每侧均使用了负选择标记基因。它们可以是不同的基因，但优选的是相同的基因。本发明的发明人已经对在高等植物中为什么通过同源重组进行基因组修饰不能成功的原因进行了分析，尤其是对单子叶植物，并且得出结论认为有相当数量的以不完全形成整合负选择标记的非同源重组体的存在而导致负选择的效率低下。在本发明中，使用两个相互分开的负选择标记有效的减少了在筛选步骤中非同源重组体存活下来的可能性。
本发明的基因构建体包含两个克隆位点，一个是位于正选择标记基因和第一负选择标记基因之间，另一个位于正选择标记基因和第二负选择标记基因之间。只要克隆位点适合于欲与靶标基因进行同源重组的基因的5`区或3`区的整合，任何克隆位均可选用。多克隆位点作为优选的克隆点是因为它可用于整合任何基因。多克隆位点可以通过合适的设计和合成具有预期的限制性内切酶位点的寡聚DNA序列来制备得到。
欲用于同源重组的基因的5`区整合进第一克隆位点，而基因的3`区整合进第二克隆位点。
欲用于同源重组的基因可以是编码特定蛋白的结构基因或其它影响植物表型的基因。这些基因可以用作提供植物基因组功能性缺陷的靶基因或用作改变靶基因以获得修饰的重组植物。对于靶基因的选择并没有任何限制，包括Waxy基因和EPSPS基因。
对于如何选择欲用于同源重组的基因的“5`区”和“3`区”之间的边界没有特别的限制。例如，为了完全阻止靶基因的功能，欲用于同源重组的基因可能是被平分成两段或按7∶3到3∶7的比例分开。所得的上游和下游部分可分别用作“5`区”和“3`区”，但通常每一个区域优选具有较长的长度。为了保证同源重组，每一个区域优选的长于至少1000个碱基，至少500个碱基。
相比较地，为了获得对靶基因功能的修饰，欲用于同源重组的基因被分成“5`区”和“3`区”并且插入各自的克隆位点。如果欲用于同源重组的基因有合适的内含子，可在内含子内将其分成5`区和3`区。此外，“5`区”应当理解为具有欲进行同源重组的基因的表达需要的所有功能的序列，而它的下游侧翼区可用作“3`区”。或者，“3`区”可以具有欲进行同源重组的基因表达需要的所有功能的序列，而它的上游侧翼区即可用作“5`区”。
为了将正选择标记能够从转化植株的后代中切除而使用了位点特异性重组系统，基因构建体可进一步设计为含有重组酶识别序列，称元件(7)(例如，Cre/lox重组系统的lox序列、R/RS重组系统的RS序列、或者FLP-FRT重组系统的FRT序列)，该元件在正选择标记基因的上游区和下游区(图2b和2c)。Cre/lox重组系统涉及利用Cre重组酶与lox的结合来切除不必要的部分。R/RS重组系统涉及利用R基因编码的重组酶与RS序列的结合来诱导夹在两个RS序列之间的DNA区域进行切除。同样的，FLP-FRT重组酶系统涉及利用FLP重组酶与FRT序列的结合以诱导夹在两个FRT序列之间的DNA区域的切除。
例如，利用本发明设计的含有Cre/lox重组系统的基因构建体，当Cre重组酶在同源重组之后得到表达时，它可能切除包含正选择标记基因的序列，在基因组的同源重组区域中其夹在两个lox序列之间。在Cre重组酶表达而切除夹在基因组中的两个lox序列之间的区域后，通过同源重组导入到植物基因组中的基因的5`区和3`区可以连接成天然的原始形式。这种切除可以通过PCR或Southern印迹来确证。
为了使Cre重组酶在愈伤组织中得到表达以切除lox序列之间的区域，这种切除也可以通过与另一种导入有Cre重组酶基因的植物杂交或通过将Cre重组酶基因导入到同源重组植物中来实现。
Cre和lox的结合可以用于对lox位点之间序列的修饰和缺失。为了修饰的目的，同源重组体与导入有Cre重组酶基因的重组体植物进行杂交以切除lox位点之间序列，然后与另一种既具有Cre重组酶基因也具有将要整合进lox位点之间的基因的重组体进行杂交，因此要整合进lox位点之间的基因被插入到在切除后保留下来的lox序列位点。修饰的例子包括但不限于除草剂抗性基因的插入。或者，为了调节靶基因的表达，也可将所述基因构建体设计成具有转录终止区，优选的是En/Spm类型转座子的转录终止区，作为元件(6)以确保抑制效果(图2b和2c)。
利用常规的遗传工程技术，本领域技术人员可容易地将上述元件(1)至(5)，及如果存在以及(6)和/或(7)按事先确定的顺序连接起来以获得本发明的基因构建体。而且，当利用标准的遗传重组技术时，对于本领域技术人员而言选择与植物基因组中靶标基因进行同源重组的基因，以及将该基因的5`区和3`区分别插入到第一和第二克隆位点也是很容易做到的。
本发明的基因构建体在合适的内切酶位点连接到用于农杆菌介导植物转化的载体上，从而该基因构建体替代T-DNA区域或载体的BR和BL之间的区域。所获得的载体对应于本文所用的基本载体。当将欲用于同源重组的基因的5`区和3`区分别整合到基本载体的第一和第二克隆位点，本发明所述基因修饰载体可衍生于该基本载体。
例如，将水稻Waxy基因和其侧翼区域插入到基本载体中以构建成水稻Waxy基因修饰载体(图2c)。
本发明也提供一种经同源重组而具有修饰基因组的高等植物制备方法，包含如下步骤(a)将本发明的基因修饰载体导入到含有Ti质粒的农杆菌菌株中；(b)让所述农杆菌菌株感染植物细胞、组织或愈伤组织；(c)通过负和正选择标记以筛选出发生过同源重组的细胞、组织或愈伤组织；(d)当选择是针对细胞或组织时，培养所述细胞或组织以产生愈伤组织；(e)在再生培养基中培养所述愈伤组织以产生植株个体，其对于基因组中同源重组而言是杂合的；和(f)所述植株通过杂交以产生同源重组纯合的高等植物。
如上所述，由于高等植物中同源重组率很低，上述步骤(a)和(b)最好是通过转化效率高的农杆菌介导的转化方法。基因修饰载体可通过高效的农杆菌介导的转化方法而导入例如水稻愈伤组织中，继而通过正-负选择系统而筛选出潜在的发生了同源重组的愈伤组织。高效的农杆菌介导转化方法可选用Terada等所提出的对农杆菌介导基因转移到水稻的改进方法。该转化程序达到的基因转移效率比传统程序要高5倍至10倍(Develpomentof′Agrobacterium mediate rice transformation with a high level of transformationefficiency，96thLecture Meeting of Japanese Society of Breeding，1999，212)。该转化基于双元载体系统，并且利用了高度可表达状态的潮霉素基因。
正-负选择可按如下方式来操作。从步骤(d)培养所得到的愈伤组织培养物转移到正选择培养基中，所述正选择培养基可以是添加正选择所需要物质的常规用愈伤组织的培养基。
在利用对抗生素抗性作为正选择的情况下，培养基中进一步增加相应的抗性素，其浓度足以使选择标记基因没有转化的愈伤组织不能成活或至少不能生长。在使用潮霉素作为抗生素的情况下，在每升培养基中加入10到200mg潮霉素。
愈伤组织在黑暗、15℃到40℃下生长2到3周。每个存活下来的即被认为是候选的已成功进行同源重组的愈伤组织，它具有正选择标记基因且不含负选择标记基因。从愈伤组织的颜色和繁殖上的区别来确定培养基上的愈伤组织是否存活。
此外，可以用PCR分析来确证这些候选愈伤组织是否携带有预期的基因修饰。
从愈伤组织细胞中提取的DNA进行PCR分析时，引物可如此设计，即一条是可结合插入基因区域的引物，而另一条是可结合插入片段边界之外的任何基因的部分序列。在没有发生基因插入事件或发生非同源重组的细胞中，PCR不能产生扩增片段，这是因为这两条引物的位置相互不接近。相反，在发生了同源重组的细胞中，进行PCR可以产生预期大小的扩增片段，这是由于两条引物的结合区相互靠近。若检测出该片段则表明在相应的细胞群中包含了同源重组基因的可能性非常大。所述细胞群可分成亚群并再次用PCR进行检测。通过这种循环筛选重复至分离出发生同源重组的细胞为止。
不用上述的PCR分析或在上述PCR分析之后，更详尽的分析可以采用Southern印迹来确证基因是否被修饰。
本发明的方法使得可以在单子叶植物如水稻中达到高效的同源重组。如下面所述的例子，在一个优选的实施方案中，6个实验中平均每一个实验中在进行正-负选择之后，可从400个种子的基础上产生100多个愈伤组织，且在每一个实验的这些愈伤组织中至少获得了基因修饰的一个植株。基于这些事实可知，本发明所述方法的可重复性和可靠性非常高。
被确证含有预期修饰基因的每一个愈伤组织可在再生培养基如MS培养基上培养以获得单株，该单株就基因组中的同源重组而言是杂合。在花粉和种子中，修饰基因的表达和结构可以通过PCR和/或Southern印迹来确证在靶基因座发生的同源重组是否是杂合性。
由于所获得的个体可以再生和授粉，因而它们可通过自花授粉而产生对于同源重组是纯合的基因修饰的高等植物。
本发明的优点基于前述分析，根据本发明，甚至在同源重组率非常低而非同源重组介导的基因转移频率非常高的高等植物中，当被连接于同源区域两侧的负选择标记与正选择标记一起被用于正-负选择时，以该植物内源基因组序列作为靶标可在每100个所得愈伤组织中重复获得一个同源重组体而没有改变它们的原始基因座。
此外，本发明使得可以产生其特定基因被修饰而不会受到任何限制的转化植物。例如，本发明的方法用于修饰水稻中参与淀粉合成的Waxy基因时，可能获得调节Waxy基因表达的水稻植株。这种基因修饰水稻植株也可进一步通过位点特异性重组介导进行基因组修饰，因为位点特异性重组所要求的序列被整合到相同基因座。本发明有利于基因功能分析以及在基因组动力学中的变化相关联的基因表达机制的分析。
此外，还可以将同源重组体再生成完整的植株，所得的这些植株能够是可育的，进而因此可产生对于同源重组基因是纯合的单株。
实施例实施例1对照载体和Waxy靶载体利用衍生自pVS1的载体pGSGluc(Saalbach I et al.(1994)A chimericgene encoding the methionine-rich 2S albumin of the Brazil nut(Betholletiaexcelsa H.B.K.)is stably expressed and inherited in transgenic grain legumes.Mol Gen Genet 242226-236)中的rep和sta区域以及壮观霉素抗性基因构建载体pRIT(图2a)、pINA134(图2b)和pRW(图2c)。
实施例1-1pRIT的构建用SalI消化pGSGluc获得约9.4kbp的片段，然后自连接构建pGS-SalI。再用HindIII消化pGS-SalI并与HindIII消化的pIG221相连(TanakaA etal.(1990)Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice butnot in tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficientsplicing of the intron.Nucleic Acids Res.186767-6770)，进而用EcoRI和BglII进行消化而产生了12.4kbp片段。利用具有EcoRI、NotI和BglII位点的合成接头使该片段自连接而获得pGSIG。从pAch1(Bilang R et al.(1991)The3`-terminal region of the hygromycin-B-resistance gene is important for itsactivity in Escherichia coli and Nicotiana tabacum.Gene 100247-250)中切出含有水稻激动蛋白1(Actin 1)的启动子及其第一内含子、hph基因和CaMV35S终止子的2.6kbp片段，然后插入到pGSIG的EcoRI位点而得到构建体pRIT，在该载体的左右边界序列之间，具有其中在水稻激动蛋白1启动子及第一内含子的控制之下hph基因(Actp-int-hph基因)，和在CaMV35S的控制之下gusA基因。
实例1-2pINA134的构建白喉毒素A链基因(DT-A基因)是利用pMC1DpA作为模板进行PCR获得的片段(Yagi T et al.(1990)Homologous recombination at c-fyn locus ofmouse embryonic stem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene innegative selection.Proc Natl Acad Sci USA 879918-9922)，用于取代pCKR138中hph基因编码区(Izawa T et al.(1991)Introduction andtransposition of the maize transposable element Ac in rice(Oriza sativa L.).MolGen Genet 227391-396)而连接成CaMV35S启动子、DT-A和CaMV 35S终止子，而构建成质粒p35Sp-DT-A。蓖麻子过氧化氢酶基因(Ohta S et al.(1990)Construction and expression in tobacco of a β-glucuronidase(GUS)reporter gene containing an intron within the coding sequence.Plant Cell Physiol31805-813)被插入到CaMV35S启动子和DT-A基因之间而构建成p35Sp-int-DT-A。欲插入的片段可通过PCR来获得。p35Sp-DT-A的CaMV35S启动子用包含玉米遍在蛋白1的启动子及其第一内含子的2.0kb片段进行取代而构建成了质粒pUbip-int-DT-A，其是用PstI消化pAHC27(Takimoto T et al.(1994)Non-systemic expression of a strss-responsive maize polyubiquitin gene(Ubi-1)in transgenic rice plants.Plant Mol Biol 261007-1012)而得到的。衍自Tn930(Grindley NDF和Joyce CM(1981)Analysis of the structure and functionof the kanamycin-resistance transposon Tn930.Cold Spring Harb.Symb.Quant.Biol.45125-133)的卡那霉素抗性基因以与DT-A相同方向插入到pUbip-int-DT-A的CaMV35S终止子的3`末端，继而以相反的方向将覆盖p35Sp-int-DT-A上启动子到终止子的片段插入到卡那霉素抗性基因的3`末端，这样就构建成了pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A。该载体用HindIII进行消化和末端钝化后进行自连接以去除卡那霉素中的HindIII位点，因而构建成 pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)。然后用HindIII切割pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)得到夹在遍在蛋白1启动子和CaMV35S启动子之间的区域，再将其插入到pGS-SalI的HindIII位点构建成pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A。所得到的构建体用HindIII部分消化后插入接头(5`-AGC TGG GAT CCC-3`)以去除两个HindIII位点，因而得到构建体pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)。
玉米En/Spm转座子的转录终止区(Gierl A et al.(1985)Molecularinteractions between the components of the En-I transposable element system ofzea mays.EMBO J.4579-583)是通过PCR合成，长为1.0kb片段，将其插入到pAch1的CaMV35S终止子的3`末端以构建成pAch1-En/Spm。每个携带衍生自噬菌体P1中的Cre/loxP位点特异性重组系统中loxP序列片段(Kanegae Y et al.(1995)Efficient gene activation in mammalian cells by usingrecombinant adenovirus expressing site-specific Cre recombinase.Nucl AcidsRes 233816-3821)和在构建靶向载体时同源序列的插入所需克隆位点也是用PCR来合成的。这些合成的片段被插入到pAch1-En/Spm中的Actp-int-hph-En/Spm2基因的5`和3`末端以构建成pAch1-En/Spm2。得到的构建体用以取代pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)中的卡那霉素抗性基因的区域而构建成pINA134。
实施例1-3pRW的构建包含iaponica水稻品种“Shimokita”的Waxy基因和它的侧翼区(67kb)的BAC克隆(123-D4)用HindIII进行消化，获得包含Waxy基因的14.7kb片段并插入到pBC(Stratagene Co.)的HindIII位点。在用XbaI消化后，得到的6.3kb和6.8kb片段分别插入pBluescript SK-(Stratagene Co.)的XbaI位点构建成pBluescript-Waxy 6.3kb和pBluescript-Waxy 6.8kb。将AscI接头插入到pBluescript-Waxy 6.8kb的3`-末端多克隆位点中的NotI位点，继而用SmaI和AscI进行消化以得到6.8kb的片段。该片段插入pINA134的PmeI和AscI位点之间构建成pINA-Waxy 6.8kb。携带了包含Waxy基因启动子区的6.3kb片段的pBluescript，用HindIII消化，得到6.3kb片段并插入到pINA-Waxy6.8kb的HindIII位点构建成Waxy靶向载体pRW.
将这些载体分别导入到根癌农杆菌菌株EHA101(Hood EE et al.Thehvper-virulence of Agrobacterium tumefaciens strain A281 on legumes.PlantPhysiol.83529-534)中，其可采用电激法(Sambook J et al.(1989)MolecularCloningA Laboratory，manual，2ndEdn.Cold Spring Harbor，NYCold Springharbor Laboratory Press)。
实施例2转化采用的农杆菌转化法基本上根据Hiei等的方法(Hiei Y et al.(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6271-282)，但使用Agarose Type I(Sigma Co.)而不是Gelrite来进行水稻的细胞培养。水稻品种Nipponbare的成熟种子用于诱导产生愈伤组织。去除外壳后，种子在70％的乙醇中浸泡1分钟后用2.5％次氯酸钠灭菌20分钟。灭菌的种子用灭菌水冲冼后，转移到用Agarose Type I的2N6培养基中，并于黑暗条件下28？生长3到4周。进而将它们转移到另一的2N6培养基上继续生长3到7天。
携带有pRIT、pINT134或pRW的农杆菌菌株EHA101，在附加125mg/l壮观霉素的AB培养基上于28℃培养3天(Chilton MD et al.(1974)Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA notdetected in crown gall tumors.Proc Natl Acad Sci USA 713672-3676)。之后，收集培养的细胞进而悬浮于有400μm的乙酰丁香酮(acetosyringone)的AAM溶液中(Hiei Y et al.Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.ThePlant Journal 6271-282)，并于28℃以100rpm振荡1至2小时。每个愈伤组织在浓度调节到OD600＝0.18的细菌悬浮液中浸泡3至4分钟。用灭菌的纸巾将多余的细菌细胞去掉，再将每一个愈伤组织转移到附加400μm乙酰丁香酮的含0.8％Agarose Type I的2N6-AS培养上，于28℃黑暗条件下生长3天。每一个愈伤组织用含有500mg/l头孢噻肟(cefotaxime)的灭菌水冲冼。用灭菌的纸巾去掉多余的灭菌水，将每一个愈伤组织转移到附加50mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟(cefotaxime)的含0.8％Agarose Type I的2N6-CH上，于28？黑暗条件下生长3-4周。对能够连续生长的愈伤组织进行计数后，单个愈伤组织被转移到含有2N6-CH溶液的多孔板上，以用于后面分析。
为了检测用pRW进行转化的正-负选择的转化效率和“逃生(escape)”愈伤组织(对潮霉素有抗性但没有发生同源重组)的数目，用pRIT或pINA134作转化所获得的愈伤组织与用pRW作转化进行了比较。这种比较是基于未感染愈伤组织的鲜重和所获得愈伤组织的数目。在每一个实验中，从400个成熟种子获得了健康愈伤组织大约为40gFW(gram fresh weight)。1到5克鲜重的愈伤组织用pRIT和pINA134进行转化，其余的用pRW进行转化。在2N6-CH上进行筛选后，计数潮霉素抗性愈伤组织。
愈伤组织的再分化是用MSRE培养基诱导的，MSRE培养基包含MS盐(Murashige T and Skoog.F.(1962)A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures.Plant Physiol.15，473)、30g/l蔗糖、30g/l山梨醇、1mg/l NAA、2mg/l BAP、50mg/l潮霉素、500mg/l头孢噻肟和0.8％Agarose Type I。分化的植株生长于包含30g/l蔗糖、50mg/l潮霉素、500mg/l头孢噻肟和0.8％Agarose Type I的MS培养基上，然后转入温室中生长。
实施例3靶愈伤组织的检测将每个愈伤组织(30mgFW)置于2ml的塑料管，并于0.5mlCTAB溶液(Plant DNA isolation kit.Kurabo Co.)和5陶瓷球(ceramic ballsdiameter3mm；Nikkato Co.)的存在下用FastPrep组织压碎器(FP120；Bio 101 Co.)以6.5的速度压碎20秒。将压碎后产物于65℃下温育0.5到2小时，用自动DNA抽提器(automated DNA extractorNA2000.Kurabo Co.)进行处理。如果使用叶片，10mgFW叶片置于管中用液氮速冻并强烈的压碎，继而用FastPrep组织压碎器以6.5的速度进一步碾压10秒。接着，用处理愈伤组织相同的操作来提取其DNA。得到的DNA溶于10mM Tris-EDTA缓冲液(pH8.0)中并在260nm下测定其光吸收值。用LATaq(Takara Co.)进行PCR分析。反应条件是94℃处理1分钟1个循环，以94℃1分钟和60℃20分钟处理进行32个循环，然后于72℃处理10分钟1个循环。同源重组可用引物H1F5`-GTATAA TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATG TTT-3`和W2R 5`-GTT TGG TCATAT TAT GTA CTT AAG CTA AGT-3`进行验证。Waxy基因的原始启动子可用Pro15`-ACA CAA ATA ACT GCA GTC TC-3`和Ex2GAG CTG GGACGT GGT GAG AGC CGA CAT G-3`进行验证。扩增DNA片段在0.6％琼脂糖凝胶上进行电泳后通过溴乙锭染色来观察。
实施例4胚乳和花粉的碘染色可用剃刀切出胚乳。在裂开之前立即收集花药并在染色前用固定液(醋酸∶乙醇＝1∶3 v/v)进行处理。胚乳和花粉用碘液(0.18％(w/v)碘，1％(w/v)碘化钾)进行染色。
实施例5a.Southern印迹分析用CTAB法从Nipponbare和转化体的绿叶中提取DNA，然后进行纯化(Murray MG，Thompson WF.(1980)Rapid isolation of high molecular weightplant DNA.Nucleic Acids Res 84321-4325)。分离BAC克隆123-D4的质粒DNA采用核酸抽提试剂盒(Qiaprep Spin Maxiprep Kit.Qiagen Co.)。分离出的DNA用HindIII、KpnI、MunI或EcoRV进行消化，用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳，再将其转移到Hybond N膜上(Amersham Co.)。用EcoRI消化质粒Adh1-antiWx获得的2.7kb片段用作cWx2.7探针。cWx2.7探针包含Waxy编码区(2.3kb)和Waxy第一内含子(约400bp)。用XhoI消化质粒pBluescrip-Waxy 6.3kb所得到的4.1kbp用作pWx4.1探针。用地高辛(digoxigenin)标记这些探针(Boehringer Mannheim Biochemica)。以F1Hm5`-GTA GGT AGA CCG GGG GCA ATG AG-3`和R2Hm5`-ACG CCC GACAGT CCC GGC TCC GG-3`作引物利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roch Co.)制备针对hph基因的标记探针。PCR反应的条件是94℃，2分钟，1个循环，以94℃30秒、60℃45秒和68℃45秒处理进行32个循环，然后于72℃处理3分钟1个循环。转移到每一张膜上的DNA片段在42℃下与标记片段进行杂交，所用溶液包含50％甲酰胺，5×SSC，2％封闭溶液(BoehringerMannheim Biochemica)，0.2％SDS和0.1％月桂肌磷酸(Lauryl Sarcosine)。杂交探针通过CDP-Star(Boehringer Mannheim)和抗-地高辛碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)进行检测。
b.重组区的核苷酸序列测定从每个转化体的绿叶中提取DNA用作模板使用DNA聚合酶实施PCR，所用的DNA聚合酶是AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)。反应条件是94℃处理10分钟1个循环后，以94℃0.5分钟、55℃0.5分钟和72℃1分钟处理进行36个循环，然后于72℃处理10分钟1个循环。
用于反应的引物有如下12对WxR-F15`-AAG CTT CTA TTG ATGCAT AC-3`和WxR-R13915`-GAC AGG ACA AGAG CTG AGG GGAAC-3`；WxR-F12765`-TAT AAT GGC CCA GAG TAG TA-3`和WxR-R17885`-TTG CCC AGT TGC CCA AAG AA-3`；WxR-F17135`-CTC TCC CCTCCT CTC CCT TTC T-3`和WxR-R23965`-TCC TTG CAT TAT GTG ATGGA-3`；WxR-F23635`-CCA ATC CAA TCC AAT CCA TCA C-3`和WxR-R29255`-CCC TCT TCT CTC CCT TTT GAC C-3`；WxR-F28875`-TGG TGT TGT CCT TCT GTG GTC A-3`和WxR-R38315`-CGT CGT CGTCGG GGT TCA GGT A-3`；WxR-F35095`-GTC AGC CTC CCT CTC CCTTCT C-3`和WxR-R47015`-TAC AGC CGT GGG AGA GGA GAT A-3`；WxR-F44515`-AAG TCA AAT TAG CCA CGT AG-3`和WxR-R56255`-CGGCTT GGC GTA CGT TGC AT-3`；WxR-F54475`-CAC GCA CAC CCC AAACAG AC-3`和WxR-R78995`-CTT GGG TTA AAA TCT TGC GA-3`；WxR-F76755`-AAC TGT TCT TGA TCA TCG CA-3`和WxR-R98675`-ATTGTA TAC CGT TCC GTA TC-3`；WxR-F97095`-AGG AGA AGT ATC CGGGCA AG-3`和WxR-R124655`-TCT TGA CTT GTC CCG GAC CAT-3`；WxR-F146545`-CTT ATA TTG TGG GAC GGA GA-3`和WxR-R150225`-AGA AGC CTA ATA TAC CAC GA-3`；WxR-F-2845`-ATG CAA TGAGAA GAT CTG TA-3`和WxR-R2095`-TCT TAT AAG CCG GAG TCTTG-3`。用上述各自的引物对获得12个片段，可用BigDyetm Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit V3.0(Applied Biosystem)、ABI PRISM377DNA测序仪和ABI PRISM3100 genetic Analyzer(均可从Applied Biosystem购买得到)来进行测序。
实施例6为了获得有效的正-负选择，潮霉素磷酸转移酶基因(hph)被选作正选择标记，白喉毒素A链基因(DT-A；Pappenheimer AM Jr(1977)Diphtheria toxin.Annu Rev Biochem 4669-94)用作负选择标记。DT-A对真核生物体包括植物具有毒性，因为它通过催化延伸因子的ADP-核糖基化而抑制蛋白合成(YagiT et al.(1990)Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonicstem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene in negative selection.Proc Natl Acad Sci USA 879918-9922；Czako M and An G(1991)Expressionof DNA coding for diphtheria toxin chain A is toxic to plant cells.Plant Physiol95687-692；Bellen HJ et al.(1991)Isolation of temperature-sensitive diphtheriatoxin in yeast and their effects on Drosophila cell.Development 114787-796)。为了检测转化率，用pRIT和pINA134分别作为正对照和负对照载体。如pRW一样，pRIT和pINA134也携带hph作为正选择标记，并且利用水稻激动蛋白1启动子和其第一内含子来使转化效率达到最大。
从400个成熟的种子中，pRIT转化证实得到有1500个单独的愈伤组织。pINA134以同样方式进行转化以研究负选择的效果，结果显示用pINA134进行转化导致超过99％的致死率。PCR分析表明每一个不能成活的愈伤组织中均含有DT-A基因。大多数用pINA134转化的成活愈伤组织中的DT-A有部分或全部缺失。这些结果表明，DT-A基因连接于高活性启动子之下，在水稻中作为负选择是有效的。也表明两个DT-A基因位于分开的位置则使产生两个DT-A基因均缺失的重组体的概率非常低。
Waxy靶向载体pRW用于转化。为了确证其转化效率和正-负选择的效果，pRIT和pINA134也用于转化并分别测定所得到的潮霉素抗性愈伤组织的数目。如表1所示，对pRIT而言获得了1500个，对pINA134而言获得60个，对pRW而言获得100个愈伤组织，这是对超过6次转化实验的平均值。
利用H1F和W2R引物对进行PCR以验证在Waxy基因座的同源重组。H1F引物编码位于En/Spm序列的3`末端的loxP序列，而W2R引物编码同源重组区外的任何序列。当用于针对发生了同源重组的愈伤组织时，这些引物可以扩增出大约8kb的片段。在6次实验中获得的总数630个存活愈伤组织中，用这些引物分析发现6个单独的阳性愈伤组织系(A-I、A-II、B、C、E、F)。如表1中所示在每一个实验中获得的愈伤组织中，显示PCR阳性平均是百分之一。在个别情况下，可以观察到不同大小的片段被扩增。这可归因于非正常整合或整合了缺失的DT-A基因。
自PCR-阳性系(A-I、A-II、B、C、E、F)的再生整个植株中，从其绿叶中提取DNA，然后用HindIII、MunI或EcoRV进行消化以用于Southern杂交分析。Waxy片段在重组前为14.7kb长，而在PCR-阳性的重组体中变成了6.3kb和12.1kb片段。这是因为HindIII位点通过同源重组插入到了第一内含子中的原因。其6.3kb片段与Waxy启动子区域(pW4.1)杂交，而12.1kb的片段与hph基因(Hm0.9)和Waxy基因(cWx2.7)的编码区杂交。类似的结果可以用MunI和EcoRV进行分析得到。同样，在所有重组体中，从所检测到的信号强度估计同源重组只发生在所有重组体的一个等位基因上。
所有的同源重组体(A-I、A-II、B、C、E、F系)均能再生出完整的植株，并且可育而产生种子。在它们中间，对于A-I系，用碘染色和PCR分析其Waxy基因的分离。在含有Waxy基因的Nipponbare的花粉和种子中的淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成，因此在碘染色中被染成深蓝色。相反，在含有Waxy基因的粘性水稻中的淀粉只由支链淀粉组成，因此被染成红褐色。在A-I系中，花粉粒被染成深蓝和红褐色的比率是1∶1。此外，从A-I系获得的53粒种子中有13个被染成红褐色。对A-II、B、C、E和F系的种子进行同样的实验，表明染色后的比率几乎与A-I系的相同。这些结果表明从A-I、A-II、B、C、E和F系再生出的完整植株中，同源重组只发生在一个等位基因上。进而，为了区分得到的种子的基因型，种子发芽后，从其绿叶中分离DNA进行PCR分析。引物H1F和W2R被用于验证同源重组，而引物Prol和Ex2用于检测原始Waxy基因座。引物Pro1和Ex2可扩增出第一内含子附近的1.3kb片段。从PCR分析结果可知，PCR分析所体现的基因型与用碘染色所体现的表型之间完全相符，其中被染成深蓝的27个种子具有杂合基因型。也就是说，F1代中基因型比率分离比为1∶2∶1，因此同源重组只发生在一个等位基因上。而且，也表明同源重组基因可以准确的遗传到下一代。
由于存在基因组基因的非期望重组而使Waxy基因失去功能的可能性，用Southern分析来验证hph-En/Spm基因是否正确的插入到了Waxy第一内含子。为了用于分析，对于A-I系的后代的基因组DNA用HindIII、KpnI、MunI和EcoRV进行消化，对于A-II、B、C、E和F系的后代用HindIII、MunI和EcoRV。在每一处理中用一株以上的完整植株进行分析。选择这些内切酶的原因是它们在Nipponbare和Shimokita之间的Waxy位点间没有多态性，而且也都存在于hph-En/Spm基因中。以pW4.1、Hm0.9和cWx2.7作为探针。结果，在F1代中均观察到了所有预期大小的片段，这表明同源重组发生如预期一样，并能正确的遗传给后代。
在A-I、B和C系的后代植株中，对那些重组区域纯合的进行核苷酸序列测定。分析纯合体个体的基因组DNA以确定预期发生同源重组的Waxy区域的核苷酸序列，确证没有突变或错误，如非期望的缺失和插入。
因此，从6个单独实验中获得的6个转化体的Southern分析，F1代的PCR分析、F1代的表型和基因型、Southern分析的F1代分离模式以及A-I、B和C系中重组区域的测序结果表明获得的水稻植株显示出正确的同源重组。而且，也表明这种基因修饰方法是可以重复的。
表1.靶向效率实验转化体a负选择存活正-负选择存活 PCR-阳性愈 靶效率的愈伤组织b的愈伤组织c伤组织 (×10-4)A2097 2292 29.5B1550 8015316.5
C1976176 11415.1D11591061 0_dE589 0 100117.0F17826111015.6平均1526 5810517.3a用pRIT转化的1-5gFW愈伤组织获得的潮霉素抗性愈伤组织数，被计算为用pRW转化所用每重量愈伤组织(约40gFW)为基础计数。
b用pINA134转化的1-5gFW愈伤组织中获得的潮霉素抗性愈伤组织数目，被计算为pRW转化用每重量愈伤组织(约40gFW)。
cpRW转化40gFW愈伤组织获得的潮霉素抗性愈伤组织数目。
d＜8.6×10-4参考文献除上述所提及的文献外，下面这些文献用作参考(1)Echt CS，Schwartz D(1981)Evidence for the inclusion of controllingelements within the structural gene at the waxy locus in maize.Genetics99275-284；(2)Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The small，versatile pPZPfamily of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol Biol25989-994；(3)McElroy D，Blowers AD，Jenes B，Wu R(1991)Construction ofexpression vectors based on the rice action(Actl)5’region for use in monocottransformation.Mol Gen Genet 231150-160；(4)Nelson，OE(1962)The Wazy locus in maize.I.Intralocusrecombination frequency estimates by pollen and by conventional analyses.Genetics 47737-742；(5)Wessler，SR，Varagona，MJ(1985)Molecular basis of mutations in theWaxy locus of maizecorrelation with the fine Structure genetic map.Proc.Nail.Acad.Sci.usa 824177-4181；(6)美国专利号6187994，申请号9765613；
(7)Internationl Patent Public Disclosure WO 9925821，国际申请号WO98US24610；和美国专利号5464764，申请号014083。
序列表<110>日本烟草产业株式会社(Japan Tabacco Inc.)<120>修饰高等植物基因组的方法<130>011248<160>7<210>1<211>12<212>DNA<213>
<400>1agctgggatc cc 12<210>2<211>30<212>DNA<213>
<400>2gtataatgta tgctatacga agttatgttt 30<210>3<211>30<212>DNA<213>
<400>3gtttggtcat attatgtact taagctaagt 30<210>4<211>20<212>DNA<213>
<400>4acacaaataa ctgcagcttc 20<210>5<211>28
<212>DNA<213>
<400>5gagctgggac gtggtgagag ccgacatg 28<210>6<211>23<212>DNA<213>
<400>6gtaggtagac cgggggcaat gag23<210>7<211>23<212>DNA<213>
<400>7acgcccgaca gtcccggctc cgg2权利要求
1.一种用于通过同源重组来修饰高等植物基因组的基因构建体，其在T-DNA的BR(右边界序列)和BL(左边界序列)之间以下述的顺序自BR包含如下元件(1)可表达状态的第一负选择标记基因；(2)第一克隆位点，用于整合欲与宿主基因组中靶基因发生同源重组的基因的5`区；(3)可表达状态的正选择标记基因；(4)第二克隆位点，用于整合欲与宿主基因组中靶基因发生同源重组的基因的3`区；和(5)可表达状态的第二负选择标记基因，它可以与第一负选择标记相同。
2.根据权利要求1的基因构建体，进一步还包括(6)转录终止区，优选的是En/Spm类型转座子的转录终止区，其位于第一克隆位点下游。
3.根据权利要求1或2的基因构建体，进一步在正选择标记基因的上游和下游包括(7)重组酶识别序列。
4.根据权利要求1-3中任意一项的基因构建体，其中用于整合欲与宿主基因组中靶基因进行同源重组的基因的5`和3`区克隆位点的一个或两个是多克隆位点。
5.根据权利要求1-4中任意一项的基因构建体，其中可表达状态的第一负选择标记基因位于玉米遍在蛋白1启动子(pUbi)和花椰菜花叶病毒35S终止子(t35S)之间。
6.根据权利要求1-5中任意一项的基因构建体，其中正选择标记基因通过被置于水稻激动蛋白启动子(pAct)及水稻激动蛋白的第一内含子(iAct)与CaMV35S终止子(t35S)之间而处于可表达状态。
7.根据权利要求1-6中任意一项的基因构建体，其中第二负选择标记基因通过被置于花椰菜花叶病毒35S启动子(p35S)及蓖麻子过氧化氢酶的第一内含子与花椰菜花叶病毒35S终止子(t35S)之间而处于可表达状态。
8.根据权利要求1-7中任意一项的基因构建体，其中第一和第二负选择标记基因的转录方向相反。
9.根据权利要求1-8中任意一项的基因构建体，其中正选择标记基因选自潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因或除草剂抗性基因(例如，bar基因)，而负选择标记基因选自白喉毒素蛋白A链基因(DT-A)、codA基因、细胞色素P-450基因或芽孢杆菌RNA酶基因。
10.一种植物转化载体，其包含权利要求1-9中任意一项的基因构建体。
11.一种植物转化载体，其包含如权利要求1-9中任意一项的基因构建体，其中欲与宿主基因组中靶基因发生同源重组的基因的5`区被整合到第一克隆位点，欲与宿主基因组中靶基因发生同源重组的基因的3`区被整合到第二克隆位点。
12.一种通过同源重组具有修饰基因组的高等植物(优选为单子叶植物)的制备方法，包括如下步骤(a)将权利要求11的植物转化载体导入到含有Ti质粒的农杆菌菌株；(b)让所述农杆菌菌株感染植物细胞、组织或愈伤组织；(c)进行负选择和正选择以筛选出发生过同源重组的细胞、组织或愈伤组织；(d)在选择是针对细胞或组织时，培养所述细胞或组织以形成愈伤组织；(e)在再生培养基中培养所述愈伤组织以产生单植株，其在基因组中对于同源重组是杂合的；和(f)所述植株通过杂交以产生基因修饰的高等植物，其对于同源重组是纯合的。
13.根据权利要求12的方法，包括在步骤(d)、(e)或(f)之前或之后，从植物细胞基因组中的同源重组区缺失正选择标记基因及它的启动子和终止子的步骤，及如果存在的话，缺失转录终止区。
14.根据权利要求13的方法，其中缺失步骤包括Cre/lox重组系统、R/RS重组系统或FLP-FRT重组系统。
全文摘要
本发明建立了基于同源性重组的基因组修饰技术，用于将基因组的部分序列改变为所期望的序列，而这种技术曾经被认为在高等植物中很难达到高效，且可重复性不高。根据本发明，以高等植物的内源基因组序列作为靶序列可以非常高效的和可重复性的产生同源重组体，而不改变它们的原始基因座。此外，本发明能生产出转化植物，其中特定基因被修饰而没有任何限制，而且也有利于对基因功能进行分析和对基因组动力学的变化相关联的基因表达机制进行分析。
文档编号C12N15/84GK1610747SQ0282027
公开日2005年4月27日 申请日期2002年8月23日 优先权日2001年8月28日
发明者饭田滋, 寺田理枝, 稻垣善茂 申请人:日本烟草产业株式会社, 欣根塔有限公司