用于野外采样提取植物基因组dna、蛋白质的组织固定方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法。该方法将组织样品切割为截面不大于0.5cm2的条块放入组织固定剂浸泡后过夜保存，固定后的样品用移液枪去除大部分固定剂并加入少许混合的组织固定干粉然后转入4℃冰箱保存数月或-20℃冰箱长期保存。对野外作业中的植物组织进行简单快速处理后的植物组织，可用于DNA、蛋白质提取和后期实验。既方便了野外采集植物组织的作业流程，又大大节约了野外采集植物组织的劳动成本。本发明是利用组织固定剂进行植物种组织材料进行固定的方法，为科技工作者处理固定植物组织，特别是野外采摘植物样品提供了一种简单有效的方法。
【专利说明】用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物【技术领域】，具体涉及一种用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法。
【背景技术】
[0002]植物中有效成分包括植物营养成分、药用成分、香精、天然色素等成分，亦包括一些生物大分子如DNA、RNA和蛋白质等。一般药用成分等这几种成分的提取需要对材料进行烘干预处理之后进行，这样植物组织才易于保存，不存在有效成分降解的问题，对后续的实验一般也不存在很大的影响。
[0003]但是在提取植物材料中某些活性成分(酶、维生素C或生物大分子如DNA、RNA或蛋白质等)时，有时需要用新鲜植物样品。新鲜植物样品材料的采集和处理，是植物分子生物学实验中的极其重要环节。取样时应注意保鲜，通常取样后应立即进行待测组分的提取以防止有效成分发生降解；也可采用液氮速冻后放在-80°C超低温冰箱长期保存；若只是提取植物基因组DNA，样品也可置于O~4°C冰箱中短期保存。从田间采取新鲜植物材料样品，在正式测定之前的一段时间里，如何正确妥善的保存和处理是很重要的，它影响到后续的一系列相关的实验，也关系到测定结果的准确性。
[0004]通常植物采样回来会立即处理或者低温保存，但是往往会存在各种困难，有些时候从田间或野外采样回来会后，由于其他事情的耽搁或者采摘过多样品回来无法立即处理，这样便会导致样品 有效成分的降解或损失。而一般的田间与实验室有一定的距离，有些甚至相隔甚远，特别是野外考察取样后更是无法在短时间内处理保存好样品。所以如何使植物组织固定，保证植物样品的有效成分不被降解是一个极大的困难。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供了一种安全有效的用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法，该方法能安全有效地将野外采样后的植物组织，提取到实验要求的基因组DNA和蛋白质。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案为:提供用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法，包括以下步骤:
[0007]( I)组织固定剂配制
[0008]a、取 500 ~550g(NH4)2S04、2.5gTris 碱、3.7g Na2EDTA,将上述三种成分混均，获得组织固定干粉；
[0009]b、混均后的组织固定干粉加入700~800mL热开水充分搅拌溶化，3V~4°C冷却成饱和溶液有沉淀析出，PH为7.0~7.4 ;获得组织固定剂；
[0010](2)植物组织样品处理
[0011]a、将植物组织样品切割为截面不大于0.5cm2的植物组织样品条块；[0012]b、将植物组织样品条块放入保鲜袋，往保鲜袋装入5~10倍体积的组织固定剂，保鲜袋完全排除空气后扎紧，置阴凉处固定12~24小时；
[0013]C、固定后的植物组织样品，用移液枪去除保鲜袋中3/5~4/5比例的组织固定剂液体，并加入I~5g组织固定干粉；
[0014]d、然后转入4°C冰箱保存数月或-20°C冰箱长期保存。
[0015]本发明工艺流程简单，将植物样品放入配制好的组织固定剂后，即可实现植物组织的有效固定和保存，为野外采取新鲜植物材料提取植物基因组DNA样品、蛋白质及后续的实验提供安全快捷的材料，达到了节约能源、低炭环保和采摘后的植物组织材料的保存目的，实现了生态、经济和社会效益三者的有机结合。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1中为CTAB法对木薯叶片进行DNA提取，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外下成像示意图；
[0017]图2为采用脂肪酸脱饱和酶基因的引物对转基因木薯基因组DNA的可靠性进行PCR验证，用质粒作为阳性对照的模板，采用用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离在紫外下成像结果示意图；图中1-7分别对应1-7植物样品DNA为模板的PCR结果，其中M为marker ；阳性对照以质粒为模板；阴性对照以水为模板；
[0018]图3中的图A为直接提取植物样品蛋白后2-D结果；图B为用本发明组织固定剂固定植物样品之后提取蛋白后的2-D结果。
【具体实施方式】
[0019]为了详细说明本发明的技术内容、构造特征、以下结合实施方式并配合附图作进
一步说明 。
[0020]本发明一种用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法，包括组织固定剂配制、植物组织样品处理两个步骤:
[0021](1)、组织固定剂配制
[0022]a、取 500 ~550g(NH4)2S04、2.5gTris 碱、3.7g Na2EDTA,将上述三种成分混均获得组织固定干粉；
[0023]b、混均后的组织固定干粉加入700~SOOmL热开水充分搅拌溶化，3V~4°C冷却成饱和溶液有沉淀析出，PH为7.0~7.4 ;获得组织固定剂；
[0024](2)、植物组织样品处理
[0025]a、将植物组织样品切割为截面不大于0.5cm2的植物组织样品条块；
[0026]b、将植物组织样品条块放入保鲜袋，往保鲜袋装入5~10倍体积的组织固定剂，保鲜袋完全排除空气后扎紧，置阴凉处固定12~24小时(固定过夜)；
[0027]C、固定后的植物组织样品，可用移液枪去除保鲜袋中大部分的组织固定剂液体，并加入I~5g组织固定干粉；去除的组织固定剂液体占原有组织固定剂液体的60 %~80 % ；
[0028]d、然后转入4°C冰箱保存数月或_20°C冰箱长期保存。
[0029]对于水分过多或体积过大的植物组织样品，可采用未切割后直接将样品包埋在组织固定剂中的方式保存。
[0030]野外转基因木薯DNA提取及其模板的验证
[0031]经过上述固定剂固定过夜后的木薯叶片约0.2~0.3g洗净，再采用CTAB法对木薯叶片进行DNA提取，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外下成像结果如图1所示，用组织固定剂固定后用CTAB法提取的木薯基因组DNA没有发生降解等变化，可以看出DNA的完整性。
[0032]采用该基因(脂肪酸脱饱和酶基因)的引物对转基因木薯基因组DNA的可靠性进行PCR验证，用质粒作为阳性对照的模板，采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离在紫外下成像结果如图2所示，可以看到在1200bp处能检测到该基因的目的条带，经过验证说明所提的木薯DNA可用。
[0033]野外木薯蛋白质的提取
[0034]经过上述固定剂固定过夜后的木薯叶片0.5~1g洗净，再采用苯酚提取法对木薯叶片的蛋白质进行提取，用酶标仪定量之后跑聚丙烯酰胺凝胶2-D结果如图3B所示，用该方法提取的蛋白质在质量上不发生变化，可以用来做2-D等后续实验。
[0035]由以上结果可以看出，用本发明的组织固定剂进行植物组织材料进行固定后对植物基因组DNA和蛋白质进行提取，并不影响基因组DNA和蛋白质的质量，对后续的实验也不发生影响，为野外采摘植物样品提供了一种非常简单有效的方法。
[0036]本发明的用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法适用于任何的植物样品组织固定，不仅限于本发明实施例中的野外转基因木薯。
[0037]以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
【权利要求】
1.用于野外采样提取植物基因组DNA、蛋白质的组织固定方法，其特征在于包括以下步骤: (1)组织固定剂配制 a、取500~550g(NH4)2S04、2.5gTris碱、3.7g Na2EDTA,将上述三种成分混均，获得组织固定干粉； b、混均后的组织固定干粉加入700~SOOmL热开水充分搅拌溶化，3°C~4°C冷却成饱和溶液有沉淀析出，PH为7.0~7.4 ;获得组织固定剂； (2)植物组织样品处理 a、将植物组织样品切割为截面不大于0.5cm2的植物组织样品条块； b、将植物组织样品条块放入保鲜袋，往保鲜袋装入5~10倍体积的组织固定剂，保鲜袋完全排除空气后扎紧，置阴凉处固定12~24小时； C、固定后的植物组织样品，用移液枪去除保鲜袋中3/5~4/5比例的组织固定剂液体，并加入I~5g组织固定干粉； d、然后转入4°C 冰箱保存数月或_20°C冰箱长期保存。
【文档编号】C07K1/14GK103898091SQ201310378734
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】欧文军, 罗秀芹, 刘斌, 李开绵 申请人:中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所