修饰植物基因组的方法和手段的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用双链DNA断裂诱导酶以靶向方式紧靠现有原种事件修饰植物的基因组的方法和手段。还提供了植物，特别是棉花植物和制备此类植物的方法，所述植物对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂显示出耐受性。
【专利说明】修饰植物基因组的方法和手段
[0001]本申请是申请日为2012年8月14日、发明名称为“修饰植物基因组的方法和手段”的中国专利申请201280049574.7 (国际申请号PCT/EP2012/065867)的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及农学领域。更特别地，本发明提供使用定制设计的双链DNA断裂诱导酶在植物基因组中精确定位的核苷酸序列上引入靶向修饰，包括插入、缺失或取代的方法和手段。本发明还涉及包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含编码具有HPro活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID N0:1的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少IX田间剂量的至少一种HPro抑制剂的耐受性；并且提供制备此类植物的方法。
【背景技术】
[0003]在植物基因组中引入靶向修饰的需求，例如以向植物提供农学上有用的性状，如除草剂耐受性(包括控制在植物中外源DNA整合的定位)已变得日益重要。为了满足这一需求，已经开发了若干方法(综述参见Kumar (库马尔)和Fladung (弗拉东)，2001, Trendsin Plant Science (《植物科学趋势》)，6，ppl55_159)。这些方法大部分依赖于经由双链断裂诱导(DSBI)酶的表达，在靶向位置初始引入的双链DNA断裂。
[0004]经由罕见切割内切核酸酶(例如1-SceI)，通过诱导双链DNA断裂(DSB)，激活靶基因座和/或修复或供体DNA，已经示出出增加若干数量级的同源重组的频率(Puchta(普赫塔)等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(美国国家科学院院刊))，93，pp5055-5060 ;Chilton (奇尔顿)和 Que (秋)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，2003 ;D’Halluin (阿吕安)等人，2008Plant Biotechnol.J.(《植物生物技术杂志》)6，93-102)。
[0005]W096/14408描述了一种编码酶1-SceI的分离DNA。这种DNA序列可以并入克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。在基因作图和基因的定点插入中这些载体可以是有用的。
[0006]W000/46386描述了通过1-SceI诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、减弱和灭活一个基因或其他染色体DNA的方法。还披露了在需要其的个体中治疗或预防遗传性疾病的方法。进一步披露了嵌合的限制性内切酶。
[0007]W02005/049842描述了使用罕见分裂“双链断裂”诱导(DSBI)酶连同改进的1-SceI编码核苷酸序列改进植物中靶向DNA插入的方法和手段。
[0008]W02006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而在去除步骤期间不遗留痕迹并且不依靠体外培养，采用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的DSBI罕见分裂内切核酸酶去除选择的DNA。
[0009]W02008/037436描述了 W02006/105946方法和手段的变体，其中通过双链断裂诱导罕见分裂内切核酸酶诱导的选择的DNA片段的去除步骤处于种系特异启动子的控制下。该方法的其他实施例依赖在修复DNA的一端的非同源末端-连接和在另一端的同源重组。W008/148559描述了 W02008/037436方法的变体，即在真核细胞中(例如植物细胞)中通过同源重组用于将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而不遗留痕迹，采用用于去除在直接重复中侧翼是两个核苷酸序列的选择的DNA的方法。
[0010]W02003/004659披露了重组系统以及用于从真核生物染色体DNA去除核酸序列的方法。本发明还涉及转基因生物(优选地植物)，包含所述系统或由所述方法产生。
[0011 ] W02006/032426披露了改进的重组系统以及用于从植物基因组中消除标记序列的方法。具体地，本发明基于一种表达盒的用途，该表达盒包括欧芹泛素启动子，以及可操作地连接到其上的编码特异DNA-核酸内切酶序列的核酸序列。
[0012]美国临时申请61/493579和EP11004570.5描述了使用双链DNA断裂诱导酶和胚胎发生性愈伤组织以靶定方式修饰棉花植物的基因组的方法和手段。
[0013]此外，已经描述了这样的方法，其允许设计稀有切割内切核酸酶，以改变酶的底物或序列特异性，因此允许在目的基因座上诱导双链断裂，但不依赖于任何天然稀有切割内切核酸酶的识别位点的存在。简言之，可以使用设计用于识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然 限制性内切核酸酶，如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合的限制酶。此类方法已经描述于例如W003/080809、W094/18313或W095/09233和Isalan 等，2001，Nature Biotechnologyl9, 656-660 ；Liu 等 1997，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94, 5525-5530)中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶的另一方式描述于W02004/067736中。还可以通过如W02007/047859中描述的合理设计获得具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶或重新设计的大范围核酸酶。
[0014]W02007/049095描述了 “LADGLIDADG”归巢内切核酸酶变体，其在两个分开的亚结构域中具有突变，每一个亚结构域结合修饰的DNA靶半位点的不同部分，从而内切核酸酶变体能够切割包含每一个亚结构域结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。
[0015]W02007/049156和W02007/093836描述了具有新的切割特异性的1-CreI归巢内切核酸酶变体及其用途。
[0016]W02007/047859描述了合理设计的具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的大范围内切核酸酶。
[0017]WOl 1/064736描述了优化的内切核酸酶，以及使用优化的内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法。W011/064750描述了包含内切核酸酶和异源DNA结合域(其包含一个或多个Zn2C6锌指)的嵌合内切核酸酶，以及使用嵌合内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法，并且W011/064751描述了包含内切核酸酶和异源DNA结合域的嵌合内切核酸酶，以及使用嵌合内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法。
[0018]PCT/EP11/002894和PCT/EP11/002895描述了以靶定方式修饰包含嵌合基因的转基因植物的植物基因组的方法和手段，其中所述嵌合基因具有通常用于植物分子生物学中的DNA元件，以及重新设计的大范围内切核酸酶，以切割通常用于植物分子生物学中的该元件。[0019]W02009/006297描述了用于改变单子叶植物细胞和单子叶植物的基因组的方法和组合物，其涉及使用双链断裂诱导剂，以改变包含双链断裂诱导剂的识别序列的单子叶植物或植物细胞基因组序列。
[0020]Gao等2010，The Plant Journal61,第176 - 187页描述了使用重新设计的内切核
酸酶在玉米中进行可遗传定向诱变。
[0021]然而，为了有效产生农艺学有用性状的组合而不必借助于精细的育种方案或不必测试大量单一事件，因此仍然需要在功能上重新设计的大范围核酸酶(其可以识别紧靠已存在的原种事件的识别位点)，及其用途，以在单个遗传基因座上产生赋予农艺学上有用的性质的大量基因。
[0022]此类农艺学上有用的性状之一是对除草剂，如HPPD-抑制剂型除草剂的耐受性。HPro(羟苯丙酮酸二加氧酶)蛋白质是催化这样的反应的酶，在所述反应中对羟基苯丙酮酸(本文中缩写为HPP)(其为酪氨酸降解产物)被转化成尿黑酸(本文中缩写为HG)，尿黑酸为植物中生育酚和质体醌的前体(Crouch N.P.等(1997)Tetrahedron, 53，20，6993-7010，Fritze 等，(2004), Plant Physiologyl34:1388-1400)。生育酹作为膜结合的抗氧化剂起作用。质体醌首先作为光系统II (PSII)与细胞色素b6/f复合体之间的电子载体起作用，其次是八氢番茄红素去饱和酶(其参与类胡萝卜素的生物合成)的氧化还原辅助因子。
[0023]迄今为止，NCBI数据库中存在的多种生物的多于700条核酸序列被注解为编码具有HPro结构域的推测蛋白质。已经在现有技术中描述了若干HPro蛋白质及其一级序列，特别是细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas) (Riietschi 等,Eur.J.Biochem., 205, 459-466，1992，W096/38567)、植物，如拟南芥(W096/38567, Genebank AF047834)、胡萝卜(W096/38567, Genebank87257)、燕麦(Avena sativa) (W002/046387)、小麦(W002/046387)、宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla) (W002/046387)、蔡藜草(Cenchrus echinatus)(W002/046387)、硬直黑麦草(Lolium rigidum) (W002/046387)、苇叶羊茅(Festucaarundinacea) (W002/046387)、狗尾草(Setaria faberi) (W002/046387)、牛筋草(Eleusineindica) (W002/046387)、高粱(W002/046387)、球孢子菌属(Coccicoides) (GenebankC0ITRP)、日本黄连(Coptis japonica)(W006/132270) > 莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) (ES2275365)或哺乳动物，如小鼠或猪的HPH)。
[0024]对HPro的抑制导致光合作用的解偶联，缺乏辅助捕光色素(accessorylight-harvesting pigments),以及最重要地，由于缺少正常情况下由类胡萝卜素提供的光保护导致的UV照射和活性氧类别对叶绿体的破坏(褪色)(Norris等(1995)，PlantCell7:2139-2149)。光合活跃的组织的褪色导致生长抑制和植物死亡。
[0025]已经证明抑制HPro并且特异性结合酶以抑制HPP转化成尿黑酸的一些分子是非常有效的选择性除草剂。目前，大多数市售HPro抑制剂型除草剂属于这三个化学家族之 [0026]I)三酮类，例如横草酮(sulcotrione)、甲基横草酮(mesotrione);环横酮(tembotrione) ；tefuryltrione ；bicyclopyrone ;双环石黄草酮(benzobicyclon)
[0027]2)异唑类，例如异5恶氟草(isoxaflutole)，或对应的二酮腈类化合物。在植物中，异唑类，如异％氟草被快速转化成二酮腈类化合物,其显示HPPD抑制剂性质；和[0028]3)pyrazolinones,例如，苯批唑草酮(topramezone)、横酸草批唑(pyrasulfotole)和节草唑(pyrazoxyfen)。
[0029]这些抑制HPro的除草剂可在展现出代谢耐受性的作物植物，如玉米(Zea mays)(它们在其中被迅速降解)中使用以抵抗草(grass)和/或阔叶杂草(Schulz等，1993 ；Mitchell 等，2001 ；Garcia 等，2000 ；Pallett 等，2001)。为拓展这些抑制 HPPD 的除草剂的范围，已经进行了若干努力，以赋予植物，特别是没有代谢耐受性或代谢耐受性较差的植物在农艺学田间条件下可接受的耐受性水平。
[0030]在该上下文中，已经首次证明转化的敏感植物中仅天然HPro酶的过表达就为转化的植物提供对HPro抑制剂的有效耐受性(W096/38567)。
[0031]另一种策略是突变HPro，以获得下述靶酶，其保留其催化HPP转化为尿黑酸的性质，同时对HPro抑制剂不如突变前的天然HPro敏感。
[0032]该策略已经通过利用编码在其C末端部分的一个或多个位置上突变的HPro酶的基因转化植物而成功应用于产生对HPro抑制剂耐受的植物(W099/24585)。在可以赋予对HPPD抑制剂耐受性的HPH)酶的C末端部分的有用突变中，显示某些突变提供对某些二酮腈类除草剂的增加的耐受性，例如突变Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile和Gly336Trp (突变氨基酸的位置参照假单胞菌属HPH)而被指出)。
[0033]更近来，在专利申请W02009/144079中已经显示，HPPD的位置336处的某些特定氨基酸取代在体外提供对某些HPro抑制剂型除草剂的耐受性。
[0034]US2010/0 197503还指出了来自燕麦的HPTO活性位点内或附近的不同位置上的许多突变，并检查了某些HPro抑制剂，如磺草酮对一些这些突变的HPro酶的抑制。
[0035]尽管开发针对上文所述的一些HPro抑制剂型除草剂显示出耐受性的植物获得了这些成功，但仍期望开发和/或改良特定植物，如棉花对较多的、较新的或对若干不同的HPro抑制剂的耐受性，特别是对属于三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、庄无忌、bicyclopyrone和双环磺草酮)、pyrazolinones (例如，苯批唑草酮、磺酰草批唑和
pyrazoxifen) 和异_唑类(例如异感氟草)或对应的二酮腈类化合物的类别的HPH)抑
制剂的耐受性。如本文在不同实施方案、实施例和权利要求中描述后解决了该问题。
[0036]如下文所述在本发明不同的详细实施方案以及权利要求中解决了这些及其他问题。
[0037]发明概述
[0038]在一个实施方案中，本发明涉及在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤:
[0039]在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；
[0040]选择植物细胞,其中已经修复了所述双链DNA断裂,导致在所述预选位点处对基因组的修饰，其中所述修饰选自
[0041]1.至少一个核苷酸的替换；
[0042]i1.至少一个核苷酸的缺失；
[0043]ii1.至少一个核苷酸的插入；或[0044]iv.1.-1i1.的任何组合；
[0045]其特征在于所述预定位点和/或识别位点紧靠原种事件。
[0046]在特定实施方案中，事件是GHB119。
[0047]在另一个实施方案中，识别序列包含在SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中。
[0048]所述识别序列可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
[0049]本发明还提供在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤:
[0050]在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；
[0051]选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致在所述预选位点处对基因组的修饰，其中所述修饰选自
[0052]至少一 个核苷酸的替换；
[0053]至少一个核苷酸的缺失；
[0054]至少一个核苷酸的插入；或
[0055]1.-1i1.的任何组合；
[0056]其特征在于所述识别位点包含SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0057]可以通过向所述细胞中递送包含编码(一起)所述内切核酸酶的一个或多个嵌合基因的核酸分子来向所述细胞中引入DSBI酶。所述DSBI酶可以是单链大范围核酸酶或一对大范围核酸酶，其识别或一致识别所述预定位点并诱导所述双链断裂。
[0058]在特定实施方案中，所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对来自1-Crel，并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元I中:
[0059]a.位置32处的S ;
[0060]b.位置33处的Y ;
[0061]c.位置38处的Q ;
[0062]d.位置80处的Q ;
[0063]e.位置40处的S ;
[0064]f.位置42处的T ;
[0065]g.位置77处的R ;
[0066]h.位置68处的Y ;
[0067]1.位置70处的Q ;
[0068]j.位置75处的H ;
[0069]k.位置44处的T ;
[0070]1.位置24处的I ;
[0071]m.位置26处的Q ;
[0072]η.位置28处的K ;
[0073]ο.位置30处的N。
[0074]并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元2中:
[0075]p.位置70处的S ;
[0076]q.位置44处的Q ;[0077]r.位置24处的K ;
[0078]s.位置26处的A ;
[0079]t.位置28处的K ;
[0080]u.位置30处的N ;
[0081]V.位置32处的S ;
[0082]w.位置33处的Y ;
[0083]X.位置38处的Q ;
[0084]y.位置80处的Q ;
[0085]Z.位置40处的S ；
[0086]aa.位置 42 处的 T ;
[0087]bb.位置 77 处的 Q ;
[0088]CC.位置 68 处的 Y。
[0089]所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对可以包含SEQ ID N0.6从氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。
[0090]所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对还可以由包含或一起包含SEQ ID N05的从核苷酸位置3120-3584和位置3698-4169的核苷酸序列的一条或多条核苷酸序列编码。
[0091]在一个实施方案中，在步骤b之前，向所述细胞中递送修复DNA分子，所述修复DNA分子用作修复所述双链DNA断裂的模板。
[0092]所述修复DNA可以包含至少一个侧翼区，其包含与所述预定位点上游或下游DNA区具有充分同源性的核苷酸序列，以允许与所述上游或下游DNA区重组。或者，所述修复DNA可以包含位于所述修复DNA相反端的两个侧翼区，所述侧翼区之一包含与所述预定位点的上游DNA区具有充分同源性的核苷酸序列，另一个侧翼区包含与所述预定位点的下游序列具有充分同源性的核苷酸序列，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区进行重组。
[0093]在其他实施方案中，所述修复DNA包含可选择标志物基因和/或植物可表达的目的基因。所述植物可表达的目的基因可以选自除草剂耐受基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、非生物胁迫抗性基因、参与油类生物合成、碳水化合物生物合成的酶、参与纤维素强度或纤维素长度的酶、参与次生代谢物生物合成的酶。
[0094]在仍另一实施方案中，将在预定位置上基因组被修饰的植物细胞进一步再生成植物，其在所述预定位置上也含有所述修饰。然后所述植物可以与另一植物进行杂交，产生也含有基因组修饰的后代。
[0095]本发明还涉及通过上文所述的方法获得的在基因组的预定位点上包含修饰的植物细胞。本发明还包括:植物、植物部分、种子或其繁殖材料，在基因组的预定位点上包含修饰，通过本发明的方法获得或基本上由本发明的植物细胞组成。
[0096]还提供培养本发明的植物，即在基因组的预定位点上包含修饰的植物的方法，其包括向所述植物或其中生长所述植物的基质应用化学物质的步骤，以及包括用于产生在基因组的预定位点上包含修饰的植物的方法，其包括使基本上由本发明的植物细胞组成的植物或本发明的植物(包含预期基因组修饰的植物细胞和植物)与另一植物或其本身杂交并任选地收获种子的方法。[0097]在一个实施方案中，本发明还提供包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含
[0098](a)编码具有HPH)活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ IDNO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少IX田间剂量的至少一种HPH)抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接
[0099](b)植物可表达的启动子和任选地
[0100](C)翻译终止和多腺苷酸化区。
[0101]具有HPro活性的蛋白质可以与SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。可以优化编码具有HPro活性的蛋白质的核酸序列用于在棉花中表达。所述蛋白质可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或可以由包含SEQ ID NO:21的从nt949_nt2025的核苷酸序列的核酸编码。
[0102]所述棉花植物细胞、植物部分、植物或种子具有对至少1.5X田间剂量的所述至少一种HPro抑制剂，或至少2X田间剂量的所述至少一种HPro抑制剂，或至少4X田间剂量的所述至少一种HPro抑制剂的耐受性。
[0103]所述至少一种HPro抑制剂可以选自甲基磺草酮、异P恶氟草、苯吡唑草酮、pyrasulfutole 和环横酮。
[0104]本发明的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子可以对至少两种HPro抑制剂，优选至少三种HPro抑制剂，更优选至少四种HPro抑制剂，如至少5种或至少6种HPro抑制剂耐受。
[0105]本发明的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子的嵌合基因可以包含SEQ IDNO: 20从位置88-位置2714的核酸序列。
[0106]本发明的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子还可以包含至少一个其他嵌合基因，其包含编码这样的酶的核酸序列，所述酶向植物提供对非HPro抑制剂的除草剂的耐受性或提供对至少一种昆虫或真菌种的耐受性。
[0107]在另一实施方案中，本发明提供用于获得对至少IX田间剂量的至少一种HPro抑制剂耐受的棉花植物或植物细胞的方法，其包括
[0108]-引入嵌合基因，其包含:
[0109](a)编码具有HPro活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ IDNO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少IX田间剂量的至少一种HPH)抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接
[0110](b)植物可表达的启动子和任选地
[0111](C)翻译终止和多腺苷酸化区。
[0112]还提供用于控制棉花植物附近或植物田地中杂草的方法，其包括
[0113]-向棉花植物附近或棉花植物田地应用至少IX田间剂量的至少一种HPro抑制剂。
[0114]在本发明的方法中，所述至少一种HPro抑制剂可以选自甲基磺草酮、异氟草、
苯批唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。以至少1.5X、至少2X或至少4X的田间剂量应用所述至少一种HPH)抑制剂。
[0115]在本发明方法的特定实施方案中，所述至少一种HPro抑制剂是异*恶氟草和甲基磺草酮，其中所述异1#氟草在出苗前应用，而所述甲基磺草酮在出苗后应用。
[0116]附图简述
[0117]图1:识别位点以及与不同的大范围核酸酶单体单元C0T5和C0T6的氨基酸的相互作用的图示。
[0118]图2:单链C0T-5/6大范围核酸酶的氨基酸序列，其包含SV40核定位信号(氨基酸1-10)、C0T-5亚基(氨基酸11-165)、接头序列(氨基酸166-203)和C0T-6亚基(氨基酸 204-360)。
[0119]图3:通过至少一侧同源重组靶向插入的图表概述。剪刀表示DSBI酶(C0T-5/6)的识别位点，方箭头(block arrow)代表启动子，小的矩形代表终止子，而大的矩形代表基因，小箭头代表PCR引物，双头箭代表DNA印迹片段，垂直方箭头代表限制酶切位点，虚线代表侧翼DNA序列，其中同源区由连谱号表示。修复DNA载体pCV211包含2mEPSPS基因和HPro-336W，其侧翼为与GHB119原种事件3’侧翼序列中的C0T-5/6识别位点周围区域具有同源性的侧翼区。C0T-5/6诱导的双链DNA断裂后，pCV211载体的1561bp和2072bp侧翼区与GHB119的3’侧翼序列的对应区域之间同源重组，PCV211载体的2mEPSPS基因和HPPD-336W基因被插入到靶位点上。可以使用引物对IB617xIB572和IB616xIB572通过PCR并利用针对EPSPS、HPH)或Cry2Ae的探针在Dralll/StuI消化的基因组DNA上通过DNA印迹鉴定Ilkb基因组带来鉴定正确叠加的事件。
[0120]本发明不同实施方案的描述
[0121]本发明基于这样的观察，即可以获得在功能上重新设计的大范围核酸酶，其特异性识别并切割核苷酸 序列(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 -图1)，所述核苷酸序列紧靠现有事件存在，即棉花事件GHB119(描述于2008/151780，保藏号ATCC PTA-8398)，其包含Cry2AE基因和bar基因(分别赋予鳞翅目抗性和草铵膦(glufosinate)耐受性)。使用该特异的大范围核酸酶，可以将包含EPSPS基因和HPH)基因(分别赋予对草甘膦(glyphosate)和HPH)抑制型除草剂的耐受性)的额外DNA片段插入到现有GHBl 19事件的少数kb内，由此产生应该作为单个遗传单位遗传的四倍基因叠加。
[0122]因此产生了棉花植物，其包含编码具有HPro活性的蛋白质的嵌合DNA分子，其中对应于突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescer^HPH)蛋白质位置336的位置上的甘氨酸(Gly或G)的保守氨基酸已经被色氨酸(Trp或W)所替换。
[0123]此外惊奇地发现，植物，特别是棉花植物显示对至少IX田间剂量的若干HPro抑制
剂型除草剂，如甲基磺草酮、异》恶氟草、环磺酮、pyrasulfutole和苯吡唑草酮或如本文列
出的任何其他可应用HPH)抑制剂的耐受性，所述植物包含导致这样的蛋白质表达的嵌合基因，所述蛋白质具有HPH)活性，在对应于荧光假单胞菌的蛋白质氨基酸序列的位置336的位置上的保守天然氨基酸残基Gly突变为Trp，无论是四倍叠加(即靶定的)或是通过随机转化产生的。令人惊奇的是，本发明人发现，表达具有HPH)活性，在对应于荧光假单胞菌的蛋白质氨基酸序列的位置336的位置上的保守天然氨基酸残基Gly突变为Trp的蛋白质的植物，特别是棉花植物显示对至少IX田间剂量的若干HPH)抑制剂的耐受性。
[0124]能够紧靠现有原种事件引入基因组修饰具有若干优势。首先，修饰将与较早事件共分离，由此避免组合单一事件赋予的某些性状通常需要的复杂育种方案。其次，修饰将在有利的基因组环境中发生，用于表达起因于修饰的想要的性状，因为也假定现有的原种事件由于其特定基因组定位而显示正确的、适当的和稳定的空间和时间表型表达，如下文详细说明。
[0125]因此，在一个实施方案中，本发明涉及在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤:
[0126]在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；
[0127]选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致在所述预选位点处对基因组的修饰，其中所述修饰选自
[0128]1.至少一个核苷酸的替换；
[0129]i1.至少一个核苷酸的缺失；
[0130]ii1.至少一个核苷酸的插入；或
[0131]iv.1.-1i1.的任何组合；
[0132]其特征在于所述预定位点和/或所述识别序列紧靠现有的原种事件。
[0133]如本文所用，“双链DNA断裂诱导的稀有切割内切核酸酶”是能够在特定核苷酸序列(其称为“识别位点”)上诱导双链DNA断裂的酶。稀有切割内切核酸酶在如下意义上是稀有切割的，即由于其长的识别序列(通常约14-40nt)，它们甚至在更大的植物基因组中具有非常低的切割频率，例如，每个基因组它们仅切割10次、仅5次、仅4次、仅3次、仅2次、或仅I次。归巢内切核酸酶由此类稀有切割内切核酸酶的家族组成，有时候也称为大范围核酸酶。它们由内含子编码，不依赖于基因或间插序列，并且呈现明显的结构和功能性质，将其区别于一般来自细菌限制性修饰的类型II系统的更经典的限制酶。它们的识别位点具有一般的不对称性，其与大多数限制酶识别位点的特征性二重对称性不同。已经显示由内含子编码的若干归巢内切核酸酶或内含肽促进其各自遗传元件归巢到等位的无内含子或无内含肽位点中。通过在无内含子或无内含肽等位基因中产生位点特异性的双链断裂，这些核酸酶产生重组基因端，其参与基因转换过程，该过程复制编码序列并导致DNA水平上插入内含子或间插序列。
[0134]—种良好表征的标记的寻祀内切核酸酶是1-Scel。1-SceI是一种位点特异性内切核酸酶，是造成酿酒酵母中位于线粒体中内含子移动的原因。该酶是由21S rRNA基因可任选的内含子Sc LSU.1编码的并且在产生具有3’ OH突出端的4bp交错切口的内含子插入位点引发双链DNA断裂。1-SceI内切核酸酶的识别位点扩大到18bp的非对称序列(Colleaux(科莱阿克斯)等人1988Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国国家科学院院刊》85:6022-6026)。1-SceI的氨基酸序列以及线粒体1-SceI基因的通用密码等效物已经由例如TO96/14408提供。W096/14408进一步披露了多个1-SceI蛋白突变体，这些突变体仍然是功能性的。 [0135]PCT申请PCT/EP04/013122(并入本文作为参考)提供1-SceI的合成的核苷酸序列变体，其已经被优化用于在植物中表达。
[0136]其他稀有切割DSB诱导酶及其各自识别位点的列表提供在W003/004659的表1中(第17-20页)(并入本文作为参考)。这些包括1-Sce 1、1-Chu 1、1-Dmo 1、1-Cre 1、1-Csm 1、P1-Fli 1、Pt-Mtu 1、1-Ceu 1、1-Sce I1、1-Sce II1、HO、P1-Civ I, P1-Ctr 1、P1-Aae I,P1-BSU 1、PI_Dha1、PI_Dra I,P1-Mav I,P1-Mch I,P1-Mfu I,P1-MfI I,P1-Mga1、P1-Mgo 1、P1-Min 1、P1-Mka I, P1-Mle 1、P1-Mma I, P1-Msh I, P1-Msm 1、P1-Mth 1、P1-Mtu I,P1-Mxe I,P1-Npu I,P1-Pfu I,P1-Rma I,P1-Spb I,P1-Ssp I,P1-Fac I,P1-Mja1、P1-Pho 1、P1-Tag 1、P1-Thy 1、P1-Tko I 或 P1-Tsp I。
[0137]此外，用于设计识别基本上任何所选靶核苷酸序列的定制稀有切割内切核酸酶的方法是可用的。简言之，可以使用设计用于识别特异性核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制酶，如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合的限制酶。这些酶一般被称为锌指内切核酸酶(ZFEs)。此类方法已经描述于例如W003/080809、W094/18313 或 W095/09233 和 Isalan 等，2001，Nature Biotechnologyl9,656-660 ；Liu 等 1997，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94, 5525-5530)中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶的另一方式描述于W02004/067736中。还可以通过如W02007/047859中描述的合理设计获得具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶。定制设计的稀有切割内切核酸酶的另一实例包括所谓的TALE核酸酶，其基于来自细菌属黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录激活因子样效应子(TALEs)，其与例如FOKI的催化结构域融合。这些TALEs的DNA结合特异性定义为串联排列的34/35氨基酸重复单元的重复可变双残基(RVDs)，其可以被修饰，以识别特异的靶序列(Christian等，2010，Geneticsl86:757 - 761、W011/072246、W010/079430 和 W011/146121。此类定制设计的内切核酸酶还被称为非天然存在的内切核酸酶。
[0138] 因为重新设计的大范围核酸酶来自天然存在的内切核酸酶，因此可用的潜在识别位点不是完全随机的，而是看起来与作为重新设计的大范围核酸酶基础的天然存在的内切核酸酶最初识别的核苷酸序列具有一定程度的相似性。Gao等(2010，The Plant Journal,第1-11页)还说明了，修饰1-CreI的DNA结合特征的基于结构的蛋白质设计方法是基于对1-Cre1-DNA共晶体结构的视觉观察，其导致对大量氨基酸取代的预测，所述氨基酸取代改变其识别位点的特定位置上的1-CreI碱基偏好性。通过实验评价单个氨基酸取代，并且向可以“混合和匹配”的突变数据库中添加赋予碱基偏好想要的改变的那些氨基酸取代，以产生识别高度不同的DNA位点的1-CreI的衍生物。理论上，使用目前突变数据库可以获得的组合多样性足以在随机DNA序列中大约每1000bp靶向改造的内切核酸酶。
[0139]如本文所用，“事件”定义为(人造)遗传基因座，由于遗传改造，其在特定基因组位置上携带包含至少一个拷贝的目的基因或多个目的基因的外源DNA或转基因。事件的典型等位状态是存在或缺失外源DNA。事件的表型特征在于转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于转基因的限制性图谱(例如通过Southern印迹确定)、转基因的上游和/或下游侧翼序列(反映了基因组位置)、分子标志物的位置和/或转基因的分子构型。一般地，利用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物导致包含多个单独事件(其每一个是独特的)的转化体群体。事件的特征在于外源DNA和至少一个侧翼序列。
[0140]如本文所用，原种事件为基于转基因的表达和稳定性及其赋予的性状，以及其与包含它的植物的最佳农艺学特性的相容性从一组事件选择的事件，其通过用同一转化DNA转化而获得。因此原种事件选择的标准为一种或多种，优选两种或多种，有利地为所有下列的标准:
[0141]a)外源DNA的存在不损害植物的其他所期望的特性，如与农艺学性能或商业价值相关的那些特性(例如不引起对疾病的增加的易感性，不引起产量下降，或不引起增加的倒伏等)；
[0142]b)事件的特征在于充分定义的稳定遗传的分子构型，且为其可开发用于鉴定对照的适当工具；
[0143]c)在事件的杂合(或半合子)和纯合状态下，目的基因在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示正确、适当且稳定的空间和时间表型表达，在所述环境条件中携带所述事件的植物可能处于正常的农艺学用途。
[0144]还优选外源DNA与植物基因组的位置有关，其中所述位置允许易于渐渗想要的商业遗传背景。
[0145]事件作为原种事件的状态通过将原种事件渐渗不同的相关遗传背景并且观察对例如上述a)、b)和c)中的一个、两个或所有标准的符合而证实。
[0146]因此“原种事件”指包含外源DNA的遗传基因座，其满足上述标准。植物、植物材料或后代如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。
[0147]—旦已对外源DNA的一个或两个侧翼序列进行了测序，可用分子生物学技术开发特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中这种(这些)序列的引物和探针。例如可开发PCR方法来鉴定生物样品(如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的原种事件。此类PCR基于至少两条特异 “引物”，一条识别原种事件5’或3’侧翼序列中的序列，而另一条识别位于外源DNA中的序列。所述引物优选具有15-35个核苷酸的序列，其在优化的PCR条件下分别“特异性识别”原种事件5’或3’侧翼序列中的序列和原种事件的外源DNA中的序列，以便从包含原种事件的核酸样品中扩增出特异片段(“整合片段”或区别性扩增子)。这意味着在优化的PCR条件下植物基因组或外源DNA中只有靶向整合片段而没有其他序列被扩增。
[0148]可根据本发明方法使用的含有原种转化事件或转化事件组合的转基因植物包括例如在多个国家或地区调控管理机构的数据库中列出的那些，并包括事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于W02006/128569);事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于W02006/128570);事件1445(棉花，除草剂耐受性，未保藏，描述于 US2002120964 或 W02002/034946);事件 17053(稻，除草剂耐受性，保藏为 PTA-9843,描述于W02010/117737);事件17314(稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9844，描述于W02010/117735);事件281-24-236 (棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233，描述于W02005/103266或US2005216969);事件3006-210-23 (棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233，描述于US2007143876或W02005/103266);事件3272 (玉米，质量性状，保藏为 PTA-9972,描述于 W02006098952 或 US2006230473);事件 40416 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11508，描述于W02011/075593);事件43A47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11509,描述于W02011/075595);事件5307(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-9561,描述于W02010/077816);事件ASR_368(糠穗草，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4816,描述于US2006162007或W02004053062);事件B16 (玉米，除草剂耐受性，未保藏，描述于US2003126634);事件BPS-CV127-9 (大豆，除草剂耐受性，保藏为NCMB N0.41603,描述于W02010/080829);事件CE43-67B (棉花，昆虫控制，保藏为 DSM ACC2724,描述于 US2009217423 或 TO2006/128573);事件 CE44-69D (棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US20100024077);事件CE44-69D (棉花，昆虫控制，未保藏，描述于W02006/128571);事件CE46-02A (棉花，昆虫控制，未保藏，描述于W02006/128572)；事件C0T102(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US2006130175或W02004039986);事件C0T202 (棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US2007067868或W02005054479);事件C0T203 (棉花，昆虫控制，未保藏，描述于W02005/054480);事件DAS40278 (玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-10244,描述于TO2011/022469);事件DAS-59122-7 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTAl 1384，描述于US2006070139);事件DAS-59132 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，描述于W02009/100188);事件DAS68416 (大豆，除草剂耐受性，保藏为 ATCC PTA-10442,描述于 W02011/066384 或 W02011/066360);事件DP-098140-6 (玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8296,描述于US2009137395或W02008/112019);事件DP-305423-1 (大豆，质量性状，未保藏，描述于US2008312082或TO2008/054747);事件DP-32138-1 (玉米，杂交系统，保藏为ATCC PTA-9158,描述于US20090210970 或 W02009/103049);事件 DP-356043-5 (大豆，除草剂耐受性，保藏为 ATCCPTA-8287,描述于 US20100184079 或 W02008/002872);事件 EE-1 (茄子，昆虫控制，未保藏，描述于W02007/091277);事件FI117 (玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209031，描述于US2006059581 或 W01998/044140);事件 GA21 (玉米，除草剂耐受性，保藏为 ATCC209033,描述于US2005086719或W01998/044140)；事件GG25 (玉米，除草剂耐受性，保藏为 ATCC209032,描述于 US2005188434 或 W01998/044140);事件 GHBl 19 (棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8398,描述于W02008/151780);事件GHB614 (棉花，除草剂耐受性，保藏为 ATCC PTA-6878,描述于 US2010050282 或 W02007/017186);事件 GJll (玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209030，描述于US2005188434或W01998/044140);事件GMRZ13 (甜菜，病毒抗性，保藏为NCMB-41601，描述于W02010/076212);事件H7-1 (甜菜，除草剂耐受性，保藏为 NCMB41158 或 NCMB41159，描述于 US2004172669 或 W02004/074492)；事件JOPLIN1 (小麦，疾病耐受性，未保藏，描述于US2008064032);事件LL27 (大豆，除草剂耐受性，保藏为 NCIMB41658,描述于 W02006/108674 或 US2008320616);事件 LL55 (大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB41660,描述于W02006/108675或US2008196127)；事件LLcotton25(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3343,描述于W02003013224或US2003097687);事件LLRICE06 (稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC-23352,描述于US6468747或W02000/026345)；事件LLRICE601 (稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2600,描述于US20082289060或W02000/026356)；事件LY038 (玉米，质量性状，保藏为ATCCPTA-5623,描述于 US2007028322 或 W02005061720);事件 MIR162 (玉米，昆虫控制，保藏为 PTA-8166,描述于 US2009300784 或 W02007/142840);事件 MIR604 (玉米，昆虫控制，未保藏，描述于US2008167456或W02005103301);事件MON15985 (棉花，昆虫控制，保藏为 ATCC PTA-2516,描述于 US2004-250317 或 W02002/100163);事件 M0N810 (玉米，昆虫控制，未保藏，描述于US2002102582)；事件MON863 (玉米，昆虫控制，保藏为ATCCPTA-2605,描述于 W02004/011601 或 US2006095986);事件 MON87427 (玉米，授粉控制，保藏为ATCC PTA-7899,描述于W02011/062904);事件M0N87460 (玉米，胁迫耐受性，保藏为 ATCCPTA-8910,描述于 W02009/111263 或 US20110138504)；事件 M0N87701 (大豆，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-8194,描述于US2009130071或W02009/064652);事件M0N87705 (大豆，质量性状-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-9241,描述于US20100080887或TO2010/037016)；事件M0N87708 (大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA9670,描述于W02011/034704);事件MON87754 (大豆，质量性状，保藏为ATCCPTA-9385，描述于TO2010/024976);事件MON87769 (大豆，质量性状，保藏为ATCC PTA-8911,描述于US20110067141或W02009/102873);事件M0N88017 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为 ATCC PTA-5582,描述于 US2008028482 或 W02005/059103)；事件 MON88913 (棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4854,描述于W02004/072235或US2006059590)；事件M0N89034 (玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-7455,描述于W02007/140256或US2008260932)；事件MON89788 (大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6708,描述于US2006282915或W02006/130436);事件MSll (油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-850或PTA-2485，描述于W02001/031042);事件MS8 (油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为 ATCC PTA-730,描述于 W02001/041558 或 US2003188347);事件 NK603 (玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2478,描述于US2007-292854);事件PE_7(稻，昆虫控制，未保藏，描述于W02008/114282);事件RF3 (油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-730,描述于 W02001/041558 或 US2003188347);事件 RT73 (油菜，除草剂耐受性，未保藏，描述于W02002/036831或US2008070260);事件T227-1 (甜菜，除草剂耐受性，未保藏，描述于W02002/44407或US2009265817);事件T25 (玉米，除草剂耐受性，未保藏，描述于US2001029014或W02001/051654);事件T304-40 (棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为 ATCC PTA-8171,描述于 US2010077501 或 W02008/122406);事件 T342-142 (棉花，昆虫控制，未保藏，描述于W02006/128568);事件TC1507 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，描述于US2005039226或W02004/099447);事件VIP1034 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3925.，描述于W02003/052073)，事件32316 (玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为P TA-11507，描述于W02011/084632)和事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11506，描述于W02011/084621)。
[0149]
【权利要求】
1.包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含 (a)编码具有HPH)活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少IX田间剂量的至少一种HPH)抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接 (b)植物可表达的启动子和任选地 (c)翻译终止和多腺苷酸化区。
2.权利要求1的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述蛋白质与SEQIDNO:21的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。
3.权利要求1或2的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中优化编码具有HPro活性的蛋白质的所述核酸序列用于在棉花中表达。
4.权利要求1-2任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列或由包含SEQ ID NO: 20从nt949_nt2025的核苷酸序列的核酸编码。
5.权利要求1-4任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其对至少1.5X田间剂量的所述至少一种HPro抑制剂具有耐受性。
6.权利要求1-5任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其对至少2X田间剂量的所述至少一种HPr o抑制剂具有耐受性。
7.权利要求1-6任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述至少一种HPPD抑制剂选自甲基磺草酮、异感氟草、苯批唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。
8.权利要求7的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其对至少两种HPH)抑制剂，优选至少三种HPro抑制剂，更优选至少四种HPro抑制剂，如至少5种或至少6种HPro抑制剂耐受。
9.权利要求1-8任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述嵌合基因包含SEQ ID NO: 20从位置88-位置2714的核酸序列。
10.用于获得对至少IX田间剂量的至少一种HPro抑制剂耐受的棉花植物或植物细胞的方法，其包括 -导入嵌合基因，其包含: (a)编码具有ΗΡΗ)活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少IX田间剂量的至少一种HPH)抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接 (b)植物可表达的启动子和任选地 (c)翻译终止和多腺苷酸化区。
11.用于控制棉花植物附近或植物田地中杂草的方法，其包括 -向棉花植物附近或棉花植物田地应用至少IX田间剂量的至少一种HPro抑制剂。
12.权利要求10或11的方法，其中所述至少一种HPro抑制剂选自甲基磺草酮、异5恶氟草、苯批唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中以至少1.5X、至少2X或至少4X的田间剂量应用所述至少一种HPro抑制剂。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中所述至少一种HPro抑制剂是异1#氟草和甲基磺草酮，其中所述异0恶氟草在出苗前应用，而所述甲基磺草酮在出苗后应用。
15.编码具有HPro活性的蛋白质的核酸序列产生棉花植物或其植物细胞、植物部分或种子的用途，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，所述棉花植物对至少IX田间剂量的至少一种HPPD抑制剂耐受。
【文档编号】A01H5/00GK103981149SQ201410204701
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年8月14日 优先权日:2011年8月22日
【发明者】K·达伦, J·迪特根, S·简森斯, F·莫伊勒韦特, K·韦特林斯, H·莫泽, T·维尔德, R·海因, U·比克尔斯, L·特落林德尔, G·亨宁格尔 申请人:拜尔作物科学公司, 拜尔作物科学股份公司, 拜耳作物科学有限公司