专利名称：自加工的植物及植物部分的制作方法
技术领域：
本发明基本涉及植物分子生物学领域，更具体而言，涉及生产能够表达加工酶(processing enzyme)的植物，所述酶能够给该植物或其产品带来期望的特性。
背景技术：
酶通常被用来加工各种各样的农产品，如木材，水果和蔬菜，淀粉，果汁等等。一般而言，加工所用的酶是从不同来源以工业规模生产并回收的，例如来自微生物微生物发酵(芽孢杆菌α-淀粉酶)或从植物分离(咖啡β-半乳糖苷酶或木瓜蛋白酶来自植物部分)。通过在适当含水量，温度，时间和机械混合条件下混合酶和底物，使酶反应以商业上可行的方式实现，酶制品在不同处理应用中得到使用。这些方法涉及酶的生产，酶制剂的制备，酶与底物的混合，以及将混合物置于适当条件下以促进酶促反应等分离的步骤。能够减少或省下时间，能量，混合，资本投入，和/或酶生产成本，或者生产出改良或新型产品的方法都是有用和有益的。对这些方面有所需求的一个实例就是玉米粉碎领域。
目前，玉米是经过粉碎以获得玉米淀粉和其它玉米粉碎副产品，如玉米面筋饲料，玉米面筋粉和玉米油。经过这个过程得到的淀粉通常还需要进一步被处理成其它产品，如衍生淀粉和糖，或通过发酵来制备包括醇类或乳酸在内的一系列产品。处理玉米淀粉经常涉及各种酶的应用，特别是能够水解并转化淀粉为可发酵糖或果糖的酶(α-和葡萄糖-淀粉酶，α-葡糖糖苷酶，葡萄糖异构酶等)。目前商业应用的处理过程均为资本密集型，因为必须建造非常巨大的碾碎机才能以合理成本效率所需的大规模处理玉米。另外，这个过程需要单独制备水解或修饰淀粉的酶然后需要机械来混合酶和底物以生产水解的淀粉产物。
从玉米粒回收淀粉的过程已众所周知，并涉及湿磨加工。玉米湿磨法包括以下步骤浸泡玉米粒，磨碎玉米粒和分离玉米粒的各组分。玉米粒被浸泡在浸泡容器内，该容器内有约120°F的对流水流，将玉米粒在浸泡容器内浸泡24-48小时。该浸泡水通常含有约0.2％重量百分比的二氧化硫。处理中使用二氧化硫来减少微生物的生长，同时也减少胚乳蛋白中的二硫键，以促进淀粉-蛋白的有效分离。通常，每蒲式耳玉米使用约0.59加仑浸泡水。浸泡水被认为是废液，通常含有不希望水平的残余二氧化硫。
然后将浸泡的玉米粒脱水，并进行一系列摩擦型粉碎机处理。第一套摩擦型粉碎机能够破裂玉米粒，从玉米粒的剩余部分释放出胚芽。以Bauer品牌出售一种适于湿磨的商业摩擦型粉碎机。通过离心从玉米粒的剩余部分分离出胚芽。一种常用的商业离心分离器是Merco离心分离器。摩擦粉碎机和离心分离器都是需要能量才能操作的大型昂贵机械。
该过程的下一个步骤是将剩余的玉米粒组分，包括淀粉，外皮，纤维和面筋继续进行另一套摩擦粉碎处理并传送通过清洗筛，从淀粉和面筋(胚乳蛋白)中分离出纤维组分。淀粉和面筋会通过这个筛网而纤维则不会。通过离心或在离心后进行第三次粉碎来从胚乳蛋白中分离出淀粉。离心形成了淀粉浆，将其脱水，并用新鲜水洗涤，干燥到约12％含水量。这种基本上纯的淀粉通常进一步用酶处理。
由于去除种子外皮、胚和胚乳蛋白可以将淀粉有效地与酶接触，这样获得的水解产物中其它玉米粒组分的污染也相对较少，因此要从玉米粒的其它组分中分离淀粉。分离还可以保证玉米粒的其它组分被有效回收，继而作为副产品出售，以提高工厂的收益。
湿磨处理得到淀粉后，通常还要经过凝胶化(gelatinization)，液化和糊精化作用以获得麦芽糖糊精产品，而其后的糖化，异构化和精炼步骤是用于制备葡萄糖，麦芽糖和果糖。
由于目前可获得的酶不能快速地水解结晶淀粉，所以在淀粉水解过程中进行凝胶化作用。为了使淀粉可被水解酶作用，通常用水(20-40％干物质)将淀粉制成浆状，然后在适当的胶凝作用温度下加热。对于玉米淀粉而言，该温度为105°-110℃。凝胶化的淀粉通常非常粘稠，因此在下一个被称为液化的步骤中被稀薄化。液化破坏了淀粉葡萄糖分子间的一些键，可以通过酶或使用酸进行。该步骤以及其后的糊精化步骤中均使用热稳定的内切α-淀粉酶。在糊精化步骤中控制水解的程度以使得到的水解产物中葡萄糖可以达到期望的百分比。
根据所需要的产物，可以通过大量不同的外切淀粉酶和脱支酶对由液化步骤所得到的糊精产物进行进一步水解。如果最终的目的是果糖，那么通常使用固定化的葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。
通过干磨法从玉米淀粉制备可发酵糖(然后制备例如乙醇)能够促进外源性淀粉酶有效地接触淀粉的步骤。这些方法比湿磨法的资本投入低，但是由于这些方法得到的副产品通常不如湿磨法得到的有价值，因此，仍然希望获得显著的成本利益。例如，在湿磨的玉米中，玉米粒被磨成粉末以促进玉米与降解酶的有效接触。玉米粉经酶水解后，由于残留的固体含有蛋白质和一些其它组分，所以还可用作饲料。Eckhoff最近在一篇名为“Fermentation and costs of fuel ethanol fromcorn with quick-germ process”的论文中阐述了湿磨法的改良潜力以及相关问题(Appl.Biochem.Biotechnol.，9441(2001))。这种“快速胚芽(quick-germ)”方法能够使用缩短的浸泡时间从淀粉中分离出富含油的胚芽。
内生性加工酶在植物中的调控和/或水平可以形成目的产物的这样的一个例子是甜玉米。典型的甜玉米品种与饲料玉米(field corn)品种的区别在于甜玉米不能生物合成正常水平的淀粉。在淀粉生物合成相关酶编码基因中的遗传突变通常被用于甜玉米品种以限制淀粉的生物合成。这种突变(例如甜和超甜突变)都位于淀粉合酶和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因中。产生可口甜味所需要的三种单糖——果糖，葡萄糖和蔗糖在这些突变株内的发育胚乳中累积，而这种甜味正是可食用鲜玉米消费者所青睐的。但是，如果淀粉累积的水平过高而使得玉米成熟过长时间(晚熟收获)或者玉米在被消费前保存了过长时间，那么就会丧失甜味而变为淀粉味和口感(mouthfeel)。因此甜玉米的收获期(harvest window)非常窄，并且储藏期限有限。
种植甜玉米的农民的另一困难是这些品种的应用仅仅限制在可食用食品上。如果农民在种子发育期希望放弃收获甜玉米用作可使用食品，那么收成将损失相当大。甜玉米的谷物产量和质量会因为两个基本原因而较低。第一个原因是淀粉生物合成途径中的突变破坏了淀粉生物合成的机制，玉米还没有完全灌浆，导致产量和质量损失。第二，由于在玉米中存在高水平的糖，不能将这些糖贮存为淀粉，这些种子的整体吸收强度(sink strength)有所减少，而这加剧了玉米粒中储存营养的缩减。这些甜玉米品种种子的胚乳会收缩并破裂，而不会经历适当的干燥过程，并且易于染病。甜玉米谷物的这种低质量还会有进一步的农艺学影响；如种子存活率低，发芽率低，秧苗易染病，以及早期秧苗不易存活等，这都是由于淀粉累积量过低而导致的各种因素所致。这样，甜玉米质量低的问题会影响消费者，农民/种植者，经销商和种子生产商。
于是，对于干磨法，渴望有一种能改进这种工艺和/或提高副产品价值的方法。对于湿磨法，需要有一种淀粉加工方法能够不需要配备长时间浸泡，研磨，粉碎和/或分离玉米粒组分所需的设备。例如，需要能够在湿磨法中修改或省掉浸泡步骤，因为这可以减少需要处理的废液的量，从而节省能源和时间，并提高研磨容量(会缩短玉米粒在浸泡容器内的时间)。还需要消除或改进将含淀粉的胚乳与胚分离的方法。
发明概述本发明涉及自加工(self-processing)植物和植物部分以及其使用方法。本发明的自加工植物和植物部分能够表达并活化(耐中温，耐高温(thermophilic)和耐超高温(hyperthermophilic))酶。活化了(耐中温，耐高温和耐超高温)酶后，植物和植物部分能够对底物进行自加工，以此获得目的产物。
本发明提供分离的多核苷酸，该多核苷酸a)含有SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52或59或者其互补序列，或在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52或59任一序列的互补序列杂交、并且编码具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶或葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，或者b)编码含有SEQ ID NO10，13，14，15，16，18，20，24，26，27，28，29，30，33，34，35，36，38，40，42，44，45，47，49或51的多肽或其酶活性片段。优选地，该分离的多核苷酸编码含有第一多肽和第二肽的融合多肽，其中所述第一多肽具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶或葡糖淀粉酶活性。最优选地，第二肽含有信号序列肽，其能够将第一多肽靶向植物的液泡，内质网，叶绿体，淀粉颗粒，种子或细胞壁。例如，该信号序列可以是waxy的N末端信号序列，γ-玉米醇溶蛋白的N末端信号序列，淀粉结合域，或者C末端淀粉结合域。还进一步包括下述多核苷酸在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO2，9，或52任一序列的互补序列杂交并且编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO4或25的互补序列杂交并且编码具有支链淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO6的互补序列杂交并且编码具有α-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列的互补序列杂交并且编码具有葡糖异构酶活性的多肽的多核苷酸；在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO46，48，50或59的互补序列杂交并且编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸。
另外，还提供含有多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸a)具有SEQID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52，或59或其互补序列，或在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52，或59任一序列的互补序列杂交并且编码具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶或葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，或者b)编码含有SEQ ID NO10，13，14，15，16，18，20，24，26，27，28，29，30，33，34，35，36，38，40，42，44，45，47，49或51的多肽或其酶活性片段。优选地，该表达盒进一步含有与所述多核苷酸可操作地相连的启动子，例如诱导型启动子，组织特异性启动子或优选胚乳特异性启动子。优选地，该胚乳特异性启动子为玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子或玉米ADP-gpp启动子。在一个优选实施方式中，该启动子含有SEQ ID NO11或SEQ ID NO12。而且，在另一优选实施方式中该多核苷酸是以相对于启动子而言为有义的方向定位。本发明的表达盒还可以进一步编码与所述多核苷酸编码多肽可操作地相连的信号序列。该信号序列优选将与其可操作地相连的多肽靶向植物的液泡，内质网，叶绿体，淀粉颗粒(starch granule)，种子或细胞壁。优选的信号序列包括waxy的N末端信号序列，γ-玉米醇溶蛋白的N末端信号序列，或者淀粉结合域。
本发明还涉及含有本发明表达盒的载体或细胞。细胞可选自土壤杆菌，单子叶植物细胞，双子叶植物细胞，Liliopsida细胞，Panicoideae细胞，玉米细胞，和谷类细胞。优选细胞是玉米细胞。
本发明还包括用本发明载体稳定转化的植物。本发明提供用含有α-淀粉酶的载体稳定转化的植物，所述α-淀粉酶具有SEQ ID NO1，10，13，14，15，16，33，或35的任一氨基酸序列，或由含有SEQ IDNO2或9的多核苷酸所编码。优选α-淀粉酶是耐超高温的。
在另一实施方式中，还提供用含有支链淀粉酶的载体稳定转化的植物，所述支链淀粉酶具有SEQ ID NO24或34的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO4或25的多核苷酸所编码。还提供用含有α-葡糖苷酶的载体稳定转化的植物，所述α-葡糖苷酶具有SEQ ID NO26或27的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO6的多核苷酸所编码。优选该α-葡糖苷酶是耐超高温的。还描述了用含有葡萄糖异构酶的载体稳定转化的植物，所述葡萄糖异构酶具有SEQ ID NO18，20，28，29，30，38，40，42，或44的任一氨基酸序列，或由含有SEQ IDNO19，21，37，39，41或43的多核苷酸所编码。优选该葡萄糖异构酶是耐超高温的。在另一实施方案中还描述了用含有葡糖淀粉酶的载体稳定转化的植物，所述葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO45，47或49的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO46，48，50，或59的多核苷酸所编码。优选该葡萄糖淀粉酶是耐超高温的。
还提供从本发明被稳定转化的植物获得的植物产品，如种子，果实或谷粒。
在另一实施方案中，本发明还涉及转化的植物，其基因组中增加有重组多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地相连且编码至少一种加工酶，该多核苷酸的序列已被优化用于在所述植物内表达。该植物可以是单子叶植物，如玉米，或双子叶植物。优选该植物为谷类植物或经济植物。加工酶选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，葡聚糖酶，β-淀粉酶，α-葡糖苷酶，异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶(neo-pullulanase)，异支链淀粉酶(iso-pullulanase)，淀粉支链淀粉酶(amylopullulanase)，纤维素酶，外切-1，4-β-纤维二糖水解酶，外切-1，3-β-D-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶，内切葡聚糖酶，L-阿拉伯糖酶，α-阿拉伯糖苷酶，半乳聚糖酶(galactanase)，半乳糖苷酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，木糖苷酶，蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，酯酶，植酸酶和脂肪酶。优选该加工酶为选自下述的淀粉加工酶α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，β-淀粉酶，α-葡糖苷酶，异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶和淀粉支链淀粉酶(amylopullulanase)。更优选该酶选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶，和支链淀粉酶。还进一步优选耐超高温的加工酶。根据本发明，酶可以是选自下述的非淀粉降解酶蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，酯酶，植酸酶和脂肪酶。这些酶还可以是耐超高温的。在一个优选实施方案中，该酶能够在植物的液泡，内质网，叶绿体，淀粉颗粒，种子或细胞壁中累积。而且，在另一实施方案中，植物的基因组中还可以增加含有非耐超高温酶的第二重组多核苷酸。
本发明另一方面提供转化的植物，其基因组中增加了编码至少一种选自下述的加工酶的重组多核苷酸α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶，所述多核苷酸与启动子序列可操作地相连，该多核苷酸的序列已被优化用于在该植物中表达。优选该加工酶为耐超高温酶和玉米。
另一实施方案提供转化的玉米植物，其基因组中增加了编码至少一种选自下述的加工酶的重组多核苷酸α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶，所述多核苷酸与启动子序列可操作地相连，该多核苷酸的序列已被优化用于在玉米植物中表达。优选该加工酶为耐超高温酶。
还提供了转化的植物，其基因组增加了具有SEQ ID NO2，9或52的重组多核苷酸，所述多核苷酸与启动子和信号序列可操作地相连。另外，还描述了转化的植物，其基因组增加了具有SEQ ID NO4或25的重组多核苷酸，所述多核苷酸与启动子和信号序列可操作地相连。在另一实施方案中还描述了转化的植物，其基因组增加了具有SEQ ID NO6的重组多核苷酸，所述多核苷酸与启动子和信号序列可操作地相连。另外，还提供了转化的植物，其基因组增加了具有SEQID NO19，21，37，39，41或43的重组多核苷酸。转化的植物，其基因组增加了具有SEQ ID NO46，48，50或59的重组多核苷酸。
本文还进一步设想了从转化的植物获得的产品。产品包括例如种子，果实，或谷粒。该产品还可以是加工酶，淀粉或糖。
还进一步描述了从本发明被稳定转化的植物所获得的植物。在这个方面而言，该植物可以是杂交植物或近交(inbred)植物。
本发明的另一实施方案还提供了淀粉组合物，其含有至少一种加工酶，该酶是蛋白酶、葡聚糖酶或酯酶。优选该酶耐超高温。
本发明的另一实施方案提供含有至少一种加工酶的谷粒(grain)，所述酶是α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶或葡萄糖异构酶。优选该酶耐超高温。
另一实施方案提供了制备淀粉颗粒的方法，包括将含有至少一种非淀粉加工酶的谷物在能够激活所述至少一种酶的条件下处理，产生含有淀粉颗粒和非淀粉降解产物的混合物，其中所述谷物获自转化的植物，其基因组增加了编码至少一种酶的表达盒；并从混合物中分离出淀粉颗粒。其中，所述优选为蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶或酯酶。而且优选该酶耐超高温。所述谷物可以是经碎裂化的谷物和/或可以在低或高含水量条件下处理。或者，该谷物可以用二氧化硫处理。优选本发明进一步包括从混合物中分离非淀粉产品。还进一步描述了由该方法获得的淀粉产品和非淀粉产品。
在另一实施方案中，还提供了生产超甜玉米(hypersweet corn)的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下处理转化的玉米或其部分，以使玉米中的多糖转化为糖(sugar)从而获得超甜玉米，所述玉米或其部分的基因组已增加了编码至少一种淀粉降解酶或淀粉异构酶的表达盒，并在胚乳中表达该表达盒。该表达盒优选进一步含有与酶编码多核苷酸可操作连接的启动子。该启动子可以是例如组成型启动子，种子特异性启动子或胚乳特异性启动子。优选该酶耐超高温。更优选该酶为α-淀粉酶。这里所用的表达盒还可进一步含有编码信号序列的多核苷酸，该信号序列与所述至少一种酶可操作连接。信号序列可以将耐超高温酶导向例如质外体或内质网。优选该酶含有SEQ IDNO13，14，15，16，33或35任一序列。
在最优选的实施方案中，描述了产生超甜玉米的方法，包括在下述条件下处理转化的玉米或其部分，该玉米或其部分的基因组已增加了编码α-淀粉酶的表达盒，并在胚乳冲中表达该表达盒，所述条件能够活化所述至少一种酶，以将玉米中的多糖转化为糖，产生超甜玉米。优选地该酶是耐超高温的，该耐超高温α-淀粉酶含有SEQ ID NO10、13、14、15、16、33或35任何氨基酸序列，或其具有α-淀粉酶活性的酶活性片段。
本文还描述了制备水解的淀粉产物的溶液的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下处理含有淀粉颗粒和至少一种加工酶的植物部分，从而使酶加工淀粉颗粒以形成含有水解的淀粉产物的水溶液，其中所述植物部分是获自转化的植物，所述植物的基因组增加了编码所述至少一种淀粉加工酶的表达盒；并收集含有水解的淀粉产物的水性溶液。水解的淀粉产物可以含有糊精，麦芽寡糖，葡萄糖和/或其混合物。优选该酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，淀粉支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。另外，优选该酶耐超高温。另一方面，该植物部分的基因组还可进一步增加编码非耐超高温淀粉加工酶的表达盒。该非耐超高温淀粉加工酶可选自淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。另一方面，该加工酶优选在胚乳中表达。优选该植物部分为颗粒，来自玉米，小麦，大麦，黑麦，燕麦，甘蔗或稻。优选所述的至少一种加工酶与启动子和信号序列可操作地相连，所述信号肽能够将酶导向淀粉颗粒或内质网或细胞壁。该方法还可进一步包括分离水解的淀粉产物和/或发酵水解的淀粉产物的步骤。
本发明的另一方面描述了制备水解的淀粉产物的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下处理含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分，从而使酶加工淀粉颗粒以形成成含有水解的淀粉产物的水性溶液，其中所述植物部分是获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码至少一种α-淀粉酶的表达盒；并收集含有水解的淀粉产物的水性溶液。优选该α-淀粉酶可以耐超高温，更优选该耐超高温的α-淀粉酶含有SEQ ID NO1，10，13，14，15，16，33或35任一序列的氨基酸序列，或其具有α-淀粉酶活性的片段。优选地，该表达盒含有选自如下序列的多核苷酸SEQ ID NO2，9，46或52或其互补序列，或者在低严谨性杂交条件下能够与SEQ ID NO2，9，46或52杂交并且编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸。同时，本发明还包括进一步含有编码非耐超高温淀粉加工酶的多核苷酸的转化植物的基因组。或者，可以用非耐超高温淀粉加工酶处理植物的部分。
本发明还提供含有在植物细胞中存在的至少一种淀粉加工酶的转化植物部分，其中该植物部分是获自转化的植物，该植物的基因组已增加了编码至少一种淀粉加工酶的表达盒。优选地，该酶为选自下述的淀粉加工酶α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，β淀粉酶，α-葡糖苷酶，异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶和淀粉支链淀粉酶。同时，优选该酶耐超高温。所述植物可以是任何植物，但优选玉米。
本发明另一实施方案是含有在植物的细胞或细胞壁内存在的至少一种非淀粉加工酶的转化植物部分，其中所述植物部分获自转化植物，该植物的基因组已增加了编码至少一种非淀粉加工酶或至少一种非淀粉多糖加工酶的表达盒。优选地，该酶耐超高温。同时，所述非淀粉加工酶优选选自蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，酯酶，植酸酶和脂酶。所述植物部分可以是任何植物部分，但优选穗，种子，果实，谷粒，秸杆(stover)，谷壳或渣屑(bagasse)。
本发明还提供转化的植物部分。例如，描述了含有α-淀粉酶的转化植物部分，所述淀粉酶具有SEQ ID NO1，10，13，14，15，16，33或35任一序列的氨基酸序列，或者由含有SEQ ID NO2，9，46或52任一序列的多核苷酸所编码；含有α-葡糖苷酶的转化植物部分，所述α-葡糖苷酶具有SEQ ID NO5，26或27任一序列的氨基酸序列，或者由含有SEQ ID NO6的多核苷酸所编码；含有葡萄糖异构酶的转化植物部分，所述葡萄糖异构酶具有SEQ ID NO28，29，30，38，40，42或44任一序列的氨基酸序列，或者由含有SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列的多核苷酸所编码；含有葡糖淀粉酶的转化植物部分，所述葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO45或SEQ ID NO47或SEQ ID NO49的氨基酸序列，或者由含有SEQ ID NO46，48，50或59任一序列的多核苷酸所编码；以及含有支链淀粉酶的转化植物部分，所述支链淀粉酶由含有SEQ ID NO4或25任一序列的多核苷酸序列所编码。
另一实施方案提供了转化植物部分中淀粉的转化方法，包括活化其中所含淀粉加工酶。还提供了根据该方法获得的淀粉，糊精，麦芽寡糖或糖。
本发明还描述了在植物部分的细胞壁或细胞内含有至少一种非淀粉加工酶的转化植物部分的使用方法，包括在一定条件下处理含有至少一种非淀粉多糖加工酶的转化植物部分，以活化所述的至少一种酶酶来消化非淀粉多糖从而形成含有寡糖和/或糖(sugars)的水性溶液，其中所述植物部分是获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种非淀粉多糖加工酶的表达盒；并收集含有寡糖和/或糖的水性溶液。优选该非淀粉多糖加工酶可以耐超高温。
还提供了使用含有至少一种加工酶的转化种子的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种蛋白酶或脂酶的转化种子，从而获得含有氨基酸和脂肪酸的水性混合物，其中所述种子获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种酶的表达盒；并收集水性混合物。优选氨基酸或脂肪酸或二者均为分离的。优选所述至少一种蛋白酶或脂酶可以耐超高温。
制备乙醇的方法，包括在能够激活所述至少一种酶的条件下处理含有至少一种多糖加工酶的植物部分，从而降解多糖以形成寡糖或可发酵糖，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒；并在能够促进可发酵糖或寡糖转化为乙醇的条件下保温可发酵糖。优选植物部分为谷粒，果实，种子，茎，木材，蔬菜或根。优选该植物部分获自选自下述的植物燕麦，大麦，小麦，浆果，葡萄，黑麦，玉米，稻，马铃薯，甜菜，甘蔗，菠萝，草和树。在另一优选实施方案中，该多糖加工酶为α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，支链淀粉酶或其组合。
还提供了一种制备乙醇的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的时间和条件下，将含有至少一种选自下组的酶的植物部分加热处理以使多糖消化从而形成可发酵糖α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，支链淀粉酶或其组合，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码该至少一种酶的表达盒；并在能够促进可发酵糖转化为乙醇的条件下保温可发酵糖。优选所述的至少一种酶可以耐超高温或耐中温。
在另一实施方案中描述了制备乙醇的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种非淀粉加工酶的植物部分以使非淀粉多糖消化成寡糖和可发酵糖，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组增加了编码该至少一种酶的表达盒；并在能够促进可发酵糖转化为乙醇的条件下保温可发酵糖。优选所述非淀粉加工酶为葡聚糖酶，木聚糖酶或纤维素酶。
还提供了一种制备乙醇的方法，包括在能够活化所述的至少一种酶条件下，处理含有至少一种选自下组的酶的植物部分以使多糖消化成可发酵糖α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，支链淀粉酶或其组合，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组增加了编码所述至少一种酶的表达盒；并在能够促进可发酵糖转化为乙醇的条件下保温可发酵糖。优选该酶耐超高温。
同时还提供了无需额外加入甜味剂而生产增甜谷粉制食品(farinaceous food product)的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种淀粉加工酶的植物部分以将植物部分中的淀粉颗粒加工成糖类从而形成甜味产品，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种酶的表达盒；并将所述甜味产品加工成谷粉制食品。所述谷粉制食品可以由甜味产品和水制成。另外，所述谷粉制食品可以含有麦芽，调味剂，维生素，矿物质，着色剂或其组合。优选所述的至少一种酶可以耐超高温。该酶可选自α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其任何组合。所述植物还可以选自大豆，黑麦，燕麦，大麦，小麦，玉米，稻和甘蔗。优选所述谷粉制食品是谷类食品，早餐食品，即食食品或焙烤食品。该方法中还可以包括焙烤，煮沸，加热，蒸汽加工，放电(electrical discharge)或其组合。
本发明还提供了无需加入甜味剂使含淀粉的产品增甜的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种淀粉加工酶的淀粉以使淀粉消化形成糖从而形成甜味淀粉，其中所述淀粉获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种酶的表达盒；并将所述甜味淀粉加入产品以制成甜味的含淀粉产品。所述转化植物优选选自玉米，大豆，黑麦，燕麦，大麦，小麦，稻和甘蔗。优选所述的至少一种酶可以耐超高温。更优选该至少一种酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。
本发明还提供谷粉制食品和甜味含淀粉产品。
本发明还提供了使含多糖水果或蔬菜增甜的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种多糖加工酶的水果或蔬菜，由此加工水果或蔬菜中的多糖形成糖(sugar)，获得甜味水果或蔬菜，其中所述水果或蔬菜获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒。所述水果或蔬菜选自马铃薯，番茄，香蕉，南瓜，豌豆和菜豆。优选所述的至少一种酶可以耐超高温。
本发明还进一步提供制备含糖的水性溶液的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理获自植物部分的淀粉颗粒，从而得到含糖的水性溶液。
另一实施方案提供了在淀粉衍生产物回收之前不涉及湿磨(wetmilling)或干磨(dry milling)谷粒而从谷粒中制备淀粉衍生产物的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分，以加工淀粉颗粒形成含有糊精或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种淀粉加工酶的表达盒；并收集所述含有淀粉衍生产物的水性溶液。优选所述的至少一种淀粉加工酶可以耐超高温。
还提供了分离α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶的方法，包括栽培所述转化植物和从中分离α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖异构酶、α-葡糖苷酶和支链淀粉酶。优选所述酶可以耐超高温。
还提供了制备麦芽糖糊精的方法，包括将转基因谷物与水混合，加热该混合物，从形成的糊精糖浆中分离出固体，并收集麦芽糖糊精。优选该转基因谷物含有至少一种淀粉加工酶。优选该淀粉加工酶是α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，和葡萄糖异构酶。同时还提供了由该方法所形成的麦芽糖糊精和组合物。
本发明提供在回收淀粉衍生产物之前不涉及机械破裂谷粒而从谷粒制备糊精或糖的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分，以加工淀粉颗粒形成含有糊精或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组增加了编码所述至少一种加工酶的表达盒；并收集所述含有糖和/或糊精的水性溶液。
本发明还提供了制备可发酵糖的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分，以加工淀粉颗粒形成含有糊精或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组已增加了编码所述至少一种加工酶的表达盒；并收集所述含有可发酵糖的水性溶液。
同时本发明还包括由含有耐超高温α-淀粉酶的载体稳定转化的玉米植物。优选例如由含有α-淀粉酶编码多核苷酸序列的载体所稳定转化的玉米植物，所述α-淀粉酶与SEQ ID NO1或SEQ ID NO51具有大于60％的一致性。
图1A和图1B表明在来自pNOV6201植物的分离的T1谷粒和来自六个pNOV6200系的玉米粒中以及胚乳中表达的α-淀粉酶活性。
图2表明来自pNOV6201系的分离T1谷粒中α-淀粉酶活性。
图3表明将含有热稳定性797GL3α-淀粉酶的转基因玉米糊状物发酵后所形成的乙醇的量，所述糊状物已在85℃和95℃经历了不超过60分钟的液化。该图说明发酵72小时所得到的乙醇产量在液化15分钟到60分钟之间几乎没有变化。而且还显示在95℃液化产生的糊状物在各个时间点形成的乙醇产量比85℃液化产生的糊状物的高。
图4表明含有热稳定性α-淀粉酶的转基因玉米糊状物在经过了85℃和95℃的不超过60分钟的液化然后再发酵后残留的淀粉量(％)。该图表明发酵72小时的乙醇产量在液化15分钟到60分钟之间几乎没有变化。而且还显示在95℃液化产生的糊状物在各个时间点形成的乙醇产量比85℃液化产生的糊状物的更高。
图5表明转基因玉米与对照玉米及其各种混合物在85℃和95℃制备的糊状物所形成的乙醇产量。该图表明由于发酵后淀粉剩余量减少，因此含有α-淀粉酶的转基因玉米在使淀粉可被发酵利用方面有显著改进。
图6表明转基因谷物，对照玉米及其各种混合物在85℃和95℃制备的糊状物发酵后，在干燥釜留物(stillage)中测得的残留淀粉量。
图7显示含有3％转基因玉米的样品在5.2-6.4的不同pH范围，在20-80小时的时间作为发酵时间函数的乙醇产量。该图说明在较低pH条件下进行的发酵的速度比pH6.0或更高pH条件下快。
图8表明含有0-12wt％不同重量百分比转基因玉米的糊状物在5.2-6.4的不同pH范围的发酵过程中的乙醇产量。该图表明乙醇的产量与样品中转基因谷物的含量无关。
图9显示来自由pNOV7005转化的不同事件的T2种子分析结果。相较于非转基因的对照，可以在许多事件中检测到支链淀粉酶活性的高表达。
图10A和图10B显示转基因玉米粉中由表达的支链淀粉酶所产生的淀粉水解产物的HPLC分析结果。将表达支链淀粉酶的玉米的面粉在反应缓冲液中75℃保温30分钟，从玉米淀粉中形成中等链寡糖(聚合程度(DP)约为10-30)和短的直链淀粉(DP约为100-200)。图10A和图10B显示加入的钙离子对于支链淀粉酶酶活的影响效果。
图11A和图11B显示两种反应混合物的淀粉水解产物经HPLC分析后形成的数据。被标示为“淀粉酶”的第一种反应含有表达α-淀粉酶的转基因玉米和非转基因玉米A188的玉米粉样品混合物[1∶1(w/w)]；而“淀粉酶+支链淀粉酶”的第二种反应混合物则含有表达α-淀粉酶的转基因玉米和表达支链淀粉酶的转基因玉米的玉米粉样品混合物[1∶1(w/w)]。
图12表明两种混合物的每25μl反应混合物中糖产物的μg量。被标示为“淀粉酶”的第一种反应含有表达α-淀粉酶的转基因玉米和非转基因玉米A188的玉米粉样品混合物[1∶1(w/w)]；而“淀粉酶+支链淀粉酶”的第二种反应混合物则含有能表达α-淀粉酶的转基因玉米和能表达支链淀粉酶的转基因玉米的玉米粉样品混合物[1∶1(w/w)]。
图13A和图13B显示在85℃和95℃保温30分钟结束时两组反应混合物的淀粉水解产物。每组中都有两种反应混合物；第一种反应被称为“淀粉酶X支链淀粉酶”，含有既能表达α-淀粉酶又能表达支链淀粉酶的转基因玉米(通过异花授粉而产生)的玉米粉，第二种反应为“淀粉酶”，是表达α-淀粉酶的转基因玉米和非转基因玉米A188的玉米粉样品混合物，二者以能够获得与杂交玉米(淀粉酶X支链淀粉酶)观察到的相同量的α-淀粉酶活性的比例混合。
图14表明淀粉转化为葡萄糖的降解作用，其中使用了非转基因玉米种子(对照)，含有797GL3α-淀粉酶的转基因玉米种子以及797GL3转基因玉米种子和Mal Aα-葡糖苷酶的组合。
图15说明在室温或30℃下粗淀粉的转化。该图中，反应混合物1和2分别是水和淀粉在室温或30℃下的混合物。反应混合物3和4分别是大麦α-淀粉酶和淀粉在室温或30℃下的混合物。反应混合物5和6是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)葡糖淀粉酶和淀粉在室温或30℃下的混合物。反应混合物7和8分别是大麦α-淀粉酶(sigma)和热厌氧杆菌属葡糖淀粉酶及淀粉在室温或30℃下的混合物。反应混合物9和10分别是大麦α-淀粉酶(sigma)对照和淀粉在室温或30℃下的混合物。热厌氧杆菌属葡糖淀粉酶产物的聚合程度(DP)已被标出。
图16显示如实施例19所述，使用α-淀粉酶，α-葡糖苷酶和葡萄糖异构酶组合从淀粉酶转基因玉米面粉中生产果糖。将淀粉酶玉米面粉和酶溶液加水或缓冲液一起混合。所有的反应都含有60mg淀粉酶玉米面粉，液体总体积均为600μl，90℃保温2小时。
图17表明100％来自自加工谷粒的淀粉酶玉米面粉在90℃保温0-1200分钟下反应产物峰面积对保湿时间的函数。
图18表明10％来自自加工谷粒的淀粉酶玉米面粉和90％对照玉米面粉在90℃保温0-1200分钟下反应产物峰面积对保温时间的函数。
图19提供在70°，80°，90°或100℃下保温不超过90分钟的转基因淀粉酶玉米面粉的HPLC分析结果，来评价温度对淀粉水解的影响。
图20表明在各种反应条件下，含有60mg转基因淀粉酶玉米面粉与酶溶液和水或缓冲液的混合物样品的ELSD峰面积。一组反应使用50mM MOPS缓冲，pH7.0，室温下，外加10mM MgSO4和1mMCoCl2；另一组反应中用水替代含金属的缓冲液。所有反应均在90℃保温2小时。
发明详述本发明中，“自加工”植物或植物部分内已导入了分离的多核苷酸，该多核苷酸编码能够在植物体内加工，例如修饰，淀粉，多糖，脂类，蛋白等的加工酶，其中所述加工酶可以耐中温，高温或超高温，并可通过粉碎，加入水，加热或以其它方式提供酶发挥作用所需条件而被活化。所述编码加工酶的分离多核苷酸被整合到植物或植物部分中以在其中表达。表达和活化该酶后，本发明的植物或植物部分会加工所述加工酶作用的底物。因此，本发明的植物或植物部分在没有或只有减少的通常对这些底物进行加工所必需的外部因素存在下，当其中的加工酶被活化之后能够对该酶的底物进行自加工。因此，本发明的转化植物，转化植物细胞和转化植物部分具有“内在”的加工能力，能够通过掺入其中的酶来加工期望的底物。优选该加工酶的编码多核苷酸为“遗传稳定的”，即，该多核苷酸能够在本发明的转化植物或植物部分中稳定地维持，并可通过连续世代而被后代稳定地继承。
根据本发明，使用这些植物和植物部分的方法能够在回收淀粉衍生产物之前不必经过粉碎或以其它方式物理破裂植物部分。例如，本发明提供了改进的处理玉米和其他谷物以回收淀粉衍生产物的方法。本发明还提供了允许回收淀粉颗粒的方法，所述淀粉颗粒在其内部或在其上含有一定水平的淀粉降解酶，所述水平的酶足以水解淀粉内部的特异键而无需加入外源淀粉水解酶。本发明还提供改进的来自通过本发明方法获得的自加工植物或植物部分的产品。
另外，“自加工”的转化植物部分，如谷粒，以及转化的植物避免了现有技术存在的主要问题，即，加工酶通常都由微生物发酵生产，这需要从培养上清液中分离酶，而这会耗费资金；分离的酶需要被处理以用于特殊应用，并且必须发展添加，混合和将酶与其底物反应的工艺及机械。本发明的转化植物或其部分还可以成为加工酶自身以及该酶的底物和产物，如糖，氨基酸，脂肪酸和淀粉及非淀粉多糖的来源。本发明的植物还可以用于制备后代植物，如杂种和近交种。
加工酶及其编码多核苷酸加工酶(耐中温，高温或超高温)的编码多核苷酸被导入植物或其部分。根据在植物或转基因植物和/或期望终产物中所发现的该加工酶作用的期望底物来选择该加工酶。例如，该酶可以是淀粉加工酶，如淀粉降解或淀粉异构化酶，或者是非淀粉加工酶。适合的加工酶包括但不限于淀粉降解或淀粉异构化酶，例如包括α-淀粉酶，内切或外切-1，4或1，6-α-D，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，β-淀粉酶，α-葡糖苷酶和其它外切淀粉酶；以及淀粉脱支酶，如异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶，淀粉支链淀粉酶等，糖基转移酶，如环糊精糖基转移酶等，纤维素酶如外切1，4-β-纤维二糖水解酶，外切-1，3-β-D-葡聚糖酶，半纤维素酶，β-葡糖苷酶等，内切葡聚糖酶如，内切-1，3-β-葡聚糖酶和内切-1，4-β-葡聚糖酶等；L-阿拉伯糖酶(L-arabinases)，如内切-1，5-α-L-阿拉伯糖酶，β-阿拉糖苷酶等，半乳聚糖酶(galactanases)如内切1，4-β-D-半乳聚糖酶，内切1，3-β-D-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶等；甘露聚糖酶(mannanases)，如内切1，4-β-D-甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，α-甘露糖苷酶等；木聚糖酶，如内切1，4-β-木聚糖酶，β-D-木糖苷酶，1，3-β-D-木聚糖酶等；以及果胶酶；和非淀粉加工酶，包括蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶，酯酶，植酸酶和脂酶。
在一个实施方案中，该加工酶为选自下述的淀粉降解酶α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，淀粉支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。正如本发明将要进一步描述的根据该实施方案，在将包含在植物或植物部分内的酶活化后，该淀粉降解酶能够使自加工植物或植物部分降解淀粉。可以根据期望的终产物来选择所述淀粉降解酶。例如，可以选择葡萄糖异构酶来将葡萄糖(己糖)转化为果糖。或者可以根据基于例如加工程度的函数而具有不同链长或具有各种期望的支链模式的期望淀粉衍生终产物来选择酶。比如，在较短保温时间条件下α-淀粉酶，葡糖淀粉酶或淀粉支链淀粉酶可以用来生产糊精产物，而在较长保温时间条件下来生产短链产物或糖。可使用支链淀粉酶特异性地水解淀粉的分支点来形成高直链淀粉的淀粉，或使用新支链淀粉酶来生产散布有1，6键的α-1，4键链的淀粉。可以使用葡糖苷酶来生产极限糊精，或者使用不同的各种组合来制备其它淀粉衍生物。
在另一实施方案中，该加工酶为选自下述的非淀粉加工酶蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶和酯酶。这些非淀粉降解酶可以使本发明的自加工植物或植物部分并入其到植物的靶区域，并且当被激活后破坏植物却能使淀粉颗粒保持完整。例如，在一个优选的实施方案中，该非淀粉降解酶靶向植物细胞的胚乳基质并在活化后，破坏胚乳基质却能够保持胚乳基质内的淀粉颗粒不被破坏，而更易于从所得的材料中回收。
本发明还进一步提供了加工酶的各种组合。例如，可以结合使用淀粉加工酶和非淀粉加工酶。可利用编码各种酶的多基因构建体来获得加工酶的组合。或者，可通过已知的方法使已稳定转化各酶的单个转基因植物杂交来获得含有多种酶的植物。另一方法包括对转基因植物使用外源酶。
加工酶可以从任何来源分离或制备，而其相应多核苷酸可以由本领域技术人员确定。例如，该加工酶，优选α-淀粉酶，可来源于火球菌属(Pyrococcus)(如激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))，栖热菌属(Thermus)，热球菌属(Thermococcus)(如Thermococcushydrothermalis)，硫化叶菌属(Sulfolobus)(如硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus))，栖热袍菌属(Thermotoga)(如海栖热袍菌(T.maritima)和那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana))，热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)(如Thermoanaerobactertengcongensis)，曲霉属(Aspergillus)(如Aspergillus shirousami和黑色曲霉(Aspergillus niger))，根霉属(Rhizopus)(如米根霉(Rhizopusoryzae))，热变形菌目(Thermoproteales)，硫还原球菌属(Desulfurococcus)(如Desulfurococcus amylolyticus)，嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)，詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)，坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyruskandleri)，Thermosynechococcus elongatus，耐酸热原体(Thermoplasma acidophilum)，火山热原体(Thermoplasmavolcanium)，敏捷气热菌(Aeropyrum perinx)和植物如玉米，大麦和稻。
本发明的加工酶能够在被导入植物基因组并被表达后活化。测定每个单个酶被活化的条件，可以包括各种条件，如温度，pH，水合作用，金属、活化性化合物、失活性化合物的存在等。例如，温度依赖性酶可包括耐中温，高温和超高温酶。耐中温酶通常在20-65℃具有最大活性，而在高于70℃的温度下会失活。耐中温酶在30-37℃具有显著的活性，优选在30℃的活性为最大活性的至少10％，更优选为最大活性的至少20％。
耐高温酶在50-80℃具有最大活性，而在高于80℃的温度下会失活。优选耐高温酶在30℃的活性低于最大活性的20％，更优选低于最大活性的10％。
耐超高温酶在更高温度下具有活性。耐超高温酶在高于80℃的温度下具有最大活性，而在至少80℃的温度下保持活性，更优选在至少90℃的温度下保持活性，最优选在至少95℃的温度下保持活性。耐超高温酶在低温条件下仍具有降低的活性。耐超高温酶在30℃的活性可以低于最大活性的10％，更优选低于最大活性的5％。
编码该加工酶的多核苷酸优选被修饰包含这样的密码子，所述密码子被优化用于在被选择生物体如植物体内表达(例如参见，Wada等，Nucl.Acids Res.，182367(1990)，Murray等，Nucl.Acids Res.，17477(1989)，U.S.Patent Nos.5,096,825，5,625,136，5,670,356和5,874,304)。密码子优化的序列是合成的序列，即，它们并非是天然存在的，并优选编码相同的多肽(或全长多肽的酶活性片段，并且该片段与全长多肽具有的活性基本上相同)，所述多肽由编码加工酶的非密码子优化亲代多核苷酸所编码。优选该多肽为生化性质独特的或有所改进的，例如，通过对来自亲代多肽的特定加工酶编码DNA的递推突变(recursive mutagenesis)，从而改进其在加工应用中的性能。优选多核苷酸被优化在靶宿主植物内表达，并且其编码加工酶。制备这种酶的方法包括突变，如递推突变和筛选。用于突变和核苷酸序列改变的方法是本领域公知的。例如参见，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488，(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154367(1987)；US Patent No.4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)以及这里所引的参考文献和Arnold等，Chem.Eng.Sci.，515091(1996))。优化核酸片段在靶植物或生物内表达的方法是本领域公知的。简言之，获得指示着靶生物所用最佳密码子的密码子使用表，选择最佳密码子用于替换靶多核苷酸中的密码子，然后化学合成优化序列。玉米偏爱密码子如US Patent No.5,625,136所述。
还进一步展望了本发明多核苷酸的互补核酸。在滤膜(filter)上进行的Southern或Northern印迹中，具有多于100个互补残基的互补核酸杂交的低严谨性条件的例子是50％甲酰胺，例如在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中，37℃下杂交，并在60-65℃下用0.1X SSC洗涤。示范性的低严谨性条件包括用30-35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液37℃杂交，并在50-55℃下用1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)清洗。示范性的中等严谨性条件包括在40-45％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中37℃杂交，并在55-60℃下用0.5X-1X SSC清洗。
另外，还包括编码所述加工酶“酶活性”片段的多核苷酸。本文中，“酶活性”指所述加工酶的多肽片段，并且其与所述加工酶具有基本上相同的在适当条件下修饰所述加工酶通常作用的底物的生物学活性。
在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸为玉米优化的多核苷酸，其编码α-淀粉酶，例如SEQ ID NO2，9，46和52所示。在另一优选实施方案中，该多肽为编码支链淀粉酶的玉米优化多核苷酸，例如SEQ ID NO4或25所示。在另一优选实施方案中，所述多核苷酸是编码α-葡糖苷酶的玉米优化多核苷酸，如SEQ ID NO6所示。另一优选实施方案中，该多肽为编码葡萄糖异构酶的玉米优化多核苷酸，如SEQ ID NO19，21，37，39，41或43所示。在另一优选实施方案中，优选编码葡糖淀粉酶的玉米优化多核苷酸，如SEQ ID NO46，48或50所示。另外，SEQ ID NO57还提供了编码葡聚糖酶/甘露聚糖酶融合多肽的玉米优化多核苷酸。本发明进一步提供了这种多核苷酸的互补序列，其在中度或优选在低严谨性杂交条件下可以杂交，并且视情况而定，编码具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，葡糖淀粉酶，葡聚糖酶或甘露聚糖酶活性的多肽。
多核苷酸可以与“核酸”或“多核酸”互换使用，指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，及其单链或双链形式的多聚体，由含有糖，磷酸和碱基的单体(核苷酸)构成，所述碱基为嘌呤或嘧啶。除非另有说明，该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其与对照核苷酸具有类似的结合特性，并以天然核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列除包括明确列出的序列外，还隐含包括其保守修饰的各种变体(例如简并密码子取代)以及互补序列。具体地，简并密码子的取代可以通过生成这样的序列而获得，所述序列中一个或多个被选择(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧次黄苷残基取代。
还包括“变体”或实质上类似的序列。对于核苷酸序列，变体包括那些由于遗传密码的简并性的缘故而编码天然蛋白相同氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体例如这些变体可以使用已知的分子生物学技术鉴定，如聚合酶链式反应(PCR)，杂交技术，和连接重组装(Ligation reassembly)技术。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，如那些例如使用定点突变而形成编码天然蛋白的核苷酸序列，以及编码具有氨基酸取代的多肽的核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体与天然核苷酸序列具有至少40％，50％，60％，优选70％，更优选80％，尤其优选90％，最优选99％和基于这些等级的单个单位的百分比一致性。例如，71％，72％，73％等，直到至少90％等级。变体还可以包括相应于被鉴定基因片段的全长基因。
调控序列启动子/信号序列/可选择标记编码本发明加工酶的多核苷酸可以与编码定位信号或信号序列(在多肽的N-或C-末端)的多核苷酸序列可操作地相连，从而例如将耐超高温酶靶向植物内的特定区室。这种靶的实例包括但不限于，液泡，内质网，叶绿体，造粉体，淀粉颗粒或细胞壁，或靶向特定组织，如种子。编码具有信号序列的加工酶的多核苷酸——特别是与组织特异性或诱导型启动子联合使用的多核苷酸——在植物内表达可以在植物体内产生高水平的定位加工酶。已知许多信号序列能够影响多核苷酸的表达或者影响多核苷酸靶向特定区室或特定区室以外部位。本领域已知的适当信号序列和靶向启动子包括但不限于本文所述的那些。
例如，当期望在特定组织或器官内表达时可以使用组织特异性启动子。反之，当期望响应刺激的基因表达时，诱导型启动子可为所选的调控元件。当期望在整个植物的细胞内持续地表达时，可使用组成型启动子。转化载体的表达构建体中还可以包含中心启动子上游和/或下游的额外调控序列，以使异源核苷酸序列在转基因植物内以各种水平表达。
已描述了许多表达特征各异的植物启动子。已被公开的一些组成型启动子包括稻肌动蛋白1(Wang等，Mol.Cell.Biol.，123399(1992)；U.S.Patent No.5,641,876)，CaMV 35S(Odell等，Nature，313810(1985))，CaMV 19S(Lawton等，1987)，nos(Ebert等，1987)，Adh(Walker等，1987)，蔗糖合酶(Yang & Russell，1990)和泛素启动子。
在转基因植物中用于组织特异性靶向基因的载体通常包括组织特异性启动子，还可以包含其它组织特异性调控元件，如增强子序列。根据本公开的教导，那些能够引导在某些植物组织内特异性表达或提高表达的启动子对于本领域技术人员是明了的。例如包括，rbcS启动子，为绿色组织特异性；ocs，nos和mas启动子，其在根部或创伤叶组织中有更高活性；截短的(-90到+8)35S启动子，其能够指导在根部的增强表达，α-微管蛋白基因，其指导在根中表达，以及来自玉米醇溶蛋白储备蛋白质基因的启动子，其能够指导在胚乳内表达。
组织特异性表达可以这样功能性地完成将组成型表达基因(所有组织)与仅在特定组织内表达的反义基因一起导入，所述特定组织是指不期望该基因产物的组织。例如，可使用来自花椰菜花叶病毒的35S启动子来导入编码脂酶的基因，这样就能够在所有组织内表达。使用例如玉米醇溶蛋白启动子在玉米谷粒内表达脂酶基因的反义转录产物能够防止脂酶蛋白在种子内积累。这样由导入基因编码的蛋白质就可以在除谷粒之外的所有组织内存在。
另外，已经报道了植物内的几种组织特异性调控基因和/或启动子。一些报道的组织特异性基因包括编码种子储备蛋白(如napin，cruciferin，β-conglycinin和云扁豆蛋白)玉米醇溶蛋白或油体蛋白(如oleosin)的基因，或与脂肪酸生物合成相关的基因(包括酰基载体蛋白，硬酯酰-ACP去饱和酶，和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))，以及其它在胚发育阶段表达的基因(如Bce 4，参见EP 255378和Kridl等，Seed Science Research，1209(1991))。已公开的组织特异性启动子包括凝集素(Vodkin，Prog.Clin.Biol.Res.，138；87(1983)；Lindstrom等，Der.Genet.，11160(1990))，玉米醇脱氢酶1(Vogel等，1989；Dennis等，Nucleic Acids Res.，123983(1984))，玉米集光复合体(Simpson，1986；Bansal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893654(1992))，玉米热休克蛋白(Odell等，1985，Rochester等，1986)，豌豆小亚基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)，Ti质粒甘露碱(mannopine)合酶(Langridge等，1989)，Ti质粒胭脂碱合酶(Langridge等，1989)，矮牵牛苯基苯乙烯酮异构酶(vanTunen等，EMBO J.，7；1257(1988))，菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，Genes Dev.，31639(1989))，截短的CaMV 35s(Odell等，Nature，313810(1985))，马铃薯patatin(Wenzler等，Plant Mol.Biol.，13347(1989))，根细胞(Yamamoto等，Nucleic Acids Res.，187449(1990))，玉米的玉米醇溶蛋白(Reina等，Nucleic Acids Res.，186425(1990)；Kriz等，Mol.Gen.Genet.，20790(1987)；Wandelt等，Nucleic Acids Res.，172354(1989)；Langridge等，Cell，341015(1983)；Reina等，Nucleic Acids Res.，187449(1990))，球蛋白-1(Belanger等，Genetics，129863(1991))，α-微管蛋白，cab(Sullivan等，Mol.Gen.Genet.，215431(1989))，PEPCase(Hudspeth & Grula，1989)，R基因复合体相关启动子(Chandler等，Plant Cell，11175(1989))，以及苯基苯乙烯酮合酶启动子(Franken等，EMBO J.，102605(1991))。特别适用于种子特异性表达的是豌豆豌豆球蛋白启动子(Czako等，Mol.Gen.Genet.，23533(1992)。(还可参见US5,625,136，并入本文作为参考)。其它可用于在成熟叶片内表达的启动子是那些在衰老启动时打开的启动子，如来自阿布属的SAG启动子(Gan等，Science，2701986(1995))。
从开花到果实发育时或过程(至少直到开始成熟)中表达的一类果实特异性启动子在US 4,943,674中公开，将其全文并入本文作为参考。在棉纤维中优先表达的cDNA克隆已被分离(John等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895769(1992))。在果实发育过程中显示出差异表达的番茄cDNA克隆已被分离并表征(Mansson等，Gen.Genet.，200356(1985)，Slater等，Plant Mol.Biol.，5137(1985))。多聚半乳糖醛酸酶基因的启动子在果实开始成熟的阶段处于活跃状态。US4,535,060，US 4,769,061，US 4,801,590和US 5,107,065描述了多聚半乳糖醛酸酶基因，将这些文献并入本文作为参考文献。
其它组织特异性启动子例子包括在叶受损(如被昆虫啃食)后能够引导在叶细胞、在块茎(例如patatin启动子)以及在纤维细胞(发育相关纤维细胞蛋白的例子是E6(John等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895769(1992)))内表达的那些启动子。尽管所述E6基因在叶，胚珠和花中以低水平转录，但在纤维内最为活跃。
一些“组织特异性”启动子的组织特异性可能并不是绝对的，本领域技术人员可以利用白喉毒素序列对其进行测试。还可以用不同组织特异性启动子的各种组合，通过“渗漏”表达来获得组织特异性表达(Beals等，Plant Cell，91527(1997))。本领域技术人员还可以分离出其他的组织特异性启动子(参见US 5,589,379)。
在一个实施方案中，多糖水解基因产物(如α-淀粉酶)的方向可以靶向特定的细胞器(如质外体)而不是细胞质。这可使用玉米γ玉米醇溶蛋白N末端信号序列(SEQ ID NO17)来示范，该序列可使蛋白特异性靶向质外体。将蛋白或酶靶向特定区室可以使酶以不会与底物接触的方式定位。通过这种方式，酶直到接触到了其底物才会开始酶促反应。可通过研磨(物理破坏细胞完整性)或加热细胞或植物组织来破坏含有该酶的植物细胞或器官的完整性，以使该酶接触其底物。例如，可将耐中温淀粉水解酶靶向质外体或内质网，从而使其无法与造粉体中的淀粉颗粒接触。研磨该谷粒会使谷粒完整性破坏，这样淀粉水解酶就会与淀粉颗粒接触。以这种方式就可以避免酶和其底物共同定位的潜在负面影响。
在另一实施方案中，组织特异性启动子包括胚乳特异性启动子，如玉米γ玉米醇溶蛋白启动子(如SEQ ID NO12所示)或玉米ADP-gpp启动子(如SEQ ID NO11所示，其包括5’非翻译区和内含子序列)。这样，本发明包括含有启动子的分离多核苷酸，所述启动子含有SEQ ID NO11或12，能够在低严谨度杂交条件下与其互补序列杂交的多核苷酸，或其片段，它具有启动子活性，如SEQ ID NO11或12所示启动子活性的至少10％，优选50％的活性。
本领域另一实施方案中，编码耐超高温加工酶的多核苷酸与叶绿体(造粉体)转运肽(CTP)以及来自例如waxy基因的淀粉结合域可操作地相连。该实施方案中的示范多核苷酸编码SEQ ID NO10(与waxy的淀粉结合域相连的α-淀粉酶)。其他多核苷酸编码与信号序列相连的耐超高温加工酶，所述信号序列能够将酶靶向内质网并分泌到质外体内(如编码SEQ ID NO13，27或30的多核苷酸所示范的，其分别含有与α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶可操作地相连的玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端序列)，与信号序列相连的耐超高温加工酶，所述信号序列能够将酶滞留在内质网内(如编码SEQ ID NO14，26，28，29，33，34，35或36的多核苷酸所示范的，其含有与耐超高温酶可操作地相连的玉米γ玉米醇溶蛋白N末端序列，其与SEKDEL可操作地相连，其中所述耐超高温酶为α-淀粉酶，malAα-葡糖苷酶，T.maritima葡萄糖异构酶，T.neapolitana葡萄糖异构酶)，与能够将酶靶向造粉体的N末端序列可操作地相连的耐超高温加工酶(如编码SEQ ID NO15的多核苷酸，其含有与α-淀粉酶可操作地相连的waxy的N-末端造粉体导向序列)，将酶靶向淀粉颗粒的耐超高温融合多肽(如编码SEQ ID NO16的多核苷酸所示范的，其含有能够导向造粉体的waxy N末端序列，该N末端与含有waxy淀粉结合域的α-淀粉酶/waxy融合多肽可操作地相连)，与ER滞留信号相连的耐超高温加工酶(如编码SEQ ID NO38和39的多核苷酸)。另外，耐超高温加工酶还可与具有氨基酸序列(SEQ ID NO53)的粗淀粉(raw starch)结合部位相连，其中编码所述加工酶的多核苷酸与编码该结合部位的玉米优化核酸序列(SEQ ID NO54)相连。
已报道了几种诱导型启动子。Gatz在Current Opinion inBiotechnology，7168(1996)中以及Gatz C在Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.4889(1997)中已描述了许多。示例包括四环素阻抑系统，Lac阻抑系统，铜诱导型系统，水杨酸诱导型系统(如PR1a系统)，糖皮质激素诱导型(Aoyama T等，N-H Plant Journal，11605(1997))和蜕皮激素诱导型系统。其它诱导型启动子包括ABA-和膨胀(turgor)-诱导型启动子，生长素结合蛋白基因启动子(Schwob等，Plant J.4423(1993))，UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子(Ralston等，Genetics，119185(1988))，MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等，Plant J.，6141(1994))，和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Kohler等，Plant Mol.Biol.，291293(1995)；Quigley等，J.Mol.Evol.，29412(1989)；Martinez等，J.Mol.Biol.，208511(1989))。还包括苯磺酰胺诱导型(US 5,364,780)和乙醇诱导型(WO97/06269和WO97/06268)系统以及谷胱甘肽S转移酶启动子。
其它研究聚焦于根据环境压力或外界刺激而响应的诱导型调节的基因，如盐度提高，干旱，病原体和损伤(Graham等，J.Biol.Chem.，2606555(1985)；Graham等，J.Biol.Chem.，2606561(1985)，Smith等，Planta，16894(1986))。已经报道在损伤马铃薯植物的叶片内会累积金属羧肽酶抑制剂蛋白(Graham等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1011164(1981))。还报道过其它能够被茉莉酮酸甲酯，诱导剂，热休克，无氧压力或杀虫剂安全剂诱导的其它植物基因。
嵌合反式作用(transacting)病毒复制蛋白的受控表达可以被其它遗传学方法进一步调控，例如Cre介导的基因活化(Odell等，Mol.Gen.Genet.，113369(1990))。这样，在启动子和复制蛋白编码序列之间含有被lox位点结合的3’调控序列的DNA片段(所述调控序列能够阻断嵌合复制基因从启动子处表达)可通过Cre介导的切除作用去除，使得反式作用复制基因表达。在这种情况下，嵌合的Cre基因，嵌合的反式作用复制基因，或者上述两种基因都能够由组织和发育特异性或诱导型启动子调控。另一种遗传学方法是使用tRNA抑制基因。例如，tRNA抑制基因的受控表达可以条件性地调控含有适当终止密码子的反式作用复制蛋白编码序列的表达(Ulmasov等，Plant Mol.Biol.，35417(1997))。同样，嵌合tRNA抑制基因，嵌合反式作用复制基因，或者上述二者都能够由组织和发育特异性或诱导型启动子调控。
优选地，对于多细胞生物，启动子还可以是特殊组织，器官或发育阶段特异性的。这种启动子的例子包括但不限于玉蜀黍(Zeamays)ADP-gpp和玉蜀黍γ-玉米醇溶蛋白启动子和玉蜀黍球蛋白启动子。
可能期望仅仅在植物发育的某个时间段内在转基因植物内表达基因。发育的时机选择通常与组织特异性基因的表达相关联。例如，玉米醇溶蛋白储备蛋白的表达就通常在授粉作用后约15天在胚乳内开始。
另外，还可以构建并使用载体在转基因植物细胞内将特定基因产物靶向细胞内组分，或将蛋白导向细胞外环境。这通常可通过将编码转运或信号肽序列的DNA序列与特定基因编码序列相连而完成。所获的转运或信号肽分别将蛋白运送到特定的细胞内或细胞外目的地。然后可以在翻译后被去除。转运或信号肽是通过促进蛋白通过细胞内各种膜(如液泡，泡囊，质体和线粒体膜)来发挥作用的，而所述信号肽能够指导蛋白通过细胞外膜。
这种诸如玉米γ玉米醇溶蛋白N末端信号序列等能够导向内质网并分泌到质外体中的信号肽序列可以与本发明编码耐超高温加工酶的多核苷酸可操作地相连(Torrent等，1997)。例如，SEQ ID NO13，27和30提供了编码与玉米γ玉米醇溶蛋白N末端序列可操作地相连的耐超高温酶的多核苷酸。另一信号序列是用于将多肽滞留在内质网内的SEKDEL氨基酸序列(Munro和Pelham，1987)。例如，编码SEQID NO14，26，28，29，33，34，35或36的多核苷酸，其含有与加工酶可操作地相连的玉米γ玉米醇溶蛋白N末端序列，所述酶与SEKDEL可操作地相连。多肽还可以通过与waxy造粉体导向肽融合从而靶向造粉体(Klosgen等，1986)或淀粉颗粒。例如，编码耐超高温加工酶的多核苷酸可以与叶绿体(造粉体)转运肽(CTP)以及来自例如waxy的淀粉结合域可操作地相连。SEQ ID NO10示范了与waxy的淀粉结合域相连的α-淀粉酶。SEQ ID NO15示范了与waxy的造粉体导向序列的N末端序列可操作地相连的α-淀粉酶。另外，编码加工酶的多核苷酸还可以用waxy淀粉结合域来与淀粉颗粒融合。例如，SEQ ID NO16示范了含有waxy N末端造粉体导向序列的融合多肽，所述序列与含有waxy淀粉结合域的α-淀粉酶/waxy融合多肽可操作地相连。
如本领域所公知的，本发明的多核苷酸除了加工信号外，还可以进一步含有其它调控序列。“调控序列”和“适当的调控序列”都是指定位于编码序列上游(5’非编码序列)、之中或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，该序列可以影响相连编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或者翻译。调控序列包括增强子，启动子，翻译前导序列，内含子和多聚腺苷化信号序列。它们包括天然和合成的序列以及合成和天然序列的组合序列。
如本领域所公知的，本发明还可使用可选择标记以允许将转化植物或植物组织筛选出来。技术人员可能会期望将可选择或可筛选标记基因用作目的可表达基因，或者除目的可表达基因之外，还使用可选择或可筛选标记基因。“标记基因”是能够使表达该基因的细胞具备独特表型的基因，从而能够将转化细胞与不具备该标记的细胞相互区分开来。这样的基因可以编码可选择或可筛选标记，这取决于该标记是否赋予可用化学方法，即利用选择剂(如除草剂，抗生素等)进行选择的特性，或其是否只不过是可以通过观察或检测，即通过筛选而鉴定的特性(例如R座位特性)。适当标记基因的许多实例为本领域所知，可以用于实践本发明。
该术语可选择或可筛选标记的范围内，还包括编码“可分泌标记”的基因，其分泌可以作为对转化细胞进行鉴定或选择的手段而被检测。实例包括编码可分泌抗原的标记，该抗原可以通过抗体相互作用被鉴定出来，或者甚至是编码可分泌酶的标记，所述酶可以通过其催化活性而被检测出来。可分泌蛋白的种类很多，包括可通过例如ELISA检测的小型可扩散蛋白；可在细胞外液中检测到的小型活性酶(如α-淀粉酶，β内酰胺酶，膦丝菌素转乙酰酶)；以及插入或包埋在细胞壁内的蛋白(如含有前导序列的蛋白，例如在伸展蛋白或烟草PR-S的表达单元中观察到的)。
就可选择的分泌型标记而言，使用编码含有独特的表位并被隐居在细胞壁内的蛋白的基因被认为是特别有益的。这样的分泌抗原标记理想地使用在植物组织中有低背景的表位序列，能够使其有效表达并靶向通过质膜的启动子-前导序列，会形成与细胞壁结合的蛋白，这样就可以使抗体接近。被修饰而含有独特表位的正常分泌型细胞壁蛋白就可以满足这样的需求。
适于以这种方式修饰的一种蛋白就是伸展蛋白，或富含羟基脯氨酸的糖蛋白(HPRG)。例如，玉米HPRG(Steifel等，The Plant Cell，2785(1990))分子在分子生物学，表达和蛋白结构上已被详细地表征。但是，可以通过加入抗原位点而对任何一种伸展蛋白和/或富含甘氨酸细胞壁蛋白(Keller等，EMBO Journal，81309(1989)进行修饰从而形成可筛选标记。
a.可选择标记可用于本发明的选择标记包括但不限于neo或nptII基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199183(1985))，其编码卡那霉素抗性，可利用卡那霉素进行筛选，及G418等；bar基因，其能够赋予除草剂膦丝菌素抗性；编码改变的EPSP合酶蛋白的基因(Hinchee等，Biotech，6915(1988))从而能够赋予草甘膦抗性；腈水解酶，如来自Klebsiella ozaenae的bxn，其赋予溴苯腈抗性(Stalker等，Science，242419(1988))；突变的乙酰乳酸合酶(ALS)，其能够赋予咪唑啉酮，磺酰脲类或其它ALS抑制化合物抗性(欧洲专利申请154，204，1985)；氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.，26312500(1988))；能够赋予除草剂茅草枯抗性的茅草枯脱卤素酶基因；磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因；能够赋予5-甲基色氨酸抗性的突变邻氨基苯甲酸合酶基因；能够赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因；或者甘露糖-6-磷酸异构酶基因(这里还称作磷酸甘露糖异构酶基因)，其提供代谢甘露糖的能力(US 5,767,378和5,994,629)。本领域技术人员能够选择适当的可选择标记基因实践本发明。当使用突变的EPSP合酶时，并入适当的叶绿体转运肽CTP还可以获得额外的益处(EP0,218,571，1987)。
可用于选择转化株的可选择标记基因的一个说明性实例是编码膦丝菌素转乙酰酶的基因，如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因或绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因。膦丝菌素转乙酰酶(PAT)能够将除草剂bialaphos中的活性成分膦丝菌素(PPT)失活。PPT能够抑制谷氨酰胺合酶(Mrakami等，Mol.Gen.Genet.，20542(1986)；Twell等，Plant Physiol.911270(1989))，导致氨迅速积累，使细胞死亡。将该选择系统与单子叶植物一起使用获得的成功令人感到意外，因为已经报道了在谷类转化中的巨大困难(Potrykus，Trends Biotehch.，7269(1989))。
当期望使用bialaphos抗性基因实践本发明时，一个非常有用的基因是可获自链霉菌属物种(如ATCC No.21,705)的bar或pat基因。已经公开了bar基因的克隆(Murakami等，Mol.Gen.Genet.，20542(1986)；Thompson等，EMBO Journal，62519(1987))以及bar基因在单子叶植物以外植物内的应用(De Block等，EMBO Journal，62513(1987)；De Block等，Plant Physiol.91694(1989))。
b.可筛选标记可使用的可筛选标记包括但不限于，β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，已知其编码的酶的各种产色底物；R-座位基因，其编码的产物能够调节花青甙色素(红色)在植物组织内的产生(Dellaporta等，Chromosome Sructure and Function，263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，PNAS USA 753737(1978))，已知其编码的酶的各种产色底物(如PADAC，一种产色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等，PNAS USA，801101(1983))，其编码儿茶酚双加氧酶，该酶可转化产色儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikuta等，Biotech.，8241(1990))；酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.，1292703(1983))，其编码能够氧化酪氨酸为DOPA和多巴醌的酶，DOPA和多巴醌反过来能够缩合形成可容易检测的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其编码有多种产色底物的酶；萤光素酶(lux)基因(Ow等，Science，234856(1986))，其可以允许生物发光检测；或水母发光蛋白基因(Prasher等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1261259(1985))，其可用于钙敏感性生物发光检测，或绿色荧光蛋白基因(Niedz等，Plant Cell Reports，14403(1995))。
来自玉米R基因复合物的基因被认为是特别有效的可筛选标记。玉米中的R基因复合物编码能够在多数种子和植物组织内调节花青甙色素生产的蛋白。来自R基因复合物的基因适于转化玉米，因为该基因在转化细胞内的表达不会伤害细胞。这样，被导入这种细胞内的R基因会导致红色色素表达，如果稳定导入就能够以红色部分来目测打分。如果玉米品系携带着编码花青甙生物合成途径中酶中间体的基因的显性等位基因(C2，A1，A2，Bz1和Bz2)，但是在R座位携带有隐性的等位基因，则用R转化来自该品系的任何细胞都会导致红色色素的生成。示范的品系包括Wisconsin22，其含有rg-Stadler等位基因和TR112，其为一种K55的衍生物，为r-g，b，P1。或者如果C1和R等位基因被共同导入时可使用玉米的任何基因型。另一个期待可用于本发明的筛选标记是萤火虫萤光素酶，由lux基因编码。可使用例如X光片，闪烁计数，荧光分光光度法，低照度摄像机，光子计数照相机或多室发光光度法(multiwell luminometry)检测转化细胞中lux基因的存在。还设想该系统可被发展用于生物发光的群体筛选，如在组织培养皿上，或者甚至用于整个植物筛选。
用于转化植物的多核苷酸可以包括但不限于，植物基因和非植物基因DNA，如来自细菌，酵母，动物或病毒的DNA。被导入的DNA可以包括修饰的基因，基因的部分，嵌合基因，包括来自相同或不同玉米基因型的基因。术语“嵌合基因”或“嵌合DNA”是指含有来自物种的至少两种DNA序列或区段的基因或DNA序列或区段，所述物种在天然环境下不会合并该DNA，或者其中DNA序列或片段以在未转化植物的天然基因组内通常不会发生的方式放置或相连。
还提供了含有编码耐超高温加工酶的多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸优选密码子被优化的多核苷酸。优选表达盒中的多核苷酸(第一多核苷酸)与调控序列，如启动子，增强子，终止序列或其组合可操作地相连，并且还可任选地与编码信号序列(N-或C-末端)的第二多核苷酸可操作地相连，该多核苷酸可将第一多核苷酸所编码的酶导向特定细胞或亚细胞部位。这样，启动子和一个或多个信号序列能够使酶在植物、植物组织或植物细胞内的特定位置高水平表达。启动子可以是组成型的启动子，诱导型(条件型)启动子或组织特异性启动子，如胚乳特异性启动子，例如玉米γ玉米醇溶蛋白启动子(如SEQID NO12)或玉米ADP-gpp启动子(如SEQ ID NO11，其含有5’非翻译和内含子序列)。本发明还提供了含有启动子的分离多核苷酸，所述启动子含有SEQ ID NO11或12，在低严谨性杂交条件下与其互补序列杂交的多核苷酸，或其具有启动子活性的片段，例如所述启动子活性是具有SEQ ID NO11或12的启动子的活性的至少10％，优选至少50％。还提供含有本发明表达盒或多核苷酸的载体以及含有本发明多核苷酸，表达盒或载体的转化细胞。本发明的载体可以含有编码不止一种本发明耐超高温加工酶的多核苷酸序列，该序列可以是正义或反义方向，且转化细胞可以含有一个或多个本发明载体。优选能够将核酸导入植物细胞的载体。
转化表达盒或者含有该表达盒的载体构建体可以被插入细胞中。该表达盒或载体构建体能够以附加型被携带或整合到细胞基因组中。然后转化细胞可以培养为转基因植物。相应地，本发明提供该转基因植物的产物。这种产物可以包括但不限于，种子，果实，后代和转基因植物后代的产物。
本领域技术人员可利用多种将构建体导入宿主细胞的技术，许多这样的技术都是已知的。细菌和许多真核细胞的转化可利用聚乙二醇，氯化钙，病毒感染，噬菌体感染，电穿孔和其它本领域公知方法进行。转化植物细胞或组织的方法包括使用根癌农杆菌(A.tumefaciens)或毛根农杆菌(A.rhizogenes)作为转化工具的DNA转化，电穿孔，DNA注射，微粒轰击，颗粒加速等(如参见EP 295959和EP138341)。
在一个实施方案中，来自土壤杆菌属Ti衍生载体的Ti和Ri质粒二元型载体被用于转化各种高等植物，包括单子叶和双子叶植物，如大豆，棉花，油菜，烟草和稻(Pacciotti等，Bio/Technology，3241(1985)Byrne等，Plant Cell Tissue and Organ Culture，83(1987)；Sukhapinda等，Plant Mol.Biol.8209(1987)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.，199178(1985)；Potrykus，Mol.Gen.Genet.，199183(1985)；Park等，J.Plant Biol.38365(1985)Hiei等，Plant J.，6271(1994))。利用T-DNA转化植物细胞已经进行了大量的研究，已被详细公开(EP120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System.Offset-drukkerij Kanters B.V.；Alblasserdam(1985)，Chapter V；Knauf等，Genetic Analysis of Host Range Expression byAgrogacterium，见Molecular Genetics of the Bacteria-PlantInteraction，Puhler，A.编，Springer-Verlag，New York，1983，p.245；以及An.等，EMBO J.，4277(1985))。
其它转化方法是本领域技术人员可获得的，如外源DNA构建体的直接摄取(见EP295959)，电穿孔技术(Fromm等，Nature(London)，319791(1986))，或者用覆盖有核酸构建体的金属粒子进行的高速粒子轰击(Kline等，Nature(London)32770(1987)和US 4,945,050)。转化后，细胞可以由本领域技术人员进行再生。特别相关的是最近发表的转化外源基因到重要经济作物如菜籽油菜(De Block等，PlantPhysiol.91694-701(1989))，向日葵(Everett等，Bio/Technology，51201(1987))，大豆(McCabe等，Bio/Technolgy，6923(1988)；Hinchee等，Bio/Technology，6915(1988)；Chee等，Plant Physiol.，911212(1989)；Christou等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，867500(1989)EP301749)，稻(Hiei等，Plant J.6271(1994))和玉米(Gordon Kamm等，Plant Cell，2603(1990)；Fromm等，Biotechnology，8833，(1990))内的方法。
含有基因组片段或合成片段的表达载体可以被导入原生质体或导入完整组织或分离细胞内。优选表达载体是被导入完整的组织。常用的培养植物组织的方法是已知的，例如，参见Maki等，“Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants”in Methods in Plant MolecularBiology & Biotechnology，Glich等，(编)pp.67-68，CRC Press(1993)；以及Phillips等，“Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation”inCorn & Corn Improvement，3rdEdition10，Sprague等，(编)pp.345-387，American Society of Agronomy Inc.(1988)。
在一个实施方案中，表达载体可以使用直接基因转移方法被导入玉米或其它植物组织，如微粒介导的运送，DNA注射，电穿孔等。用生物轰击设备(biolistic device)进行微粒介导运送可将表达载体导入植物组织。例如参见，Tomes等，“Direct DNA transfer into intact cellsvia microprojectile bombardment”in Gamborg和Phillips(编)PlantCell，Tissue and Organ CultureFundamental Methods SpringerVerlag，Berlin(1995)。但是，本发明设想了根据已知的转化方法用耐超高温酶转化植物。还可参见，Weissinger等，Annual Rev.Genet.，22421(1988)；Sanford等，Particulate Science and Techmology，527(1987)(洋葱)；Christou等，Plant Physiol.，87671(1988)(大豆)；McCabe等，Bio/Technology，6923(1988)(大豆)；Datta等，Bio/Technology，8736(1990)(稻)；Klein等，Proc.Natl.Acad，Aci.USA，854305(1988)(玉米)；Klein等，Bio/Technology，6559(1988)(玉米)；Klein等，Plant Physiol.，91440(1988)(玉米)；Fromm等，Bio/Technology，8833(1990)(玉米)；以及Gordon-Kamm等，PlantCeu，2，603(1990)(玉米)；Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878526(1990)(烟草叶绿体)；Koziel等，Biotechnology，11194(1993)(玉米)；Shimamoto等，Nature，338274(1989)(稻)；Christou等，Biotechnology，9957(1991)(稻)；欧洲专利申请EP0332581(鸭茅和其它Pooideae)；Vasil等，Biotechnology，111553(1993)(小麦)；Weeks等，Plant Physiol.，1021077(1993)(小麦)。Methodsin Molecular Biology，83.Arabidopsis Protocols，Martinez-Zapater和Salinas编，1998 Humana Press(阿布属)。
可以用单一DNA分子或多个DNA分子(即共转化)来实现植物的转化，这些技术都适用于本发明的表达盒和构建体。许多转化载体都可以用于植物转化，本发明的表达盒可与任何这种载体一起使用。载体的选择依赖于优选的转化技术和转化的目的物种。
最后，最期望用于导入单子叶植物基因组的DNA片段可以是同源基因或基因家族，所述基因编码期望的性状(如蛋白，脂类或多糖的水解)并被导入处在新启动子或增强子等，或者甚至可能是同源或组织特异性(如根-，珠托/叶鞘-，轮-，茎-，穗柄(earshank)-，谷粒-或叶-特异性)启动子或调控元件的调控下。实际上还预计本发明的特定应用是以组成型或诱导型的方式进行的基因导向。
合适转化载体的实例植物转化领域已知有许多用于植物转化的转化载体，本发明的基因可以与本领域公知的任何这种载体一起使用。载体的选择依据优选的转化技术以及转化的靶物种。
a.适于土壤杆菌转化的载体使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行转化可以使用许多载体。这些通常携带至少一种T-DNA边界(border)序列，包括例如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids.Res.(1984))。下文将介绍两种适于土壤杆菌转化的典型载体的构建过程。
pCIB200和pCIB2001二元载体pCIB200和pCIB2001可用于构建重组载体以使用土壤杆菌进行转化，其构建过程如下。用NarI消化pTJS75(Schmidhauser& Helinski，J.Bacteriol.，164446(1985))，切除四环素抗性基因，再插入来自pUC4K的AccI片段，所述片段带有NPTII(Messing &Vierra，Gene，19259(1982)Bevan等，Nature，304184(1983)McBride等，Plant Molecular Biology，14266(1990))得到pTJS75kan。将XhoI接头与PCIB7的EvoRV片段相连，所述片段含有左侧和右侧的T-DNA边界，植物可选择nos/nptII嵌合基因，和pUC多接头(Rothstein等，Gene，53153(1987))。将XhoI消化的片段克隆到SalI消化的pTJS75kan中，得到pCIB200(参见EP0332104，实施例19)。pCIB200含有以下独特的多接头限制位点EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，通过向多接头中插入额外的限制性位点而得到。pCIB2001中多接头中的独特限制性位点为EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。除含有这些独特的限制性位点外，pCIB2001还含有植物和细菌卡那霉素选择标记，土壤杆菌介导的转化所用的左侧和右侧T-DNA边界，用于在大肠杆菌和其它宿主之间转移的RK2-衍生trfA能，和同样来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适于克隆含有自身调控信号的植物表达盒。
pCIR10及其潮霉素选择衍生物；二元载体pCIB10含有编码用于在植物中进行选择的卡那霉素抗性基因以及T-DNA右侧和左侧边界序列，插入了来自宽宿主范围的质粒pRK252的序列，使其在大肠杆菌(E.coli)和土壤杆菌中能够复制。Rothstein等描述了其构建过程(Gene，53153(1987))。构建了pCIB10的各种衍生物，这些衍生物并入了Gritz等所描述的(Gene，25179(1983))潮霉素B磷酸转移酶的基因。这些衍生物使转基因植物能够只在潮霉素(pCIB743)上或在潮霉素和卡那霉素(pCIB715，pCIB717)上进行选择。
b.适于非土壤杆菌转化的载体不使用根癌农种菌进行的转化避免了在选择的转化载体中必需使用T-DNA序列，这样，除了例如上述含有T-DNA序列的载体外，还可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击，原生质体吸收(如PEG和电穿孔)以及显微注射进行的转化。载体的选择很大程度上依赖于待转化物种的优选选择。将进一步描述适于非土壤杆菌转化的典型载体构建过程的非限制性实例。
pCIB3064
pCIB3064是pUC的衍生载体，适于与利用除草剂basta(或膦丝菌素)进行的选择共同使用来直接基因转移。质粒pCIB246含有CaMV35S启动子，该启动子与大肠杆菌GUS基因和CaMV 35S转录终止子可操作融合。该质粒描述在PCT公开申请WO93/07278。该载体的35S启动子含有两个起始位点5’的ATG序列。这些序列已使用标准PCR技术进行了突变，突变去除了ATG，并形成了SspI和PvuII限制性位点。新的限制性位点距唯一的SalI为96和37bp，距实际的起始位点为101和42bp。所获的pCIB246衍生物命名为pCIB3025。然后通过SalI和SacI消化从pCIB3025切除GUS基因，末端处理成平头并重新连接形成pCIB3060质粒。该质粒pJIT82可以获自John InnesCentre，Norwich，将含有Streptomyces viridochromogenes的bar基因的400bp SmaI片段切除，并插入到pCIB3060的HpaI位点(Thompson等，EMBO J.，62519(1987))。这样就形成了pCIB3064，其含有bar基因，处于CaMV 35S启动子和终止子的调控下，用于除草剂筛选，并含有氨苄青霉素抗性基因(用于在大肠杆菌中筛选)以及带有唯一SphI，PstI，HindIII和BamHI位点的多接头。该载体适于克隆含有自身调控信号的植物表达盒。
pSOG19和pSOG35质粒pSOG35是利用能够赋予氨甲喋呤抗性的大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的转化载体。使用PCR从pSOG10扩增35S启动子(-800bp)，玉米Adh1基因的内含子(-550bp)和GUS非翻译前导序列18bp。同样用PCR扩增编码大肠杆菌II型二氢叶酸还原酶基因的250bp片段，将这两种PCR片段与pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段组装，所述pB1221片段含有pUC19载体的骨架以及胭脂碱合酶终止子。这些片段组装后形成了pSOG19，其含有35S启动子，该启动子与内含子6序列，GUS前导序列，DHFR基因和胭脂碱合酶终止子融合。用玉米褪绿斑点病毒(Maize ChloroticMottle Virus)(MCMV)的前导序列替换pSOG19中的GUS前导序列就形成了载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带有氨苄青霉素抗性的pUC基因并具有HindIII，SphI，PstI和EcoRI位点，可用于克隆外源物质。
c.造于叶绿体转化的载体为了在植物质体中表达本发明的核苷酸序列，可使用质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。该核苷酸序列被插入pPH143从而取代了PROTOX编码序列。然后将该序列用于质体转化并根据壮观霉素抗性筛选转化株。或者，将该核苷酸序列插入pPH143从而使其替代aadH基因。在这种情况下，依据PROTOX抑制剂的抗性筛选转化株。
接受转化方法处理的植物宿主任何能够随后无性繁殖(克隆繁殖)的植物组织，无论是通过器官发生或是胚胎发生，都可以用本发明的构建体进行转化。术语器官发生指从分生组织中心顺序地发育芽或根的过程，而胚胎发生指芽和根以一致的方式(而非顺序地)共同发育的过程，不论从体细胞或配子开始。特定组织的选择依据可使用的和最适于待转化的特定物种的无性繁殖系统而定。示范性的靶组织包括分化和未分化的组织或植物，包括但不限于叶片圆盘，根，茎，枝条，叶，花粉，种子，胚，子叶，下胚轴，大配子体，愈伤组织，现存的分生组织(如顶端分生组织，腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(如子叶分生组织和下胚轴分生组织)，肿瘤组织和各种形式的细胞和培养物，如单细胞，原生质体，胚和愈伤组织。植物组织可以在植物或器官，组织或细胞培养物内。
本发明的植物可以是各种形式。该植物可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；该植物可以是无性系转化株(如所有的细胞均转化含有表达盒)；该植物可以含有转化及非转化组织的嫁接体(如在柑橘物种中转化的根状茎嫁接到未转化的接穗上)。该转化植物可以各种方式繁殖，如通过无性繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自花授粉形成纯合的第二代(或T2)转化植物，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。显性选择标记(如nptII)可与表达盒相连以辅助育种。
本发明还可以用于转化任何植物物种，包括单子叶或双子叶植物，包括但不限于，玉米(玉蜀黍)，芸苔属物种(Brassica sp.)(如欧洲油菜(B.napus)，芜青(B.rapa)，芥菜(B.jucea))，特别是那些作为种子油来源的芸苔属物种，紫苜蓿(Medicago sativa)，稻(Oryzasativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor)，蜀黍(Sorghum vulgare))，黍(如御谷(Pennisetum glaucum)，野生稷(Panicum miliaceum)，谷子(Setaria italica)，穇子(Eleusinecoracana))，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamustinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，落花生(Arachishypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)，陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihotesculenta)，咖啡属(Cofea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananascomosus)，柑橘属(Citrus spp.)，可可树(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉属(Musa spp.)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangiferaindica)，油橄榄(Olea europaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，全缘澳洲坚果(Macadamia integrifolia)，扁桃(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗属(Saccharumspp.)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物，木本植物如针叶树和落叶树，南瓜，西葫芦，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温柏，甜瓜，李，樱桃，桃，油桃，杏，草莓，葡萄，覆盆子，黑莓，大豆，高粱，甘蔗，菜籽油菜(rapeseed)，三叶草，胡萝卜和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)，莴苣(如Lactucasativa)，菜豆(Phaseolus vulgaris)，利马豆(Phaseolus limensis)，山黧豆属(Lathyrus spp.)，花椰菜，嫩茎花椰菜，芜菁，萝卜，菠菜，石刁柏，洋葱，蒜，胡椒，芹菜和香瓜属(Cucumis)的成员，如黄瓜(C.sativus)，棱瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花属(Rhododendron spp.)，八仙花(Macrophyllahydrangea)，芙蓉(Hibiscus rosasanensis)，蔷薇属(Rosa spp.)，郁金香属(Tulipa spp.)，水仙属(Narcissus spp.)，碧冬茄(Petuniahybrida)，麝香石竹(Dianthus caryophyllus)，一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。可用于实施本发明的针叶树包括，例如松树，如火炬松(Pinus taeda)，湿地松(Pinus elliotii)，西黄松(Pinusponderosa)，小干松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)，花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加州铁杉(Tsuga canadensis)；白云杉(Picea glauca)；北美红杉(Sequoia sempervirens)；冷松，如太平洋冷松(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及杉木(cedars)，如北美乔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)。豆科植物包括菜豆类(beans)和豌豆类。菜豆类包括瓜尔豆、槐豆、苦豆(fenugreek)、大豆、菜豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。豆科植物包括但不限于，落花生属，如花生，野豌豆属，如广布野豌豆，毛苕子，赤豆，绿豆和鹰嘴豆，羽扇豆属，如羽扇豆，三叶草，菜豆属，如菜豆，和利马豆，豌豆属(Pisum)，如车轴草，草木犀属(Medicago)，如苜蓿，苜蓿属，如紫目蒮，百脉根属，如车轴草，兵豆属，如兵豆，和假木兰。用于本发明方法的优选饲料和草皮草包括苜蓿，鸭茅，牛尾覃，黑麦草，红顶草和小糠草。
优选地，本发明植物包括作物，如玉米，苜蓿，向日葵，芸苔属，大豆，棉花，红花，花生，高粱，小麦，黍，烟草，大麦，稻，番茄，马铃薯，南瓜，香瓜类，豆类作物等。其它优选的植物包括Liliopsida和Panicoideae。
当目的DNA序列被转化到特定植物物种中后，就可以使用传统育种技术，使该DNA在该物种中传播，或者转移到相同物种的其它品体中，特别包括商业品体。
以下描述了一些转化双子叶和单子叶植物的代表性方法，以及代表性的质体转化技术。
a.双子叶植物的转化用于转化双子叶植物的技术是本领域公知的，保括以土壤杆菌为基础的技术以及那些不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术包括原生质体或细胞对于外源遗传物质的直接摄取。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取，粒子轰击介导的运送或显微注射来完成。Paszkowski等，EMBO J.，32717(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，1999169(1985)，Reich等，Biotechnology，41001(1986)和Klein等，Nature，32770(1987)都描述了这些技术。无论何种情况，都可使用本领域公知的标准技术将转化细胞再生为完整的植物。
土壤杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术，因为其转化效率高，且可广泛应用于许多不同的物种。土壤杆菌转化通常涉及将携带有外源目的DNA的二元载体(如pCIB200或pCIB2001)转移到适当的土壤杆菌菌株内，这可能依赖于由宿主土壤杆菌株携带的位于共居(co-resident)Ti质粒或染色体上的vir基因的互补(如菌株CIB542用于pCIB200和pCIB2001(Uknes等，Plant Cell，5159(1993)))。重组二元载体到土壤杆菌的转移由三亲交配过程来完成，该过程使用携带有重组二元载体的大肠杆菌，携带有诸如pRK2013等的质粒的辅助大肠杆菌菌株，该辅助菌株能够将重组二元载体转移到靶土壤杆菌菌株内。或者，可通过DNA转化将重组二元载体转移到土壤杆菌中(Hfgen & Willmitzer，Nucl.Acids Res.，169877(1988))。
利用重组土壤杆菌进行的靶植物物种转化通常涉及将土壤杆菌与该植物的外植体共培养，并使用本领域公知的技术。在携带有抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上再生转化的组织，所述标记位于二元质粒T-DNA边界之间。
载体的导入可以采用已知方式。优选用于转化的细胞包括土壤杆菌，单子叶植物细胞和双子叶植物细胞，包括Liliopsida细胞和Panicoideae细胞。优选的单子叶细胞为谷类细胞，如玉米(玉蜀黍)，大麦和小麦以及积累淀粉的双子叶细胞，如马铃薯。
用基因转化植物细胞的另一方法涉及向植物组织和细胞中推进惰性或生物活性颗粒。该技术在美国专利US 4,945,050，5,036,006和5,100,792中有描述。通常，该过程涉及在能够有效穿透细胞外表面并掺入其内部的条件下向植物组织和细胞中推进惰性或生物活性颗粒。当使用惰性颗粒时，载体可以通过用含目的基因的该载体包被该颗粒而被导入细胞。或者，可用载体包围靶细胞这样可通过跟随粒子将载体带入细胞。生物活性颗粒(如干酵母细胞，干细菌或噬菌体，其均含有待导入的DNA)也可以被推进植物细胞组织。
b.单子叶植物的转化目前大多数单子叶植物物种的转化均已成为常规性的操作。优选的技术包括使用乙二醇(PEG)或电穿孔技术以及粒子轰击进入愈伤组织的方式直接将基因转移到原生质体。转化可以用单一DNA种类或多个DNA种类(即共转化)进行，这些技术都适用于本发明。共转化可以具有如下优点避免完整载体构建以及制备带有不连锁的目的基因和选择标记座位的转基因植物，如果认为需要的话，能够在随后的过程中去除该可选择标记。但是，共转化的一个缺陷是分开的DNA种类被整合到基因组中的频率小于100％(Schocher等，Biotechnolgy，41093(1986))。
专利申请EP0292435，EP0392225和WO93/07278描述了从玉米原种(elite)近交品系制备愈伤组织和原生质体，使用PEG或电穿孔转化原生质体，以及从转化的原生质体再生玉米植物的方法。Gordon-kamm等(Plant Cell，2603(1990))和Fromm等(Biotechnolgy，8833(1990))均公开了使用粒子轰击转化A188衍生玉米品系的方法。另外，WO03/07278和Koziel等(Biotechnology，11194(1993))均描述了使用粒子轰击转化原种近交玉米品系。该技术使用了授粉后14-15天从玉米穗剪下的1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚和PDS-1000He Biolistics设备。
还可应用原生质体或粒子轰击直接转移基因来实现稻的转化。已公开了Japonica型和Indica型的原生质体介导转化(Zhang等，PlantCell Rep.，7379(1988)；Shimamoto等，Nature，338274(1989)；Datta等，Biotechnology，8736(1990))。这两种类型还可使用粒子轰击进行常规转化(Christou等，Biotechnology，9957(1991)。另外，WO93/21335公开了电穿孔转化稻的方法。专利申请EP0332581公开了制备，转化及再生Pooideae原生质体的方法。这些技术可以转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。另外，Vasil等(Biotechnology，10667(1992))开公开了使用粒子轰击进入C型长期可再生愈伤组织细胞转化小麦的方法，Vasil等(Biotechnology，111553(1993))和Weeks等(PlantPhysiol.，1021077(1993))还公开了使用未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织进行粒子轰击转化小麦的方法。但是转化小麦的优选方法涉及利用未成熟胚粒子轰击的转化，并且包括在基因运送前进行高蔗糖或高麦芽糖步骤。轰击前，将任意数量的胚(0.75-1mm长)植到3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基上(Murashiga & Skoog，PhysiologiaPlantarum，15473(1962))用于诱导体细胞胚，该过程在黑暗条件下进行。在轰击当天，将胚从诱导培养基中取出并置于渗压剂上(即以期望的浓度，通常为15％，加入蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。使胚质壁分离2-3小时，然后轰击。通常每个靶板上有20个胚胎，但不是关键性的。使用标准方法，将适当的基因携带质粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀到微米大小的金颗粒上。用DuPont Biolistics氦设备，标准80目筛网，约1000psi的爆破压力轰击各板胚。轰击后，将胚放回暗处使其恢复约24小时(仍置于渗压剂上)。24小时后将胚从渗压剂取出再置于诱导培养基上约1个月使其再生。约1一个月后，将带有发育的胚胎发生愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基中(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)，该培养基还进一步含有适当的选择剂(pCIB3064为10mg/l basta，pSOG35则使用2mg/l氨甲喋呤)。大约1个月后，将长出的芽转移到更大的名为“GA7s”的无菌容器内，该容器含有半强度MS，2％蔗糖和相同浓度的选择剂。
已经公开了使用土壤杆菌转化单子叶植物的方法，参见WO94/00977和US5,591,616，均引入本文作为参考。
c.质体转化大致如文献(Svab和Maliga，PNAS，90913(1993))所述，在T琼脂培养基上的1”圆形矩阵上使Nicotiana tabacum c.v.‘Xanthi nc’的种子发芽，每板7个，用覆有pPH143和pPH145质粒DNA的1μm钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)在播种后12-14进行轰击。轰击后的幼苗在T培养基上培育2天，然后切下叶子并在RMOP培养基平板上将远轴一侧向上置于亮光处(350-500μmol光子/m2/s)(Svab，Hajdukiewicz和Maliga，PNAS，878526(1990))，所述培养基含有500μg/ml二盐酸壮观霉素(Sigma St.Louis，MO)。轰击后3-8周将出现在黄化叶子下面的耐性芽亚克隆到相同的选择培养基中，使其形成愈伤组织，并分离第二批芽进行亚克隆。通过Southern印迹标准技术(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor(1989))，评价独立亚克隆中转化质体基因组拷贝的完全分离(homoplasmicity)。在1％Tris-硼酸盐(TBE)琼脂凝胶上分离BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.Plant Mol.BiolReporter，5346(1987))，转移到尼龙膜上(Amersham)并与32P标记的随机引发DNA序列杂交，该DNA序列相应于pC8的0.7kbBamHI/HindIII DNA片段，其含有rps7/12质体靶向序列的一部分。无菌条件下在含有壮观霉素的MS/IBA培养基上使同质芽生根(McBride等，PNAS，917301(1994))并转移到温室。
稳定转化植物的制备及表征然后在适于筛选转基因细胞的选择培养基中培养转化植物细胞使其形成愈伤组织。从愈伤组织形成芽(shoots)，再通过在生根培养基中生长从芽形成幼苗。通常各种构建体会与标记相连以便于选择植物细胞。为方便起见，该标记可以是对杀生物剂(特别是抗生素，如卡那霉素，G418，博莱霉素，潮霉素，氯霉素，除草剂等)的抗性。所用的特定标记将允许与缺乏被导入DNA的细胞相比较而筛选出转化细胞。DNA构建体的组分，包括本发明的转录/表达盒，均可以从宿主天然(内源性)或外来(外源性)的序列制备。“外来”指该序列在构建体被导入的野生型宿主中不存在。异源构建体将含有至少一个区域，该区域不是转录起始区域所来源的基因天然的。
为确认转基因在转基因细胞和植物中存在，可使用本领域公知的方法进行Southern印迹分析。由于利用适当的限制性酶，多核苷酸区段能够容易地与含有区段的构建体区分，所以可通过Southern印迹检测并定量多核苷酸区段到基因组的整合。转基因的表达产物可以各种方式检测，视该产物的属性而定，包括Western印迹和酶试验。一种十分有效的定量蛋白表达及检测不同植物组织中复制情况的方法是使用报道基因，如GUS。一旦获得了转基因植物，就可以使其生长产生具有期望表型的植物组织或部分。可以收集该植物组织或植物部分和/或收获种子。种子可以作为来源用于生长另外的含有具有期望特征的植物组织或部分的植物。
这样本发明提供含有至少一种本发明多核苷酸，表达盒或载体的转化植物或植物部分，如穗，种子，果实，谷粒，秸杆(stover)，谷壳(chaff)或渣屑(bagasse)，使用这种植物或其部分的方法以及制备这种植物的方法。转化的植物或其部分会表达加工酶，该酶任选地位于某一组织或发育谷粒的特定细胞或亚细胞部位。例如，本发明提供含有在植物细胞内存在的至少一种淀粉加工酶的转化植物部分，其中所述植物部分获自转化植物，其基因组中增加了编码至少一种淀粉加工酶的表达盒。该加工酶除非被诸如加热，研磨或其它方法活化否则不会对靶底物起作用，其中所述方法使得酶能够在酶有活性的条件下接触底物。
本发明优选方法本发明的自加工植物和植物部分可在各种利用其中表达和活化的加工酶(耐中温，高温或超高温)的方法中应用。根据本发明，获自转基因植物的转基因植物部分被置于能够表达并活化该加工酶的条件下，其中所述转基因植物的基因组中增加了至少一种淀粉加工酶。活化后，该加工酶被激活并能够对其通常作用的底物发挥作用从而获得期望产物。例如，活化后该淀粉加工酶作用淀粉使其降解，水解，异构化或以其它方式修饰以获得期望的结果。可使用非淀粉加工酶来破坏植物细胞膜以促进植物淀粉，脂类，氨基酸或其它产品的提取。另外，非耐超高温酶和耐超高温酶可以与本发明的自加工植物或植物部分相结合使用。例如，耐中温非淀粉降解酶可以被活化以破坏植物细胞膜从而利于淀粉提取，然后，活化自加工植物体内的耐超高温淀粉降解酶以降解淀粉。
在谷物中表达的酶可以将含有该酶的植物或其部分置于能够提高酶活性的条件下而将其活化。例如，可以使用下述的一项或多项技术可将植物部分与水接触，这样为水解酶提供了底物从而将该酶活化。可以使植物部分与水接触，这样使酶从其在植物部分发育过程中沉积的区域迁移出从而与底物接触。由于在成熟，谷物干燥和再水化过程中区域化被破坏，因此酶的迁移是可能的。完整或破裂的谷粒可以与水接触，这样使酶从其在植物部分发育过程中沉积的位置迁移出从而与底物接触。还可加入活化性化合物使酶活化。例如，钙依赖性酶可以通过加入钙使其活化。其它的活化性化合物可由本领域技术人员确定。可以通过去除失活剂而使酶活化。例如，已知一些肽抑制剂会抑制淀粉酶，淀粉酶可以与淀粉酶抑制剂共表达然后再通过加入蛋白酶将其活化。可将pH调整到酶活性最大的状态而活化酶。还可以提高温度来活化酶。在不超过酶最高温度时升高温度通常会提高酶活性。从环境温度活性水平升高温度到耐中温酶会丧失活性的温度，该酶的活性会提高，通常该丧失活性的温度为低于或等于70℃。同样，可以升高温度来活化耐高温酶和耐超高温酶。耐高温酶可通过将温度加热至活性或稳定性的最高温度而将其活化。对于耐高温酶该稳定性或活性最高温度通常为70-85℃。耐超高温酶比耐中温或耐高温酶具有更高的相对活化，因为其潜在温度变动更大，从25℃直到85℃或95℃甚至100℃。可通过任何方法提高温度，例如通过加热如通过烘烤，煮沸，加热或汽蒸，放电或其组合。另外还可通过研磨来活化表达耐中温或耐高温酶植物内的酶从而使酶与底物接触。
最适条件，如温度，水化，pH等，均可由本领域技术人员确定，并可依据所用的具体酶和该酶期望的应用而定。
本发明还提供可能辅助特定作用的外源性酶的应用。例如，本发明自加工植物或植物部分可以与外源性酶结合使用以促进反应。例如，转基因α-淀粉酶玉米可以与其它淀粉加工酶如支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，甘露聚糖酶，半纤维素酶等结合使用，以水解淀粉或形成乙醇。实际上，已经发现，与仅仅使用转基因α-淀粉酶玉米相比，将转基因α-淀粉酶玉米与这种酶共同使用能够出乎意料地提供优异的淀粉转化程度。
这里提供了构思的适当方法的实例。
a.从植物中提取淀粉本发明提供促进从植物中提取淀粉的方法。特别是，将至少一种多核苷酸导入植物从而使该酶与植物内的淀粉颗粒的物理位置十分靠近，所述多核苷酸编码能够破坏胚乳物理限制性基质(细胞壁，非淀粉多糖和蛋白基质)的加工酶。优选地，在本发明的该实施方案中转化植物表达一种或多种蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶，酯酶等，但不表达具备任何淀粉降解活性的酶，这样就可以维持淀粉颗粒的完整性。这些酶在植物部分如谷粒内的表达会提高谷粒的加工特性。所述加工酶可以是耐中温，高温或超高温的。在一个实例中，来自本发明转化植物的谷粒被加热干燥，很可能灭活非耐超高温加工酶并改进种子的完整性。谷粒(或破裂的谷粒)在高或低的水份含量或条件下(参见Primary Cereal Processing，Gordon和Willim，eds，pp.319-337(1994)，将其引入本文作为参考)使用或不使用二氧化硫，在低温或高温(时间是非常重要的)下浸泡。达到升高的温度后，任选在一定水分含量条件下，通过活化酶如蛋白酶，木聚糖酶，植酸酶或葡聚糖酶，破坏胚乳基质的完整性，这些酶能够降解胚乳中的蛋白和非淀粉多糖而使其中的淀粉颗粒保持完整并更易从所获产物材料中回收。另外，流出物(elluent)中的蛋白和非淀粉多糖至少被部分降解且高度浓缩，因此可用于改良的动物饲料，食品或作为微生物发酵的中间成分。流出物被认为是组成改善的玉米浆。
这样，本发明提供制备淀粉颗粒的方法。该方法包括在能够活化所述至少一种酶的条件下处理谷粒，如破裂的谷粒，形成含有淀粉颗粒和非淀粉降解产物，如消化的胚乳基质产物的混合物，其中所述谷粒含有至少一种非淀粉加工酶。非淀粉加工酶可以是耐中温，高温或超高温的。活化酶后，从混合物中分离出淀粉颗粒。所述谷粒获自转化植物，其基因组含有(或增加了)编码所述至少一种酶的表达盒。例如，该加工酶可以是蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶，硫氧还蛋白酶/硫氧还蛋白还原酶或酯酶。优选该加工酶耐超高温。可以在低或高含水量条件下，在二氧化硫存在或不存在下处理谷粒。根据转基因植物谷粒中加工酶的活性和表达水平，可以在加工前或过程中将转基因谷粒与商品谷粒混合。还提供了该方法获得的产品，如淀粉，非淀粉产品和含有至少一种额外组分的改进型浸泡水(玉米浆)。
b.淀粉加工方法本发明转化植物或植物部分可以含有本文公开的淀粉加工酶，其能够将淀粉颗粒降解为糊精，其它修饰的淀粉或己糖(如α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，淀粉支链淀粉酶)或将葡萄糖转化为果糖(如葡萄糖异构酶)。优选地，该淀粉降解酶选自α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，淀粉支链淀粉酶，葡萄糖异构酶，和其组合，被应用于转化谷粒。另外，该酶优选地与启动子和信号序列可操作地相连，所述信号序列将酶靶向淀粉颗粒，造粉体，质外体或内质网。最优选该酶在胚乳表达，特别是玉米胚乳，并定位在一个或多个细胞区室内，或位于淀粉颗粒本身中。优选的植物部分是谷粒。优选的植物部分来自玉米，小麦，大麦，黑麦，燕麦，甘蔗或稻。
根据一种本发明的淀粉降解方法，转化的谷粒在淀粉颗粒中积累淀粉降解酶，在50℃-60℃常规温度下浸泡谷粒，并以本领域公知方法湿磨。优选该淀粉降解酶耐超高温。由于酶被亚细胞靶向淀粉颗粒，或通过在常规温度下将酶与淀粉颗粒在湿磨加工过程中相接触，将酶与淀粉颗粒相连，该加工酶与淀粉颗粒被共纯化以获得淀粉颗粒/酶混合物。回收淀粉颗粒/酶混合物后，通过有利于酶活性的条件使酶活化。例如，可将酶置于各种含水量和/或温度条件下加工以促进淀粉部分(为制备衍生淀粉或糊精)或完全水解为己糖。通过这种方式获得含有高浓度葡萄糖或果糖当量的糖浆。该方法能够有效地节省时间，能量和酶消耗，并提高淀粉转化为相应己糖的效率以及产品如高糖浸泡水(玉米浆)和更高葡萄糖当量的糖浆的生产效率。
另一实施方案中，处理表达该酶的植物或该植物的产品如果实或谷粒或从该谷粒制备的面粉，以活化酶，并将植物内表达和包含的多糖转化为糖(sugars)。优选地，将该酶与信号序列融合，如本文所述，所述信号序列将酶靶向淀粉颗粒，造粉体，质外体或内质网。然后可以从植物或植物产品中分离形成的糖。另一实施方案中，根据本领域公知并在本文公开的方法，将能够转化多糖为糖(sugars)的加工酶置于诱导型启动子的调控下。该加工酶可以是耐中温，高温或超高温的。将植物培养到期望阶段，然后诱导启动子使该酶表达并将植物或植物产品中的多糖转化为糖。优选该酶与能够将其靶向淀粉颗粒，造粉体，质外体或内质网的信号序列可操作地相连。另一实施方案中，制备了表达能够将淀粉转化为糖的加工酶的转化植物。将该酶与可将酶导向植物中淀粉颗粒的信号序列相融合。之后从含有由转化植物表达的该酶的转化植物中分离淀粉。然后活化分离的淀粉中所含的该酶使其将淀粉转化为糖。该酶可以是耐中温，高温或超高温的。本文提供了能够转化淀粉为糖的耐超高温酶的实例。该方法可与任何这样的植物使用，所述植物能够产生多糖并能够表达能将多糖转化为糖或水解的淀粉产物，如糊精，麦芽寡糖，葡糖糖和/或其混合物的酶。
本发明提供从植物或植物产物制备糊精和改性淀粉的方法，所述植物或植物产物已被能够水解多糖某些共价键以形成多糖衍生物的加工酶转化。在一个实施方案中，表达该酶的植物或其产物，如果实或谷粒，或由该谷粒制成的面粉，被置于足以活化该酶并将植物中所含多糖转化为分子量减小的多糖的条件下。优选地，如本文所述，将该酶与信号序列融合，所述信号序列将酶靶向淀粉颗粒，造粉体，质外体或内质网。然后可从植物或植物产品中分离或回收产生的糊精或衍生淀粉。另一实施方案中，根据本领域公知和在本文公开的方法，将能够转化多糖为糊精或改性淀粉的加工酶置于诱导型启动子的调控下。将植物培养到期望阶段，然后诱导启动子使该酶表达并将植物或植物产品中的多糖转化为糊精或改性淀粉。优选该酶为α-淀粉酶，支链淀粉酶，异或新支链淀粉酶，并优选该酶与能够将其靶向淀粉颗粒，造粉体，质外体或内质网的信号序列可操作地相连。一个实施方案中，该酶被靶向质外体或内质网。另一实施方案中，制备了表达能够将淀粉转化为糊精或改性淀粉的酶的转化植物。该酶与能够将其靶向植物内淀粉颗粒的信号序列融合。然后从含有转化植物所表达酶的转化植物中分离淀粉。然后在足以活化酶的条件下，活化淀粉中所含的酶，使其转化淀粉为糊精或改性淀粉。本文提供了能够转化淀粉为水解淀粉产物的耐超高温酶实例。该方法可与任何这样的植物使用，所述植物能够产生多糖并能够表达能将多糖转化为糖的酶。
另一实施方案中，在利于淀粉降解酶活性的条件下，浸泡来自本发明转化植物的谷粒各种不同时间，所述植物能够积累淀粉降解酶，该酶可以降解淀粉颗粒中的键形成糊精，改性淀粉或己糖(如α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，淀粉支链淀粉酶)。所获的混合物可能含有高水平的淀粉衍生产物。这种谷粒的应用1)避免了研磨谷粒或为首先获得淀粉颗粒而以其它方式加工谷粒的需求，2)通过将酶直接放在谷粒胚乳组织内而使得淀粉更加容易被酶接近，以及3)无需微生物产生的淀粉水解酶。这样，通过在水的存在下加热谷粒——优选玉米谷粒——以使酶作用底物，可避免己糖回收前的整个湿磨过程。
该方法还可以用于制备乙醇，高果糖糖浆，含己糖(葡萄糖)发酵培养基或任何其它不需要精制谷粒组分的淀粉应用。
本发明还提供制备糊精，麦芽寡糖和/或糖(sugar)的方法，涉及在活化所述至少一种酶的条件下，处理含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分，从而使酶消化淀粉颗粒以形成含糖水性溶液。该植物部分获自转化植物，其基因组中增加了编码所述至少一种加工酶的表达盒。然后收集含有糊精，麦芽寡糖和/或糖的水性溶液。一个实施方案中，该加工酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，支链淀粉酶，葡糖淀粉酶，淀粉支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其任意组合。优选该酶耐超高温。另一实施方案中，该方法还进一步包括分离糊精，麦芽寡糖和/或糖的步骤。
c.改良的玉米品种本发明还提供改良玉米品种(以及其它作物品种)的制备方法，所述品种具有正常水平的淀粉累积量并在其胚乳或淀粉累积器官内积累足量水平的淀粉分解酶，使得一旦活化其中所含的酶，例如，对于耐超高温酶，通过煮沸或加热该植物或其部分，该酶被激活，并促进淀粉到单糖的快速转化。这些单糖(主要为葡萄糖)可以给被处理玉米带来甜味。所获的玉米植物为改良品种，具有作为谷物生产杂交种和甜玉米的双重用途。这样，本发明提供生产超甜玉米的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理转化玉米或其部分，所述玉米或其部分的基因组中增加了表达盒，并在胚乳中表达该表达盒，所述表达盒含有与编码至少一种淀粉分解酶的第一多核苷酸可操作地相连的启动子，这样可将玉米中的多糖转化为糖，产生超甜玉米。所述启动子可以是组成型启动子，种子特异性启动子或胚乳特异性启动子，其与编码加工酶如α-淀粉酶(如含有SEQ ID NO13，14或16的酶)的多核苷酸序列相连。优选地，该酶耐超高温。在一个实施方案中，该表达盒进一步含有编码信号序列的第二多核苷酸，该信号序列与第一多核苷酸所编码的酶可操作地相连。本发明该实施方案中的示范性信号序列能够将酶导向质外体，内质网，淀粉颗粒或造粉体。培养该玉米植物，使得形成带有谷粒的玉米穗，然后诱导启动子使酶表达并将植物所含的多糖转化为糖(sugar)。
d.自发酵植物在本发明的另一实施方案中，植物，如玉米，稻，小麦或甘蔗被工程改造成在其细胞壁中积累大量加工酶，如木聚糖酶，纤维素酶，半纤维素酶，葡聚糖酶，果胶酶等(非淀粉多糖降解酶)。收获谷粒组分(或者如果是甘蔗则是收获糖)后，将秸杆，谷壳或渣屑用作酶的来源，该酶被引导表达和积累在细胞壁内，并用作生物质的来源。秸杆(或其它剩余组织)被用作回收可发酵糖的工艺的原料。这个获得可发酵糖的工艺由活化非淀粉多糖降解酶组成。例如，活化可以包括在水的存在下，以足够将非淀粉多糖水解为最终糖的时间，加热植物组织。这样，该自加工秸杆产生转化多糖为单糖所需要的酶，而基本上无需额外的成本，因为它们是原料的一种组分。另外，温度依赖性酶对植物生长和发育没有有害影响，而通过与该蛋白融合的纤维素/木糖结合域而实现的细胞壁导向，甚至于向多糖微纤维内导向，可改善底物与酶的可接近性。
这样，本发明还提供一种使用转化的植物部分的方法，该植物部分细胞的细胞壁内包含至少一种非淀粉多糖加工酶。该方法包括在活化所述至少一种加工酶的条件下，处理含有至少一种非淀粉多糖加工酶的转化植物部分，从而消化淀粉颗粒以形成含有糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化植物，其基因组中增加了编码所述至少一种非淀粉多糖加工酶的表达盒；并收集含糖的水性溶液。本发明还包括转化的植物或植物部分，在该植物或其部分的细胞中或细胞的细胞壁中含有至少一种非淀粉多糖加工酶。该植物部分获自转化植物，其基因组中增加了编码所述至少一种非淀粉加工酶的表达盒，所述加工酶如木聚糖酶，纤维素酶，葡聚糖酶，果胶酶或其任意组合。
e.高蛋白和糖含量的水相在另一实施方案中，蛋白酶和酯酶被工程改造在种子如大豆种子内积累。通过例如加热等方法活化蛋白酶或酯酶后，种子内的这些酶会在加工过程中水解大豆中的脂类和储备蛋白。这样就获得了含有氨基酸的可溶性产物和脂肪酸，所述产物可用作饲料，食品或发酵培养基。多糖通常在加工后谷粒的不溶性组分内发现。但是，通过结合种子内多糖降解酶的表达和积累，蛋白和多糖就可以被水解，然后可在水相内发现。例如，来自玉米的玉米醇溶蛋白和来自大豆的储备蛋白和非淀粉多糖可以这种方式溶解。这种水相和疏水相的组分可通过用有机溶剂或超临界二氧化碳抽提而容易地分离。这样就提供了制备谷粒水相抽提物的方法，所述抽提物含有更高水平蛋白，氨基酸，糖类(sugars)或糖质(saccharides)。
f.自加工发酵本发明提供了一种制备乙醇，发酵饮料或其它发酵衍生产物的方法。该方法涉及获得植物或植物的产物或部分，或植物衍生物如谷物面粉，其中表达了能够将多糖转化为糖(sugar)的加工酶。该植物或其产物被处理以使得如上所述通过多糖转化产生糖。然后根据本领域公知技术发酵该糖和植物的其它组分以形成乙醇或发酵饮料，或其它发酵衍生产物。例如参见美国专利US 4,929,452。简言之，在能够促进糖转化为乙醇的条件下与酵母一起孵育由多糖转化形成的糖。适当的酵母包括耐高醇和耐高糖的酵母菌株，例如酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)ATCC No.20867。该菌株于1987年9月17日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Colletion，Rockville，MD)，保藏号为ATCC No.20867。然后发酵产物或发酵饮料可经过蒸馏分离出乙醇或蒸馏饮料，或者以其它方式回收发酵产物。该方法所用的植物可以是任何含有多糖并能够表达本发明酶的植物。这里公开了许多这样的植物。优选该植物是经济作物。更优选该植物是通常用于制备乙醇或发酵饮料，或发酵产物的那些植物，如小麦，大麦，玉米，黑麦，马铃薯，葡萄或稻。最优选该植物为玉米。
该方法包括在活化所述至少一种酶的条件下处理含有至少一种多糖加工酶的植物部分，从而消化植物部分中的多糖以形成可发酵糖。该多糖加工酶可以是耐中温，高温或超高温的。优选该酶耐超高温。该植物部分获自转化植物，其基因组中增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒。本发明该实施方案的植物部分包括但不限于，谷粒，果实，种子，茎，木质，蔬菜或根。优选植物包括但不限于，燕麦，大麦，小麦，浆果，葡萄，黑麦，玉米，稻，马铃薯，甜菜，甘蔗，菠萝，草和树。植物部分可与商品谷粒或其它市售底物组合使用；该加工底物的来源可以是自加工植物以外的来源。然后在促进可发酵糖转化为乙醇的条件下，例如与酵母和/或其它微生物共同孵育可发酵糖。在一个优选实施方案中，该植物部分来自用α-淀粉酶转化的玉米，该淀粉酶已被发现可以降低发酵时间和成本。
已经发现，当使用根据本发明方法制备的表达热稳定性α-淀粉酶的转基因玉米进行发酵时，残余淀粉的量降低。这说明在发酵过程中更多淀粉被溶解。残余淀粉量的这种减少导致蒸馏器的谷粒具有更高重量的蛋白含量和更高价值。另外，本发明转基因玉米的发酵可以在较低pH和在较高温度，例如，高于85℃，优选高于90℃，更优选95℃或更高，进行液化加工，使用较低pH导致降低用于调整pH的化学物品的成本，使用较高温度导致缩短液化时间，且使淀粉更彻底溶解化，减少液化时间，所有这些都使得发酵反应的乙醇产量更高，效率更高。
另外，已发现用甚至小比例的根据本发明制备的转基因植物与常规植物部分接触，可以减少发酵时间，降低相关成本。因此，相对于使用不含多糖加工酶的植物部分，本发明涉及减少植物发酵时间，包括使用来自含有多糖加工酶的植物的转基因植物部分，所述酶可以将多糖转化为糖。
g.粗淀粉加工酶及其编码多核苷酸编码耐中温加工酶的多核苷酸被导入植物或植物部分。在一个优选实施方案中，本发明多核苷酸是玉米优化的多核苷酸，例如SEQ IDNO48，50和59所示的，其编码葡糖淀粉酶，例如SEQ ID NO47和49所示的。另一优选实施方案中，本发明多核苷酸为玉米优化多核苷酸，例如SEQ ID NO52所示，其编码α-淀粉酶，例如SEQ ID NO51所示。另外，本发明进一步包括加工酶融合产物。一个优选实施方案中，本发明多核苷酸是玉米优化多核苷酸，例如SEQ ID NO46所示，其编码α-淀粉酶和葡糖淀粉酶融合物，例如SEQ ID NO45所示。本发明进一步提供加工酶的组合。例如，提供了淀粉加工酶和非淀粉加工酶的组合。加工酶的这种组合可通过利用编码各种酶的多基因构建体而获得。或者，被该酶稳定转化的各转基因植物可用公知方法杂交以获得含有两种酶的植物。另一方法包括和该转基因植物一起使用外源酶。
淀粉加工酶和非淀粉加工酶的来源可分离或衍生自任何来源，其相应多核苷酸可由本领域技术人员确定。优选，α-淀粉酶来自曲霉属(如Aspergillus shirousami和黑色曲霉(Aspergillus niger))，根霉属(如米根霉(Rhizopus oryzae))和植物如玉米，大麦和稻。优选葡糖淀粉酶来自曲霉属(如Aspergillus shirousami和Aspergillusniger)，根霉属(如米根霉(Rhizopus oryzae))和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)(如热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum))。
本发明另一实施方案中，多核苷酸编码耐中温淀粉加工酶，其与玉米优化多核苷酸可操作地相连，例如SEQ ID NO54所示，所述玉米优化多核苷酸编码粗淀粉结合域，例如SEQ ID NO53所示。
另一实施方案中，组织特异性启动子包括胚乳特异性启动子如玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子(例如SEQ ID NO12所示)或玉米ADP-gpp启动子(例如SEQ ID NO11所示，其包括5’非翻译序列和内含子序列)。这样，本发明包括含有启动子的分离多核苷酸，所述启动子含有SEQ ID NO11或12，在低严谨度杂交条件下能够与其互补序列杂交的多核苷酸，或其具有启动子活性的片段，例如所述活性为具有SEQID NO11或12序列的启动子的活性的至少10％，优选至少50％。
一个实施方案中，淀粉水解基因的产物，如α-淀粉酶，葡糖淀粉酶或α-淀粉酶/葡糖淀粉酶融合物可被靶向特定细胞器或部位，如内质网或质外体，而不是细胞质。示例是玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(SEQ ID NO17)的应用，该序列赋予蛋白特异性导向质外体，以及γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(SEQ ID NO17)的应用，所述信号序列与加工酶可操作地相连，该酶与用于滞留于内质网内的序列SEKDEL可操作地相连。将蛋白或酶导向特定区域可以使酶以某种方式定位，这种方式使得酶不会与底物相接触。通过这种方式，直到该酶接触到底物才会发生酶的酶作用。该酶可以通过研磨(物理破坏细胞完整性)和水化过程与其底物接触。例如，耐中温淀粉水解酶可以被导向质外体或内质网，从而不会与造粉体中的淀粉颗粒接触。研磨谷粒会破坏谷粒的完整性，然后淀粉水解酶会与淀粉颗粒接触。以这种方式，酶和其底物共定位的潜在副作用可以被避免。
h.无需加入甜味剂的食物产品还提供了不加入甜味剂而生产增甜谷粉制食品(farinaceous foodproduct)的方法。谷粉制食品实例包括但不限于，早餐食品，即食食品，烘烤食品，意大利面食和谷物产品如早餐谷类食品。该方法包括在活化所述淀粉加工酶的条件下，处理含有至少一种淀粉加工酶的植物部分以使植物部分中的淀粉颗粒加工为糖以形成甜味产品，所述甜味产品是相对于例如由来自不含该耐超高温酶的植物部分的淀粉颗粒所制成的产品而言。优选该淀粉加工酶耐超高温并通过加热，如烘烤，煮沸，加热，汽蒸，放电或其组合而被活化。该植物获自转化植物，例如转化大豆，黑麦，燕麦，大麦，小麦，玉米，稻或甘蔗，所述转化植物的基因组中增加了编码所述至少一种耐超高温淀粉加工酶的表达盒，所述加工酶如α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其任意组合。然后将甜味产品加工成谷粉制食品。本发明还提供由该方法制备的谷粉制食品产品，如谷类食品，早餐食品，即食食品，烘烤食品。该谷粉制食品产品可以由甜味产品和水制成，并可含有麦芽，调味剂，维生素，矿物质，着色剂或其任意组合。
该酶可在将植物材料导入谷类产品之前或在加工谷类产品的过程中被活化，以将植物材料中的多糖转化为糖(sugar)。相应地，植物材料内所含的多糖可通过在加入到谷粉制产品之前活化该材料而转化为糖，例如对于耐超高温酶，通过加热活化。然后将含有由多糖转化而成的糖的植物材料加入产品中以生产甜味产品。或者，可在加工谷粉制产品过程中由酶将多糖转化为糖。用于制备谷类产品的方法实例是本领域公知的，包括加热，烘烤，煮沸等，如美国专利US 6,183,788；6,159,530；6,149,965；4,988,521和5,368,870所述的。
简言之，可通过与水一起混合各种干配料而制备生面团，并煮制使淀粉组分凝胶化并形成煮熟味(cooked flavor)。然后可机械加工该煮制过的材料以形成煮制的面团如谷类面团。所述干配料可以包括各种添加剂如糖，淀粉，盐，维生素，矿物质，色素，调味剂，盐等。除水外，还可加入各种液体配料如玉米(玉蜀黍)或麦芽糖浆。谷粉材料可包括谷类谷粒，切割谷粒(cut grains)，粗磨谷粉(grits)或来自小麦，稻，玉米，燕麦，大麦，黑麦或其它谷粒的面粉及其混合物，它们来自本发明转基因植物。然后可通过诸如挤压或冲压的方法将面团加工成期望的形状，再使用诸如James炊具，烤箱或放电设备等进一步烹饪。
还提供不加入甜味剂而使含淀粉产品增甜的方法。该方法包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种淀粉加工酶的淀粉，从而消化淀粉形成糖从而形成处理过的(变甜)淀粉，例如，该甜味是相对于通过处理不含所述耐超高温酶的淀粉所制成的产品而言。本发明淀粉获自转化植物，所述转化植物的基因组中增加了编码所述至少一种加工酶的表达盒，优选的酶包括α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。优选该酶耐超高温并可用加热活化。优选的转化植物包括玉米，大豆，黑麦，燕麦，小麦，大麦，稻和甘蔗。然后将该处理过的淀粉加入产品中以形成增甜的含淀粉产品，如谷粉制食品产品。还提供由该方法制备的增甜的含淀粉产品。
本发明还提供使含多糖果实或蔬菜增甜的方法，包括在能够活化所述至少一种酶的条件下，处理含有至少一种多糖加工酶的果实或蔬菜，从而加工果实或蔬菜中的多糖以形成糖，产生增甜的果实或蔬菜，例如，该甜味是相对于来自不含多糖加工酶的植物的蔬菜或水果而言。本发明的水果或蔬菜获自转化植物，所述转化植物的基因组中增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒。
优选的水果和蔬菜包括马铃薯，番茄，香蕉，南瓜，豌豆和菜豆。优选的酶包括α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。优选该酶耐超高温。
i.增甜含多糖植物或植物部分该方法涉及获得如上所述表达多糖加工酶的植物，该酶可将多糖转化为糖(sugar)。相应地，该酶在植物和植物产物，如果实或蔬菜内表达。在一个实施方案中，该酶置于诱导型启动子调控之下，使得该酶的表达可以被外界刺激诱导。这样的诱导型启动子和构建体是本领域公知的并在本文描述。在植物或其产物内表达该酶可使植物或其产物内所含的多糖转化为糖并使该植物或其产物增甜。在另一实施方案中，该多糖加工酶组成型表达。这样，该植物或其产物可在足以活化该酶的条件下被活化，通过活化酶而将多糖转化为糖，使植物或植物产物增甜。这样，该果实或蔬菜中多糖到糖的自加工会产生增甜的果实或蔬菜，例如，该甜味是相对于来自不含多糖加工酶的植物的蔬菜或水果而言。本发明的水果或蔬菜获自转化植物，所述转化植物的基因组中增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒。优选的水果和蔬菜包括马铃薯，番茄，香蕉，南瓜，豌豆和菜豆。优选的酶包括α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。优选该多糖加工酶耐超高温。
i.从含有可破坏胚乳基质的酶的转化谷粒中分离淀粉本发明提供从转化谷粒中分离淀粉的方法，其中表达能够破坏胚乳基质的酶。该方法涉及获得表达酶的植物，所述酶会通过修饰例如细胞壁，非淀粉多糖和/或蛋白破坏胚乳基质。这种酶的实例包括但不限于蛋白酶，葡聚糖酶，硫氧还蛋白，硫氧还蛋白还原酶和酯酶。这样的酶不包括任何显示淀粉降解活性的酶，这样使得淀粉颗粒的完整性得以维持。优选该酶与能够将酶靶向淀粉颗粒的信号序列融合。在一个实施方案中，谷粒被加热干燥以活化所述加工酶并使谷粒内所含的内源性酶失活。热处理导致所述酶的活化，酶会作用破坏胚乳基质，然后就可将淀粉颗粒容易地与胚乳基质分离。在另一实施方案中，将谷粒在高或低的水分含量下，在低温或高温下浸泡，可以使用或不使用二氧化硫。然后加热处理该谷粒以破坏胚乳基质并允许容易地分离淀粉颗粒。另一实施方案中，创造适当的温度和含水量条件以使蛋白酶进入淀粉颗粒内并降解颗粒内所含的蛋白。这样的处理会形成高产量的淀粉颗粒，而污染蛋白很少。
k.具有高糖当量的糖浆及该糖浆制备乙醇或发酵饮料的应用该方法涉及获得如上所述表达多糖加工酶的植物，所述酶可将多糖转化为糖。在能够使表达的酶将植物或其产物内所含多糖转化为糊精，麦芽寡糖和/或糖的条件下，在水流(aqueous stream)中浸泡该植物或其产物。然后分离所述含有由多糖转化所形成的糊精，麦芽寡糖和/或糖的水流，以制备具有高糖当量的糖浆。该方法可以包括或不包括额外的湿磨植物或其产物以获得淀粉颗粒的步骤。可用于本方法的酶的实例包括但不限于，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。优选该酶耐超高温。根据该方法所形成的糖可包括但不限于，己糖，葡萄糖和果糖。可用于本方法的植物实例包括但不限于玉米，小麦或大麦。可使用的植物产物的实例包括但不限于，果实，谷粒和蔬菜。另一实施方案中，该多糖加工酶受诱导型启动子的调控。相应地，在浸泡过程前或之中，该启动子被诱导使酶表达，然后酶会将多糖转化为糖。诱导型启动子及含有该启动子的构建体的实例是本领域公知的，并在这里公开。这样，如果该多糖加工酶耐超高温，浸泡就可在高温下进行以活化该耐超高温酶并且使该植物或其产物内的内源性酶失活。另一实施方案中，能够将多糖转化为糖的耐超高温酶是组成型表达的。该酶可以不或可以通过信号序列靶向植物组分。该植物或其产物被浸泡在高温条件下以使植物内所含多糖转化为糖。
还提供了从具有高糖当量的糖浆制备乙醇或发酵饮料的方法。该方法涉及在允许糖浆内所含糖被转化为乙醇或发酵饮料的条件下，将糖浆与酵母一起培养。这种发酵饮料的实例包括但不限于，啤酒和葡萄酒。发酵条件是本领域公知的，并在美国专利US 4,929,452和本文中有描述。优选酵母为耐高醇和耐高糖菌株，如酿酒酵母(S.cerevisiae)ATCC No.20867。发酵产物或发酵饮料可被蒸馏以分离乙醇或蒸馏饮料。
l.耐超高温酶在植物细胞壁内的积累本发明提供在植物细胞壁内积累耐超高温酶的方法。该方法涉及在植物内表达耐超高温酶，所述酶与细胞壁导向信号相融合，这样被导向的酶就会在细胞壁积累。优选该酶能够将多糖转化为单糖。导向序列的实例包括但不限于，纤维素或木糖结合域。耐超高温酶的实例包括SEQ ID NO1，3，5，10，13，14，15或16所示的酶。可在从进料中回收糖的工艺中加入含有细胞壁的植物材料作为目的酶的来源，或所述植物材料可作为将来自其它来源的多糖转化为单糖的酶的来源而添加。另外，该细胞壁还可作为纯化酶的来源。纯化酶的方法是本领域公知的，包括但不限于，凝胶过滤，离子交换层析，色谱聚焦，等电点聚焦，亲合层析，FPLC，HPLC，盐沉淀，透析等。相应地，本发明还提供从植物细胞壁分离的纯化酶。
m.制备和分离加工酶的方法根据本发明，本发明重组产生的加工酶可通过如下方式制备转化含有本发明加工酶的植物组织或植物细胞，所述酶可在植物内被活化，选择被转化的植物组织或细胞，将转化植物组织或细胞培养为转化植物，并从转化植物或其部分中分离加工酶。优选该重组产生的酶是α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶。最优选该酶由选自下述任何序列的多核苷酸编码SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52或59。
下述实施例进一步描述本发明，但不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1玉米优化的耐超高温淀粉加工酶/异构化酶的基因的构建根据期望的活性谱来选择参与淀粉降解或葡萄糖异构化的各种酶，即，α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶和葡萄糖异构酶。这些活性谱包括例如环境温度下最小活性，高温活性/稳定性，和低pH下的活性。然后使用如US专利5,625,136所述的玉米偏爱密码子设计相应基因，并由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成。
根据耐超高温活性选择了具有SEQ ID NO1氨基酸序列的797GL3α-淀粉酶。推导了该酶的核酸序列并进行玉米优化，如SEQ IDNO2所示。类似地，选择具有SEQ ID NO3氨基酸序列的6gp3支链淀粉酶。推导了该酶的核酸序列并进行玉米优化，如SEQ ID NO4所示。
根据文献J.Bact.177482-485(1995)；J.Bact.1801287-1295(1998)获得了硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的malAα-葡糖苷酶氨基酸序列。根据公开的该蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO5)，设计了编码malAα-葡糖苷酶的玉米优化合成基因(SEQ ID NO6)。
选择了几种葡萄糖异构酶。根据登录号为NC_000853的已公开DNA序列预测海栖热袍菌(Thermotoga maritima))的葡萄糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID NO18)，并设计其玉米优化合成基因(SEQ IDNO19)。类似地，根据Appl.Envir.Microbiol.61(5)1867-1875(1995)公开的，登录号为L38994的DNA序列预测那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)的葡萄糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID NO20)，并设计编码那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶的玉米优化合成基因(SEQ ID NO21)。
实施例2797GL3α-淀粉酶和淀粉包封区域(starch encapsulating region)的融合物在大肠杆菌中的表达编码耐超高温797GL3α-淀粉酶和来自玉米颗粒结合淀粉合成酶(waxy)的淀粉包封区域(SER)的融合物的构建体被导入大肠杆菌中并表达。编码氨基酸序列(SEQ ID NO8)的玉米颗粒结合淀粉合成酶cDNA(SEQ ID NO7)(Klosgen RB等，1986)被克隆并作为淀粉结合域或淀粉包封区域(SER)的来源。使用根据GenBank登录号X03935设计的引物SV 57(5’AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT3’)(SEQ ID NO22)和SV 58(5’AGCTAAGCTTCAGGGCGCGGCCACGTTCT3’)(SEQ ID NO23)，从玉米种子制备的RNA进行RT-PCR扩增全长cDNA。以EcoRI/HindIII片段将全长cDNA克隆到pBluescript中，质粒命名为pNOV4022。
从pNOV4022中扩增waxy cDNA的C末端部分(由919-1818 bp编码)，包括淀粉结合域，并按阅读框架融合到全长玉米优化797GL3基因(SEQ ID NO2)的3’末端。该融合基因产物，797GL3/Waxy，具有SEQ ID NO9的核酸序列并且编码SEQ ID NO10的氨基酸序列，将其以NcoI/XbaI片段克隆入用NcoI/NheI酶切过的pET28b(NOVAGEN，Madison，WI)。此外，将797GL3基因以NcoI/XbaI片段单独克隆入pET28b载体。
pET28/797GL3和pET28/797GL3/Waxy载体被转化到BL21/DE3大肠杆菌细胞(NOVAGEN)中并根据厂商说明书培养和诱导。PAGE/考马斯染色分析显示了两种提取物中的诱导蛋白，分别相应于预测大小的融合和非融合淀粉酶。
按下述分析总细胞提取物中的耐超高温淀粉酶活性将5mg淀粉悬浮在20μl水中，然后用25μl乙醇稀释。将待测淀粉酶活性的样品或标准淀粉酶阳性对照加入混合物中，并加水到终反应体积500μl。该反应在80℃进行15-45分钟。然后冷却反应液到室温，加入500μl邻联二茴香胺和葡萄糖氧化酶/过氧化物酶混合物(Sigma)。在37℃孵育混合物30分钟。加入500μl 12N硫酸以终止反应。测量540nm下的吸光值以定量由淀粉酶/样品释放的葡萄糖数量。融合及非融合淀粉酶提取物的实验结果显示耐超高温淀粉酶活性水平类似，而对照提取物则呈阴性。这说明797GL3淀粉酶与waxy蛋白的C末端部分融合时(高温下)仍然具有活性。
实施例3分离用于在玉米中胚乳特异性表达的启动子片段使用根据GenBank登录号M81603设计的引物，从玉米基因组DNA扩增1515碱基对片段(SEQ ID NO11)的玉米(Zea mays)ADP-gpp(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)大亚基的启动子和5’非编码区I(包括第一个内含子)。ADP-gpp启动子已被证实具有胚乳特异性(Shaw和Hannah，1992)。
从质粒pGZ27.3(获自Dr.Brian Larkins)扩增673bp片段的玉米(Zea mays)γ-玉米醇溶蛋白基因启动子。该γ-玉米醇溶蛋白基因启动子已被证实具有胚乳特异性(Torrent等，1997)。
实施例4797GL3耐超高温α-淀粉酶转化载体的构建按下述构建具有各种导向信号的表达盒以在玉米胚乳内表达797GL3耐超高温α-淀粉酶pNOV6200(SEQ ID NO13)含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)与如实施例1所述合成的797GL3淀粉酶的融合物，所述信号序列用于靶向内质网并分泌到质外体内(Torrent等，1997)。该融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV6201(sEQ ID NO14)含有γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列与带有C末端额外序列SEKDEL的合成797GL3淀粉酶的融合物，所述C末端额外序列用于靶向并滞留在内质网(ER)内(Munro和Pelham，1987)。该融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV7013含有γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列与带有C末端额外序列SEKDEL的合成797GL3淀粉酶的融合物，SEKDEL序列用于靶向并滞留到内质网(ER)内。除pNOV 7103中玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO12)被用于取代玉米ADP-gpp启动子以在胚乳内表达融合产物之外，pNOV7013与pNOV6021相同。
pNOV4029(SEQIDNO15)含有waxy造粉体导向肽(Klosgen等，1986)与合成的797GL3淀粉酶的融合物，用于靶向造粉体。该融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4031(SEQ ID NO16)含有waxy造粉体导向肽与合成的797GL3/waxy融合蛋白的融合物，用于靶向淀粉颗粒。该融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子后，用于在胚乳内特异性表达。
通过将这些融合物克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后制备其它的构建体以使得酶更高水平表达。所有表达盒都转移到二元载体内用于通过农杆菌(Agrobacterium)感染转化玉米。含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因的二元载体可以允许用甘露糖筛选转基因细胞。转化的玉米植物进行自体受粉或者异型杂交，收集种子用于分析。
以与用于上述α-淀粉酶完全相同的方式，通过上述导向信号序列与6gp3支链淀粉酶或340g12α-葡糖苷酶的融合，制备其它构建体。这些融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子和/或γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，并如上所述转化到玉米中。转化的玉米植物进行自体受粉或者异型杂交，收集种子用于分析。
可通过杂交表达单个酶的植物，或通过将几种表达盒克隆到相同的二元载体内进行共转化而获得酶的组合。
实施例56GP3耐高温支链淀粉酶的植物转化载体的构建按下述构建表达盒以在玉米胚乳的内质网中表达6GP3耐高温支链淀粉酶。
pNOV7005(SEQ ID NO24和25)含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列与带有C末端额外序列SEKDEL的合成6GP3支链淀粉酶的融合物，靶向并滞留到ER内。使用引物进行PCR将氨基酸肽SEKDEL与该酶的C末端融合，引物的设计使得合成基因可以扩增并同时在该蛋白的C末端加入6个氨基酸。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
实施例6malA耐超高温α-葡糖苷酶的植物转化载体的构建按下述构建带有各种导向信号的表达盒以在玉米胚乳内表达硫磺矿硫化叶菌malA耐超高温α-葡糖苷酶。
pNOV4831(SEQ ID NO26)含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)与带有C末端额外序列SEKDEL的合成malAα-葡糖苷酶的融合物，用于靶向并滞留到内质网内(Munro和Pelham，1987)。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4839(SEQ ID NO27)中含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)与合成的malAα-葡糖苷酶的融合物，使得靶向内质网并分泌到质外体内(Torrent等，1997)。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4837中含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)与带有C末端额外序列SEKDEL的合成malAα-葡糖苷酶的融合物，使得靶向并滞留到ER内。该融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。该克隆的氨基酸序列与pNOV4831(SEQ ID NO26)的相同。
实施例7耐超高温的海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶的植物转化载体的构建按下述构建带有各种导向信号的表达盒以在玉米胚乳内表达海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌耐超高温葡萄糖异构酶。
pNOV4832(SEQ ID NO28)中含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)，此信号序列与带有C末端额外序列SEKDEL的合成海栖热袍菌葡萄糖异构酶融合，使得靶向并滞留到ER内。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4833(SEQ ID NO29)中将含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)，此信号序列与带有C末端额外序列SEKDEL的合成那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶融合，使得靶向并滞留到ER内。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4840(SEQ ID NO30)中含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)，此信号序列与合成的那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶融合，使得靶向ER并分泌到质外体内(Torrent等，1997)。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4838含有γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)，此信号序列与带有C末端额外序列SEKDEL的合成那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶融合，使得靶向并滞留到ER内。该融合产物被克隆到玉米ADP-gpp启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。该克隆的氨基酸序列与pNOV4833(SEQ ID NO29)的相同。
实施例8用于表达耐超高温葡聚糖酶EglA的植物转化载体的构建pNOV4800(SEQ ID NO58)含有大麦α-淀粉酶AMY32b信号序列(MGKNGNLCCFSLLLLLLAGLASGHQ)(SEQ ID NO31)与EglA成熟蛋白序列的融合物，用于定位到质外体。该融合产物被克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
实施例9用于表达多种耐超高温酶的植物转化载体的构建pNOV4841含有双基因构建体，797GL3α-淀粉酶融合物和6GP3支链淀粉酶融合物。797GL3融合物(SEQ ID NO33)和6GP3融合物(SEQ ID NO34)都具备玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列和SEKDEL序列用于靶向并滞留在ER内。每个融合物分别克隆到分开的γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4842含有双基因构建体，797GL3α-淀粉酶融合物和malAα-葡糖苷酶融合物。797GL3融合多肽(SEQ ID NO35)和malAα-葡糖苷酶融合多肽(SEQ ID NO36)都具备玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列和SEKDEL序列用于靶向并滞留在ER内。每个融合多肽分别克隆到分开的γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。
pNOV4843含有双基因构建体，797GL3α-淀粉酶融合物和malAα-葡糖苷酶融合物。797GL3融合多肽和malAα-葡糖苷酶融合多肽都具备玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列和SEKDEL序列用于靶向并滞留在ER内。797GL3融合多肽被克隆到γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，而malA融合多肽被克隆到玉米ADP-gpp启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。797GL3融合物和malA融合物的氨基酸序列与pNOV4842的(分别为SEQ ID NO35和36)相同。
pNOV4844含有三基因构建体，797GL3α-淀粉酶融合物，6GP3支链淀粉酶融合物和malAα-葡糖苷酶融合物。797GL3，malA和6GP3都具备玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列和SEKDEL序列用于靶向并滞留在ER内。797GL3和malA融合物被克隆到两个分开的玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后，而6GP3融合物被克隆到玉米ADP-gpp启动子之后，用于在胚乳内特异性表达。797GL3和malA融合物的氨基酸序列与pNOV4842的(分别为SEQ ID NO35和36)相同。6GP3融合物的氨基酸序列与pNOV4841中的6GP3融合物的(SEQ ID NO34)相同。
所有的表达盒都被转移到二元载体pNOV2117中用于通过农杆菌感染转化玉米。pNOV2117含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，允许使用甘露糖筛选转基因细胞。pNOV2117是带有pVS1和ColE1复制起点的二元载体。该载体含有来自pAD1289的组成型VirG基因(Hansen，G.等，PNAS USA 917603-7607(1994))和来自Tn7的放线壮观素抗性基因。克隆到左和右边界之间多接头内的是玉米泛素启动子，PMI编码序列和pNOV117的胭脂碱合酶终止子(Negrotto，D等，Plant Cell Reports 19798-803(2000))。转化的玉米植物可以自体受粉或异型杂交并收集种子用于分析。可通过杂交表达单个酶的植物，或通过用一种多元基因表达盒转化植物，而获得不同酶的组合。
实施例10细菌和毕赤氏酵母(Pichia)表达载体的构建按下述构建表达盒用于在毕赤氏酵母或细菌内表达耐超高温α-葡糖苷酶和葡萄糖异构酶pNOV4829(SEQ ID NO37和38)含有在细菌表达载体pET29a内的合成海栖热袍菌葡萄糖异构酶与ER滞留信号的融合物。该葡萄糖异构酶融合基因被克隆到pET29a的NcoI和SacI位点中，这样就加入了蛋白纯化所需的N末端S标签。
pNOV4830(SEQ ID NO39和40)含有在细菌表达载体pET29a内的合成那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶与ER滞留信号的融合物。该葡萄糖异构酶融合基因被克隆到pET29a的NcoI和SacI位点中，这样就加入了蛋白纯化所需的N末端S标签。
pNOV4835(SEQ ID NO41和42)含有合成的海栖热袍菌葡萄糖异构酶基因，该基因被克隆到细菌表达载体pET28C的BamHI和EcoRI位点中。这样就使His标签(纯化蛋白所需)与葡萄糖异构酶的N末端融合。
pNOV4836(SEQ ID NO43和44)含有合成的那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶基因，该基因被克隆到细菌表达载体pET28C的BamHI和EcoRI位点中。这样就使His标签(纯化蛋白所需)与葡萄糖异构酶的N末端融合。
实施例11基本上如Negrotto等，Plant Cell Reports 19798-803所述，进行未成熟玉米胚的转化。对于本实施例，所有的培养基组分如上述引文中Negrotto等人所述，但是，此文献中描述的各培养基组分是可以被代替的。
A.转化质粒和可选择标记将转化所用的基因克隆到适于转化玉米的载体内。该实施例中所用的载体含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，以筛选转基因系(Negrotto等，(2000)Plant Cell Reports 19798-803)。
B.制备根癌农杆菌在YEP(酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L)，NaCl(5g/L)，15g/l琼脂，pH6.8)固体培养基上28℃下培养含有植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)2-4天。然后将大约0.8×109农杆菌悬浮到补充有100μM As(Negrotto等，(2000)Plant Cell Rep 19798-803)的LS-inf培养基内。在该培养基内预诱导细菌30-60分钟。
C.接种从8-12天龄的玉米穗上剪切下来自A188或其它适当基因型的未成熟胚放入液体LS-inf+100μM As中。用新鲜感染培养基漂洗一次胚。然后加入土壤杆菌溶液，漩涡器上震荡胚30秒，并与细菌静置5分钟。然后将该胚保持盾片面向上的方向转移到LSAs培养基内，黑暗培养2-3天。然后，从每个培养皿中将20-25个胚转移到补充有氨噻肟头孢霉素(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中并在28℃暗处培养10天。
D.选择转化细胞并再生转化植物将形成胚胎发生愈伤组织的未成熟胚转移到LSD1M0.5S培养基中。用6周时间在该培养基上筛选培养物，在第3周时进行传代培养步骤。将存活的愈伤组织转移到补充有甘露糖的Reg1培养基内。在光亮下培养(16小时光/8小时暗)后，再将绿色组织转移到不含生长调节剂的Reg2培养基内并孵育1-2周。将小植物(plantlet)转移到含有Reg3培养基的Magenta GA-7盒子(Magenta Corp，Chicago Ill)内并在光亮下生长。2-3周后，PCR检测植物是否存在PMI基因和其它目的基因。PCR测试的阳性植物被转移到温室中。
实施例12分析表达导向质外体或ER的α-淀粉酶的玉米植物的T1种子获得了用实施例4所述pNOV6200或pNOV6201转化的自体授粉玉米植物的T1种子。在暴露到高温下之前，根据目视检查和碘溶液对淀粉进行的正常染色，这些玉米粒内淀粉的积累呈现正常状态。解剖未成熟的玉米粒，将纯化的胚乳单独置于微量离心管内并浸泡在200μl 50mM NaPO4缓冲液内。将该管置于85℃水浴20分钟，然后冰上冷却。向各管中加入20微升1％碘溶液并混合。大约25％的分离的玉米粒显示出正常的淀粉染色。剩余的75％未能染色，说明淀粉已被降解为不能被碘染色的低分子量糖。发现pNOV6200或pNOV6201的T1玉米粒能够自身水解玉米淀粉。在37℃孵育后检测不到淀粉减少。
通过从胚乳中分离耐超高温蛋白组分再经过PAGE/考马斯染色来进一步分析淀粉酶的表达。观察到了适当分子量(50kD)的分离蛋白带。使用市售着色直链淀粉(AMYLAZYME，来自Megazyme，Ireland)对这些样品进行α-淀粉酶测试试验。高水平的耐超高温淀粉酶活性与此50kD蛋白的存在相关。
进一步发现来自多数表达耐超高温α-淀粉酶(所述酶被导向造粉体)的转基因玉米的玉米粒淀粉在环境温度下足够活跃，如果该酶被允许直接与淀粉颗粒相接触，那么可以水解多数淀粉。具有耐超高温α-淀粉酶(所述酶被导向造粉体)的80个品系中，4个被鉴定能够在玉米粒内积累淀粉。使用比色amylazyme试验分析这些品系中的3个品系的热稳定性α-淀粉酶活性。淀粉酶试验说明这3个品系中热稳定性淀粉酶活性水平很低。当在适当的含水量(moisture)和加热条件下处理从这3个品系中纯化的淀粉时，淀粉被水解，这说明存在足够水平的α-淀粉酶以促进从这些品系制备的淀粉的自身水解。
获得了来自pNOV6200或pNOV6201转化体的多个独立品系的T1种子。解剖各品系的单个玉米粒，分别在300μl 50mM NaPO4缓冲液中单独匀浆各纯化的胚乳。分析胚乳悬浮液试样在85℃下的α-淀粉酶活性。大约80％的品系发生耐超高温活性的分离(参见图1A，1B和2)。
在100℃加热来自野生型植物或pNOV6201转化植物的玉米粒1，2，3或6小时然后用碘溶液进行淀粉染色。3或6小时后，分别在成熟玉米粒内检测到极少量淀粉或检测不到淀粉。这样，当在高温孵育时，如下转基因玉米成熟玉米粒内的淀粉被水解，所述转基因玉米表达耐超高温淀粉酶，该酶被导向内质网。
另一实验中，pNOV6201植物的成熟T1玉米粒被浸泡在50℃下16小时，来自所述玉米粒的部分纯化的淀粉在85℃加热5分钟后被水解。这说明玉米粒研磨后，靶向内质网的α-淀粉酶与淀粉结合并能够在加热后水解淀粉。碘染色说明在50℃浸泡16小时后在成熟种子内淀粉仍维持完整。
另一实验中，从pNOV6201转化植物分离的成熟玉米粒在95℃加热16小时，然后干燥。在表达耐超高温α-淀粉酶的种子内，淀粉水解为糖导致干燥后产生皱褶外观。
实施例13分析表达导向造粉体的α-淀粉酶的玉米植物的T1种子获得了用实施例4所述pNOV4029或pNOV4031转化的自体受粉玉米植物的T1种子。在这些品系的玉米粒内淀粉积累明显地不正常。虽然严重程度不同，但所有的品系都分离出极低的淀粉表型，或不存在淀粉表型。在暴露到高温之前，碘对纯化自未成熟玉米粒的胚乳仅有微弱的染色。85℃下20分钟后，不出现染色作用。当玉米穗被干燥，玉米粒皱缩。如果允许与淀粉颗粒直接接触，这种淀粉酶明显地在温室温度下具有足够的活性来水解淀粉。
实施例14发酵表达α-淀粉酶的玉米植物的谷粒100％转基因谷粒，85℃对95℃，不同的液化时间含有热稳定性α-淀粉酶的转基因玉米(pNOV6201)在不添加外源α-淀粉酶的发酵中表现良好，液化所需的时间大为缩短，并使淀粉的溶解更彻底。用下述步骤进行实验室发酵(下文详述)1)研磨，2)含水量(moisture)分析，3)制备含研磨后的玉米，水，backset和α-淀粉酶的浆液，4)液化和5)同时糖化和发酵(SSF)。该实施例中，液化步骤的温度和时间如下所述变化。另外，转基因玉米用或不用外源α-淀粉酶液化，并将乙醇产生性能与用市售α-淀粉酶处理过的对照玉米相对比。
使用含有α-淀粉酶基因和PMI可选择标记的载体，即pNOV6201，根据实施例4所述方法制备本实施例所用的转基因玉米。将表达高水平热稳定性α-淀粉酶的转基因品系的花粉授粉给市售杂种(N3030BT)，获得转基因玉米。将玉米干燥到11％含水量并室温下保藏。该转基因玉米粉的α-淀粉酶含量为95单位/g，而1单位酶可在85℃，pH6.0 MES缓冲液中每分钟从玉米面粉产生1微摩尔还原性末端。所用的对照玉米是已知乙醇产生性能良好的黄色马齿形玉米。
1)研磨在配备有2.0mm筛的Perten 3100锤式粉碎机内研磨转基因玉米(1180g)，这样产生转基因玉米粉。彻底清洗后，在相同的粉碎机内研磨对照玉米，以免被转基因玉米污染。
2)含水量分析将转基因和对照玉米样品(20g)在铝秤盘(weighboat)内称重，100℃加热4小时。再次称重，从重量损失计算含水量。转基因面粉的含水量为9.26％，对照面粉为12.54％。
3)制备浆液设计浆液的组成以便在SSF开始时形成带有36％固体的浆状物。对照样品在100ml塑料瓶中制备并含有21.50g对照玉米面粉，23ml去离子水，6.0ml backset(8％重量的固体)，和0.30ml用水稀释50倍的市售α-淀粉酶。选择该α-淀粉酶剂量以代表工业应用。当在上述转基因α-淀粉酶试验的条件下进行实验时，对照α-淀粉酶的剂量为2U/g玉米粉。加入氢氧化铵调整pH为6.0。以同样的方式制备转基因样品，但是含有20g玉米面粉，因为转基因玉米面粉的含水量较低。用与对照样品同样剂量的α-淀粉酶或者不用外源α-淀粉酶制备转基因面粉浆液。
4)液化含有转基因玉米面粉浆液的瓶子浸泡到85℃或95℃水浴内5，15，30，45或60分钟。在85℃孵育对照浆液60分钟。高温孵育过程中，每5分钟就用手剧烈混合浆液一次。高温步骤后冰上冷却浆液。
5)同时糖化和发酵液化形成的浆状物与葡糖淀粉酶(0.65ml1/50稀释的市售L-400葡糖淀粉酶)，蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％UreaLiquor)混合。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2排出通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48小时时设为82F。
通过制备含有酵母(0.12g)和70克麦芽糖糊精，230ml水，100mlbackset，葡糖淀粉酶(0.88ml 10倍稀释的市售葡糖淀粉酶)，蛋白酶(1.76ml 100倍稀释的市售酶)，尿素(1.07克)，青霉素(0.67mg)和硫酸锌(0.13g)的混合物，使用于接种的酵母增殖。在需要该繁殖培养物之前的那天开始制备并在90°F混合下孵育繁殖培养物。
24，48和72小时时，从各发酵罐中取出样品，0.2μm滤器过滤并HPLC分析乙醇和糖。分析72小时的样品中总共溶解的固体和残留淀粉。
HPCL分析在配有折光率检测器，柱加热器和Bio-Rad AminexHPX-87H柱的二元梯度系统内进行。用0.005M H2SO4的水溶液以1ml/min的速度平衡该系统。柱温度为50℃。样品加样体积为5μl；洗脱使用相同的溶剂。通过注射已知的标准物来校准RI反应。测量备注射样品内的乙醇和葡萄糖。
残留淀粉按下述测定。在50℃烤箱内干燥样品和标准物，然后在样品粉碎机内研磨成粉末。将粉末(0.2g)称量到15ml有刻度的离心管内。用10ml含水乙醇(80％v/v)通过在涡旋之后离心并去除上清来洗粉末3次。将DMSO(2.0ml)加入到沉淀内，再加入3.0ml在MOPS缓冲液内的热稳定性α-淀粉酶(300单位)。剧烈混合后，85℃水浴中孵育该管60分钟。孵育过程中，对管进行4次混合。冷却样品并加入4.0ml醋酸钠缓冲液(200mM，pH4.5)，再加入0.1ml葡糖淀粉酶(20U)。50℃孵育样品2小时，混合，然后3500rpm离心5分钟。0.2μM滤器过滤上清并按如上所述HPLC方法分析上清中的葡萄糖。使用50μl注射量作为具有低剩余淀粉的(＜20％固体)样品的加样量。
结果转基因玉米在不加入α-淀粉酶的发酵中表现良好。72小时的乙醇产量在加入或不加入外源α-淀粉酶时基本相同，如表1所示。这些数据也表明当液化温度更高时，会获得更大的乙醇产量；相对于其它商业所用的酶如液化芽孢杆菌(Bacillus liquefaciens)α-淀粉酶而言，在转基因玉米内表达的本发明酶在更高温度时具有活性。
表1
当液化时间改变时，发现有效生产乙醇所需的液化时间比常规方法所需的缩短很多。图3显示从15分钟到60分钟的液化几乎不改变72小时发酵的乙醇产量。另外95℃液化比85℃液化在每一个时间点上都导致乙醇量更多。这些结果说明使用耐超高温酶改善了该过程。
对照玉米比转基因玉米的乙醇终产量高，但是之所以选择对照是由于其发酵表现非常优秀。相反，转基因玉米具有经选择以利于转化的遗传背景。通过公知的育种技术将此α-淀粉酶性状导入原种(elite)玉米种质应当可以消除此差异。
检测72小时产生的啤酒的残留淀粉水平(图4)显示，转基因α-淀粉酶使发酵可利用的淀粉的量显著提高；发酵后残留的淀粉量减少许多。
使用乙醇水平和残留淀粉水平，最适液化时间为95℃15分钟和85℃30分钟。该实验中这些时间是发酵罐水浴的总共时间，这样就包括了样品温度从室温升至85℃或95℃所用的时间。更短的液化时间可能对大规模工业过程最佳，工业过程中可通过使用蒸汽加压锅等设备快速加热浆状物。常规工业液化过程需要收集槽从而使浆状物在高温下孵育1或多个小时。本发明避免了对这种收集槽的需要，并提高液化设备的生产力。
发酵过程中α-淀粉酶的一个重要功能是减少浆状物的粘性。在各个时间点，含有转基因玉米粉的样品的粘性明显小于对照样品。另外转基因样品似乎不经过在所有对照样品中均会出现的凝胶状期；凝胶化通常在玉米浆被加热加工时出现。因此，使胚乳碎块内遍布α-淀粉酶会在加热加工过程中通过防止形成大的凝胶(所述凝胶会使扩散变缓并加大混合和泵出浆状物所需的能量投入)给浆状物带来有益的物理特性。
转基因玉米内的高剂量α-淀粉酶还可以增加转基因浆状物的有利特性。在85℃，转基因玉米的α-淀粉酶活性比对照所用外源α-淀粉酶剂量的活性高出许多倍。后者被选作为商用等级的代表。
实施例15当与对照玉米混合时转基因玉米的有效作用以5％-100％转基因玉米面粉的不同水平将转基因玉米面粉与对照玉米面粉混合。如实施例14所述处理。含有转基因表达的α-淀粉酶的浆状物在85℃液化30分钟或95℃液化15分钟；对照浆状物如实施例14所述制备，并在85℃液化30分钟或60分钟(每样一个)或95℃液化15或60分钟(每样一个)。
48和72小时的乙醇产量和剩余淀粉的数据如表2所示。48小时的乙醇水平如图5所示；剩余淀粉的测量值如图6所示。这些数据显示当转基因谷物仅占浆状物中总谷物的一小部分时(低至5％)，转基因表达的热稳定性α-淀粉酶在乙醇生产方面仍表现非常良好。数据还显示当总谷物内含有至少40％转基因谷粒时，剩余淀粉明显低于对照浆合物。
表2
*对照样品。均为2次测定的平均值。
实施例16在总玉米中使用1.5-12％的转基因玉米时乙醇产量随液化pH的改变由于转基因玉米以总玉米5-10％的比例在发酵中表现良好，接下来进行另外一系列发酵，该发酵中总玉米含有1.5-12％的转基因玉米。pH在6.4-5.2范围内变化，转基因玉米内表达的α-淀粉酶的活性的最适pH低于工业上常规所用的pH。
该实验按实施例15所述进行，除下述例外1)转基因玉米面粉按总干重1.5％-12.0％的水平与对照玉米面粉混合。
2)对照玉米为N3030BT，其比实施例14和15所用对照更加接近转基因玉米。
3)含有转基因粉的样品内不加入外源性α-淀粉酶。
4)液化前将样品pH调整到5.2，5.6，6.0或6.4。每种pH均制备了至少5种样品，涵盖了0％转基因玉米粉-12％转基因玉米粉的范围。
5)所有样品均在85℃液化60分钟。
作为发酵时间的函数，乙醇含量的改变如图7所示。该图显示从含有3％转基因玉米的样品所获的数据。在较低pH下的发酵比pH6.0或更高pH时进行得快。在具有其它剂量转基因玉米的样品内也观察到了类似的行为。与高水平的表达相结合的转基因酶活性pH曲线可以允许在较低pH下液化，导致发酵更快速，这样比常规pH6.0下的发酵过程导致生产能力更高。
72小时乙醇产量如图8所示。可以看出，根据乙醇产量，这些结果显示对样品内所含的转基因谷物数量几乎没有依赖性。因此，该谷物含有丰富的淀粉酶来促进发酵生产乙醇。还说明较低pH的液化能够获得更高乙醇产量。
监测液化后样品的粘性，发现pH6.0时，6％的转基因谷物足以充分降低粘性。pH5.2和5.6时，粘性等于12％转基因谷物的对照的粘性，但是对于转基因谷物百分比更低的情况却不是如此。
实施例17使用耐高温酶从玉米粉生产果糖已证实，表达耐超高温α-淀粉酶797GL3的玉米，当与α-葡糖苷酶(MalA)和木糖异构酶(XylA)混合时，可促进果糖生产。
将表达797GL3的pNOV6201转基因植物的种子在Kleco槽内磨成面粉，这样形成了淀粉酶面粉。以同样的方式研磨非转基因玉米谷粒获得对照面粉。
在大肠杆菌中表达α-葡糖苷酶，MalA(来自硫磺矿硫化叶菌)。将收获的细菌悬浮在50mM pH7.0的含有1mM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的磷酸钾缓冲液内，然后在French细胞压碎器内裂解。4℃下23000xg离心裂解液15分钟。取出上清，加热到70℃维持10分钟，冰上冷却10分钟，然后4℃下34000xg离心30分钟。取出上清，在centricon10装置中将MalA浓缩2倍。保留centricon 10步骤的滤液以作为MalA的阴性对照。
在大肠杆菌中表达那不勒斯栖热袍菌的xylA基因，制备木糖(葡萄糖)异构酶。将细菌悬浮在pH7.0的100mM磷酸钠中并通过French细胞压碎器使其裂解。沉淀细胞碎片后，将提取物加热到80℃10分钟然后离心。上清液中含有XylA酶活性。与XylA提取物平行制备空载体的对照提取物。
将玉米粉(60mg每份样品)与缓冲液及来自大肠杆菌的提取物混合。如表3所示，样品含有淀粉酶玉米面粉(淀粉酶)或对照玉米面粉(对照)，50μl MalA提取物(+)或滤液(-)，以及20μl XylA提取物(+)或空载体对照(-)。所有的样品都含有230μl 50mM MOPS，10mM MgSO4，和1mM CoCl2；室温下缓冲液pH为7.0。
在85℃孵育样品18小时。孵育期末，用0.9ml 85℃水稀释样品，并离心去除未溶材料。然后通过Centricon3超滤装置过滤上清级分，并HPLC分析和ELSD检测。
用Astec Polymer Amin柱，5微米粒度，250×4.6mm，和AlltechELSD 2000检测器装配梯度HPLC系统。用15∶85的水∶乙腈混合物预先平衡该系统。流速为1ml/min。注射上样后维持起始条件5分钟，然后20分钟梯度达到50∶50的水∶乙腈，再用相同溶剂运行10分钟。用80∶20的水∶乙腈洗该系统20分钟，然后用起始溶剂再平衡。在5.8min洗脱果糖，8.7分钟洗脱葡萄糖。
表3
HPLC结果还说明在含有α-淀粉酶的所有样品中都存在更多的麦芽寡糖。这些结果说明三种耐高温酶能够在高温下共同作用以从玉米面粉生产果糖。
实施例18带有异构酶的淀粉酶面粉另一实施例中，将淀粉酶面粉与纯化的MalA和两种细菌木糖异构酶——海栖热袍菌的XylA和获自Diversa的被称为BD8037的酶之一混合。淀粉酶面粉如实施例18所述制备。
带有6His纯化标签的硫磺矿硫化叶菌MalA在大肠杆菌内表达。如实施例18所述制备细胞裂解液，然后使用镍亲合树脂(Probond，Invitrogen)根据厂商说明书对天然蛋白的纯化说明，纯化至均匀外观。
带有S标签和ER滞留信号的海栖热袍菌XylA在大肠杆菌内表达并以与实施例18所述的那不勒斯栖热袍菌XylA同样的方式制备。
获得的木糖异构酶BD8037为冻干粉末，将其重悬浮在0.4x初始体积的水中。
将淀粉酶玉米粉与酶溶液和水或缓冲液混合。所有的反应都含有60mg淀粉酶面粉和总共600μl的液体。一组反应用加入了10mMMgSO4，1mM CoCl2的50mM室温下pH7.0的MOPS作为缓冲液；第二组反应用水代替含金属的缓冲液。异构酶的量如表4所示有所变化。所有反应均在90℃孵育2小时。离心制备反应上清液。用额外600μl水洗涤沉淀并再离心。将各反应的上清液级分合并，Centrico 10过滤，如实施例17所述，用具有ELSD检测的HPLC分析。观察到的葡萄糖和果糖量如图15所示。
表4
对于各异构酶而言，当反应中存在α-淀粉酶和α-葡糖苷酶时，从玉米面粉以剂量依赖性的方式生成果糖。这些结果说明，加入或不加入金属离子时，表达淀粉酶797GL3的谷物都能够与MalA和各种不同耐高温异构酶一起作用，以在高温下从玉米粉生成果糖。当加入二价金属离子时，异构酶可以在90℃实现预期的大约55％果糖的果糖葡萄糖平衡。这对于使用耐中温异构酶的现有方法而言是个改进，因为现有技术需要层析分离以提高果糖浓度。
实施例19在玉米内表达支链淀粉酶对于pNOV7013或pNOV7005纯合的转基因植物进行杂交以产生共同表达797GL3α-淀粉酶和6GP3支链淀粉酶的转基因玉米种子。
获得了pNOV7005或pNOV4093转化的自体受粉玉米植物的T1或T2种子。pNOV4093是玉米优化合成6GP3基因(SEQ ID NO3，4)与用于将融合蛋白定位于造粉体的造粉体导向序列(SEQ ID NO7，8)的融合蛋白。该融合蛋白处于ADPgpp启动子(SEQ ID NO11)的调控下用于在胚乳内特异性表达。pNOV7005构建体将支链淀粉酶的表达靶向胚乳内质网。该酶在ER的定位使得淀粉可在玉米粒内正常积累。还观察到高温处理前碘溶液对淀粉的正常染色。
如同α-淀粉酶的情况，靶向造粉体的支链淀粉酶(pNOV4093)的表达引起玉米粒内淀粉的异常积累。当玉米穗被干燥时，玉米粒发生了皱缩。显然，该耐高温支链淀粉酶在低温下具有足够的活性，并且如果与种子胚乳内的淀粉颗粒直接接触，能够水解淀粉。
从玉米面粉制备酶或酶提取物在Kleco粉碎机上研磨转基因种子，再将粉末置于50mM NaOAc pH5.5的缓冲液内室温孵育1小时，其间不断震荡，从中提取支链淀粉酶。然后14000rpm离心孵育的混合物15分钟。上清作为酶的来源。
支链淀粉酶实验该实验反应在96孔板上进行。从玉米粉中提取的支链淀粉酶(100μl)用900μl含有40mM CaCl2的50mM pH5.5NaOAc缓冲液稀释10倍。涡旋该混合物，将一片Limit-Dextrizyme(天青蛋白交联支链淀粉，来自Megazyme)加入各反应混合物并75℃孵育30分钟(或者如提及的)。孵育期末，3500rpm离心反应混合物15分钟。上清稀释5倍并转移到96孔平底板上测定590nm吸光值。支链淀粉酶对天青蛋白交联支链淀粉的水解形成了水溶性染色片段，其释放速率(测定为590nm吸光值的提高)与酶活性直接相关。
图9显示来自pNOV7005转化的不同事件的T2种子的分析。可在许多事件中检测到支链淀粉酶活性的表达高于非转基因对照。
向测定量(～100μg)的来自转基因(表达支链淀粉酶，淀粉酶或这两种酶)和/或对照(非转基因)的干玉米粉中加入1000μl含有40mM CaCl2的50mM pH5.5 NaOAc缓冲液。反应混合物涡旋震荡并摇床孵育1小时。如图所示，将孵育混合物转移到高温(75℃，支链淀粉酶的最适反应温度或如图所示)下开始酶反应一段时间。冰上冷却以终止反应。然后14000rpm离心反应混合物10分钟。将上清的等分试样(100μl)稀释3倍，0.2微米滤器过滤用于HPLC分析。
使用下述条件进行样品的HPLC分析柱Alltech Prevail Carbohydrate ES 5微米250×4.6mm检测器Alltech ELSD 2000泵Gilson 322注射器Gilson 215注射器/稀释器溶剂HPLC级乙腈(Fisher Scientific)和水(由Waters MilliporeSystem纯化)低聚合度(DP1-15)的寡糖所用梯度时间 ％水％乙腈015 85515 8525 50 5035 50 5036 80 2055 80 2056 15 8576 15 85高聚合度(DP20-100及以上)的糖所用梯度时间 ％水％乙腈035 6560 85 1570 85 1585 35 65100 35 65数据分析所用系统Gilson Unipoint软件系统版本3.2图10A和10B显示由表达的支链淀粉酶作用转基因玉米粉淀粉所形成的水解产物的HPLC分析。将表达支链淀粉酶的玉米粉在反应缓冲液内75℃孵育30分钟，导致从玉米淀粉形成中等链长寡糖(DP～10-30)和短直链淀粉链(DP～100-200)。该图还显示支链淀粉酶的活性对钙离子有依赖性。
表达支链淀粉酶的转基因玉米可以用于生产脱支(α1-6键的断裂)的修饰淀粉/或糊精，从而使得直链淀粉/直链糊精具有高水平。此外，根据所用淀粉种类(如蜡样，高直链淀粉等)不同，由支链淀粉酶形成的直链淀粉/糊精的链长分布也会不同，这样修饰淀粉/糊精的特性也不相同。
还使用支链淀粉作为底物说明α1-6键的水解。该分离自玉米粉的支链淀粉酶有效地水解支链淀粉。孵育后形成的产物的HPLC分析(如述)表明，正如所期望的，由于酶水解了支链淀粉分子内的α1-6连接从玉米形成了麦芽三糖。
实施例20在玉米内表达支链淀粉酶从玉米粉中提取然后通过PAGE和考马斯染色，进一步分析6gp3支链淀粉酶的表达。在Kleco粉碎机内研磨种子30秒获得玉米面粉。用50mM pH5.5 NaOAc缓冲液从大约150mg面粉提取酶。混合物涡旋震荡并室温下摇床孵育1小时，然后在70℃再孵育15分钟。离心反应混合物(室温14000rpm 15分钟)并将上清用于SDS-PAGE分析。观察到了适当分子量(95kDal)的蛋白带。使用市售染料缀合的极限糊精(LIMIT-DEXTRIZYME，来自Megazyme，Ireland)对样品进行支链淀粉酶实验。耐高温支链淀粉酶活性的高水平与95kD蛋白的存在相关。
转基因玉米种子的Western印迹和ELISA分析也表明了～95kD蛋白的表达，该蛋白与制备的抗支链淀粉酶的抗体(大肠杆菌内表达)反应。
实施例21加入支链淀粉酶表达玉米提高淀粉水解速度并改善短链(可发酵)寡糖的产量图11A和11B所示数据来自来自如上所述两种反应混合物的淀粉水解产物的HPLC分析。第一种反应标为“淀粉酶”，其含有按实施例4所述方法制备的α-淀粉酶表达转基因玉米与例如非转基因玉米A188的玉米面粉样品混合物[1∶1(w/w)]；第二种反应混合物为“淀粉酶+支链淀粉酶”，其含有α-淀粉酶表达转基因玉米和按实施例19所述方法制备的支链淀粉酶表达转基因玉米的玉米面粉样品混合物[1∶1(w/w)]。所获的结果支持了支链淀粉酶与α-淀粉酶联合使用于淀粉水解过程的有益效果。这些有益效果来自淀粉水解速度的提高(图11A)和可发酵低DP寡糖产量的提高(图11B)。
发现在玉米内表达的α-淀粉酶单独或与支链淀粉酶一起(或任何其它淀粉水解酶的组合)可用于制备麦芽糖糊精(直链或支链寡糖)(图11A，11B，12和13A)。根据不同的反应条件、水解酶的类型及其组合和所用淀粉的类型，所形成的麦芽糖糊精的组成及由此其特性也有所变化。
图12描述了以和图11描述类似的方式进行的实验的结果。图内标出了孵育反应中采取的不同的温度和时间方案。支链淀粉酶的最适反应温度为75℃，而α-淀粉酶为＞95℃。这样，按照所示方案可以提供支链淀粉酶和/或α-淀粉酶分别在其最适反应温度下进行催化的范围。从这些结果很明显地推导出α-淀粉酶与支链淀粉酶的组合在60分钟孵育期末对玉米淀粉水解得更好。
如上所述(除了在这些反应中使用～150mg玉米粉)，在孵育30分钟末对两组反应混合物的淀粉水解产物进行HPLC分析，结果如图13A和13B。第一组反应在85℃下孵育而第二组在95℃下孵育。每组都有两种反应混合物；第一种被称为“淀粉酶X支链淀粉酶”，其含有表达α-淀粉酶和支链淀粉酶的转基因玉米(异花授粉形成)的玉米粉，而第二种反应被称为“淀粉酶”混合物，由表达α-淀粉酶的转基因玉米和非转基因玉米A188的玉米面粉样品以一定比例混合形成，所述比例使其可获得与杂种(淀粉酶X支链淀粉酶)中观察到的α-淀粉酶活性相同量的活性。当在85℃下孵育玉米面粉样品时，α-淀粉酶和支链淀粉酶杂交情况下低DP寡糖的总产量高于仅表达α-淀粉酶的玉米。95℃下孵育会(至少部分地)失活支链淀粉酶，从而在“淀粉酶X支链淀粉酶”和“淀粉酶”之间几乎观察不到差异。但是，当使用淀粉酶和支链淀粉酶杂交玉米粉时，在孵育期末，这两种孵育温度下的数据都显示出葡萄糖产量比使用仅表达α-淀粉酶的玉米的产量有显著提高(图13B)。这样，在将淀粉完全水解为葡萄糖具重要性的情况下，使用同时表达α-淀粉酶和支链淀粉酶的玉米会尤其有益。
上述实施例提供了足够的证据支持当联合使用α-淀粉酶时在玉米种子中表达的支链淀粉酶会改进淀粉水解过程。α1-6键特异性的支链淀粉酶活性比α-淀粉酶(α1-4键特异性)能远为有效地使淀粉脱支，从而减少支链寡糖(如极限糊精，潘糖，这些通常是不可发酵的)的数量并提高直链短寡糖(容易发酵为乙醇等)的量。第二，由支链淀粉酶催化脱支而造成的淀粉分子片断化会提高α-淀粉酶与底物的可接近性从而提高α-淀粉酶催化反应的效率。
实施例22为确定797GL3α-淀粉酶和mal Aα-葡糖苷酶是否能够在相似pH和温度条件下起作用以形成高于由单个酶所产生的葡萄糖产量，将大约0.35ug malAα-葡糖苷酶(细菌中产生)加入含有1％淀粉和如下纯化的淀粉的溶液，所述纯化的淀粉由非转基因玉米种子(对照)或797GL3转基因玉米种子(797GL3玉米种子中，α-淀粉酶与淀粉共纯化)纯化获得。另外，将从非转基因和797GL3转基因玉米种子纯化的淀粉在不存在任何malA酶的情况下加入到1％的玉米淀粉中。在90℃pH6.0下孵育混合物1小时，离心去除不溶物，HPLC分析可溶组分中葡萄糖水平。如图14所示，797GL3α-淀粉酶和malAα-葡糖苷酶在类似的pH和温度条件下作用以水解淀粉为葡萄糖。生成的葡萄糖产量明显高于由单个酶形成的产量。
实施例23
测定热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriam)葡糖淀粉酶在粗淀粉(raw-starch)水解中的应用。如图15所示，在室温和30℃，用水，大麦α-淀粉酶(来自Sigma的商业制品)，热厌氧杆菌葡糖淀粉酶及其组合，测定粗淀粉的水解转化。如图，大麦α-淀粉酶和热厌氧杆菌葡糖淀粉酶的组合能够水解粗淀粉为葡萄糖。另外，由大麦淀粉酶和热厌氧杆菌GA形成的葡萄糖产量显著高于由单个酶形成的产量。
实施例24用于粗淀粉水解的玉米优化基因和序列以及植物转化载体根据酶在大约20℃-50℃的温度下水解粗淀粉的能力选择酶。然后如实施例1所述，使用玉米偏爱密码子设计相应基因或基因片段用于构建合成基因。
选择Aspergillus shirousamiα-淀粉酶/葡糖淀粉酶融合多肽(不含信号序列)，其氨基酸序列如SEQ ID NO45所示，由Biosci.Biotech.Biochem.，56884-889(1992)；Agric.Biol.Chem.5451905-14(1990)；Biosci.Biotechnol.Biochem.56174-79(1992)鉴定。设计玉米优化核酸序列，如SEQ ID NO46所示。
类似地，选择热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)葡糖淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO47所示，由Biosci.Biotech.Biochem.，62302-308(1998)公开。设计玉米优化核酸序列(SEQ ID NO48)。
选择米根霉(Rhizopus oryzea)葡糖淀粉酶，其氨基酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO50)如文献所述(Agric.Biol.Chem.，(1986)50，pg 957-964)公开。设计玉米优化核酸序列，如SEQ ID NO51所示。
另外，选择玉米α-淀粉酶，其氨基酸序列(SEQ ID NO51)和核酸序列(SEQ ID NO52)来自文献。例如参见Plant Physiol.105759-760(1994)。
构建表达盒以从设计的SEQ ID NO46玉米优化核酸表达Aspergillus shirousamiα-淀粉酶/葡糖淀粉酶融合多肽，从设计的如SEQ ID NO48所示玉米优化核酸表达热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶，从设计的如SEQ ID NO50所示玉米优化核酸表达具有氨基酸(不含信号序列)(SEQ ID NO49)的米根霉葡糖淀粉酶，以及表达玉米α-淀粉酶。
将质粒中含有的玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)与编码酶的合成基因融合。任选地，可将SEKDEL序列与合成基因的C末端融合以靶向并滞留到ER。将融合产物在植物转化质粒中克隆到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后以在胚乳内特异性表达。该融合产物通过土壤杆菌感染被运送到玉米组织。
实施例25构建含有所选酶的表达盒以表达酶。将含有粗淀粉结合位点序列的质粒与编码酶的合成基因融合。粗淀粉结合位点使融合的酶能与非凝胶化的淀粉相结合。根据文献确定粗淀粉结合位点的氨基酸序列(SEQ ID NO53)，核酸序列经过对玉米优化，如SEQ ID NO54所示。将玉米优化核酸序列在质粒中与编码酶的合成基因融合以在植物内表达。
实施例26构建玉米优化基因和载体用于植物转化如实施例1所述，使用玉米偏爱密码子设计基因或基因片段以构建合成基因。
选择激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)EGLA耐超高温内切葡聚糖酶，其氨基酸序列(不含信号序列)如SEQ ID NO55所示，由Journal of Bacteriology(1991)181，pg 284-290鉴定。设计玉米优化核酸序列，如SEQ ID NO56所示。
选择黄栖热菌(Thermus flavus)木糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO57所示，由Applied Biochemistry and Biotechnology 6215-27(1997)公开。
构建表达盒以从玉米优化的核酸(SEQ ID NO56)表达激烈火球菌EGLA(内切葡聚糖酶)，以及从SEQ ID NO57氨基酸序列的玉米优化编码核酸表达黄栖热菌木糖异构酶。
将含有玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO17)的质粒与编码酶的合成玉米优化基因融合。任选地，可将SEKDEL序列与合成基因的C末端融合以靶向并滞留到ER。将融合产物克隆到植物转化质粒中玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后以在胚乳内特异性表达。该融合产物通过土壤杆菌感染被运送到玉米组织。
实施例27使用玉米内表达的耐高温酶从玉米面粉生产葡萄糖当与水溶液混合并在90℃孵育时，已证实耐超高温α-淀粉酶797GL3和α-葡糖苷酶(MalA)的表达可以导致葡萄糖产生。
通过测定α-葡糖苷酶活性来鉴定表达MalA酶的转基因玉米系(168A10B系，pNOV4831)，酶活性由对硝基苯基-α-葡糖苷的水解指示。
将表达797GL3的转基因植物玉米粒在Kleco槽内研磨成面粉，由此形成淀粉酶面粉。将表达MalA的转基因植物玉米粒在Kleco槽内研磨成粉，形成MalA面粉。以同样方式将非转基因植物玉米粒研磨形成对照面粉。
缓冲液为50mM MES缓冲液pH 6.0玉米面粉水解反应如下表5所示制备样品。将玉米粉(约60mg/每份样品)与pH6.0的40ml 50mM MES缓冲液混合。在90℃水浴中孵育样品2.5小时和14小时。在指定的孵育时间点上取出样品并分析葡萄糖含量。
通过葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶实验分析样品内的葡萄糖。GOPOD试剂含有0.2mg/ml邻联茴香胺，100mM Tris pH7.5，100U/ml葡萄糖氧化酶和10U/ml辣根过氧化物酶。将20μl样品或稀释样品和葡萄糖标准(从0-0.22mg/ml变化)排列在96孔板上。向各孔中加入100μlGOPOD试剂并混合，然后37℃孵育该板30分钟。加入100μl硫酸(9M)，540nm下读吸光值。参照标准曲线确定样品的葡萄糖浓度。在各样品内观察到的的葡萄糖量如表5所示。
表5
这些数据说明当玉米内表达耐超高温α-淀粉酶和α-葡糖苷酶形成玉米产物时，当该产物在适当条件下被水解和加热时可以形成葡萄糖。
实施例28生产麦芽糖糊精使用表达耐高温α-淀粉酶的谷物制备麦芽糖糊精。该示范性过程不需要淀粉的预分离，也不需要加入外源性酶。
将表达797GL3的转基因植物玉米粒在Kleco槽内研磨成粉，形成“淀粉酶面粉”。将10％转基因/90％非转基因玉米粒的混合物在Kleco槽内以同样方式研磨形成“10％淀粉酶面粉”。
以5μl水每mg面粉的比例用水混合淀粉酶面粉和10％淀粉酶面粉(约60mg/样品)。如表6所示，在90℃孵育获得的浆液不超过20小时。在85℃加入0.9ml 50mM EDTA终止反应并用吸管吹吸混合。取出0.2ml浆液样品，离心去除不溶物并用水稀释3倍。
用具有ELSD检测的HPLC分析样品中的糖和麦芽糖糊精。用Astec Polymer Amino柱，5微米粒度，250×4.6mm和Alltech ELSD2000检测器装配梯度HPLC系统。用15∶85的水∶乙腈混合物预先平衡该系统。流速为1ml/min。注射上样后维持起始条件5分钟，然后为20分钟梯度至50∶50的水∶乙腈，再以相同溶剂运行10分钟。用80∶20的水∶乙腈洗该系统20分钟，然后用起始溶剂再平衡。
将所获的峰面积相对于面粉的体积和重量标化。每μg碳水化合物的ELSD响应因子随着DP的增高而降低，这样较高DP的麦芽糖糊精在总体中所占的百分比高于由峰面积所指示的。
100％淀粉酶面粉的反应产物的相对峰面积如图17所示。10％淀粉酶面粉的反应产物的相对峰面积如图18所示。
这些数据说明可通过改变加热时间来生产不同的麦芽糖糊精混合物。可通过混合转基因α-淀粉酶表达玉米和野生型玉米来改变α-淀粉酶活性水平，从而改变麦芽糖糊精性质谱。
本实施例所述的水解反应产物可通过多种成熟技术被浓缩并纯化用于食品和其它应用，所述技术包括离心，过滤，离子交换，凝胶渗透，超滤，纳米过滤(nanofiltration)，反向渗透，用碳颗粒脱色，喷雾干燥和其它本领域公知技术。
实施例29时间和温度对麦芽糖糊精产量的影响可通过改变反应时间和温度来改变含有耐高温α-淀粉酶的谷物自水解所获的麦芽糖糊精产物组成。
另一实验中，如上实施例28所述制备淀粉酶面粉并以300μl水每60mg面粉的比例与水混合。在70℃，80℃，90℃或100℃孵育样品不超过90分钟。在90℃加入900ml 50mM EDTA终止反应。离心去除不溶物并通过0.45μm尼龙滤器过滤。如实施例28所述HPLC分析滤液。
分析结果如图19所示。DP数命名是指聚合程度。DP2是麦芽糖；DP3是麦芽三糖等。临近洗脱末尾的一个单峰中洗脱下较大的DP麦芽糖糊精，标记为“＞DP12”。该聚集体包括可以通过0.45μm滤器和通过保护柱的糊精，并不含有不能通过滤器或保护柱的非常大淀粉片段。
该实验说明可通过改变温度和孵育时间来改变产物的麦芽糖糊精组成，以获得期望的麦芽寡糖或麦芽糖糊精产物。
实施例30生产麦芽糖糊精还可在加热处理前向水和面粉混合物中加入其它酶如α-葡糖苷酶和木糖异构酶，或者通过包括盐来改变由含有耐高温α-淀粉酶的转基因玉米所形成的麦芽糖糊精产物的组成。
另一实验中，如上制备的淀粉酶面粉与纯化的MalA和/或命名为BD8037的细菌木糖异构酶混合。在大肠杆菌内表达带有6His纯化标签的硫磺矿硫化叶菌MalA。如实施例28所述制备细胞裂解液，然后使用镍亲合树脂(Probond，Invitrogen)根据厂商说明书对天然蛋白的纯化说明，纯化至均匀外观。从Diversa获得的木糖异构酶BD8037为冻干粉末，将其重悬浮在0.4x初始体积的水中。
将淀粉酶玉米粉与酶溶液和水或缓冲液混合。所有的反应都含有60mg淀粉酶面粉和总共600μl的液体。一组反应用加入了10mMMgSO4，1mM CoCl2的50mM室温下pH7.0的MOPS作为缓冲液；第二组反应用水代替含金属的缓冲液。所有反应均在90℃孵育2小时。离心制备反应上清液。用额外600μl水洗涤沉淀并再离心。将来自各反应的上清液合并，Centrico 10过滤，如上所述，用带有ELSD检测的HPLC分析。
结果如图20所示。该图说明，加入或不加入金属离子，表达淀粉酶797GL3的谷物都能够与其它耐高温酶作用，在高温下从玉米粉生成各种麦芽糖糊精混合物。特别地，将葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶包括在内可以产生更多葡萄糖产物和其它低DP产物。包括葡萄糖异构酶可以使产物内存在果糖，这样可以比由淀粉酶单独或淀粉酶与α-葡糖苷酶形成的产物更甜。另外，该数据还表明DP5，DP6和DP7麦芽寡糖的比例可以通过加入二价阳离子盐，如CoCl2和MgSO4来提高。
改变由此处所述反应所形成的麦芽糖糊精的组成的其它方法包括改变反应pH，改变转基因或非转基因谷物内的淀粉类型，改变固体比率或加入有机溶剂。
实施例31在回收淀粉衍生产物之前无需机械破坏从谷物制备糊精或糖将表达α-淀粉酶797GL3的转基因谷物与水接触并在90℃加热过夜(＞14小时)，制备了糖和麦芽糖糊精。然后从谷物中过滤分离液体。通过实施例15所述方法HPLC分析液体产物。表6给出所检测产物的情况。
表6
*DP3的定量包括麦芽三糖还可包括以α(1→6)键替代了α(1→4)键的麦芽三糖异构体。类似地，DP4-DP7的定量包括指定链长的直链麦芽寡糖以及以一个或多个α(1→6)键替代了一个或多个α(1→4)键的异构体。
这些数据表明将表达α-淀粉酶的完整谷物与水接触并加热可以制备糖和麦芽糖糊精。然后可以通过过滤或离心或重力沉降从完整谷物分离产物。
实施例32发酵表达米根霉葡糖淀粉酶的玉米中粗淀粉从按实施例29所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。将此玉米粒研磨成面粉。该玉米粒表达含有米根霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO49)的活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。
如实施例15所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2排出通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例33发酵表达米根霉葡糖淀粉酶的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。将玉米粒磨成粉。该玉米粒表达含有米根霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO49)的活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。
如实施例15所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2排出通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例34加入外源性α-淀粉酶发酵表达米根霉葡糖淀粉酶的玉米的完整玉米粒中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有米根霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO49)的活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。
将玉米粒与20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)相接触。加入氢氧化铵调整pH为6.0。加入下述成分购自sigma的大麦α-淀粉酶(2mg)，蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有混合物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该混合物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例35发酵表达米根霉葡糖淀粉酶和玉米(Zea mays)淀粉酶的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有米根霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO49)的活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。该玉米粒还表达带有粗淀粉结合域的玉米淀粉酶，如实施例28所述。
如实施例14所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例36发酵表达热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO47)的活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。
如实施例15所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例37发酵表达黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有黑曲霉葡糖淀粉酶的活性片段(Fiil，N.P.“从两个不同但紧密相关的mRNA合成黑曲霉的葡糖淀粉酶G1和G2”EMBO J.3(5)，1097-1102(1984)登录号P04064)的蛋白。编码该葡糖淀粉酶的玉米优化核酸具有SEQ ID NO59的序列，该蛋白靶向内质网。
如实施例14所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的混合物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向混合物中加入下述蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有混合物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例39发酵表达黑曲霉葡糖淀粉酶和玉米(Zea mays)淀粉酶的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有黑曲霉葡糖淀粉酶的活性片段(Fiil，N.P。“Glucoamylases从两个不同但紧密相关的mRNA合成黑曲霉的葡糖淀粉酶G1和G2”EMBO J.3(5)，1097-1102(1984)登录号P04064)的蛋白(SEQ ID NO59，玉米优化核酸)，该蛋白靶向内质网。该玉米粒还表达带有粗淀粉结合域的玉米淀粉酶，如实施例28所述。
如实施例14所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例39发酵表达热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶和大麦淀粉酶的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO47)活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。该玉米粒还表达低pI大麦淀粉酶amy1基因(Rogers，J.C.和Milliman，C.“分离并序列分析大麦α-淀粉酶cDNA克隆”J.Biol.Chem.258(13)，8169-8174(1983))，该基因被修饰以使蛋白表达靶向内质网。
如实施例14所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述在成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例40发酵表达热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶和大麦淀粉酶的玉米的完整玉米粒内粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达含有热解糖热厌氧杆菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO47)活性片段的蛋白，该蛋白靶向内质网。该玉米粒还表达低pI大麦淀粉酶amy1基因(Rogers，J.C.和Milliman，C.“分离并序列分析大麦α-淀粉酶cDNA克隆”J.Biol.Chem.258(13)，8169-8174(1983))，该基因被修饰以使蛋白表达靶向内质网。
将玉米粒与20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)相接触。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向混合物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide &urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有混合物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该混合物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
实施例41发酵表达α-淀粉酶和葡糖淀粉酶融合物的玉米中的粗淀粉的实施例从按实施例28所述制备的转基因植物收获转基因玉米粒。该玉米粒表达例如SEQ ID NO46提供的玉米优化多核苷酸，该多核苷酸编码α-淀粉酶和葡糖淀粉酶融合物如SEQ ID NO45，其靶向内质网。
如实施例14所述将玉米粒研磨成粉。然后制备含有20g玉米粉，23ml去离子水和6.0ml backset(8％重量固体)的浆状物。加入氢氧化铵调整pH为6.0。向浆状物中加入下述成分蛋白酶(0.60ml 1000倍稀释的市售蛋白酶)，0.2mg Lactocide & urea(0.85ml 10倍稀释的50％Urea Liquor)。在含有浆状物的100ml瓶子的瓶盖上挖一个洞作为CO2通道。然后用酵母(1.44ml)接种该浆状物并在90F水浴中孵育。发酵24小时后，温度降到86F；48h时设为82F。
接种的酵母如实施例14所述进行繁殖。
如实施例14所述取出样品然后用实施例14所述方法分析。
所有出版物，专利和专利申请均并入此处作为参考。根据上面的说明书，本发明已经通过一些优选实施方案描述了本发明，许多详细描述只是为了举例说明本发明，本领域技术人员均可理解本发明是容许其它实施方案的，并且这里所述的一些细节可以在不背离本发明基本原则的情况下被相当大地改变。
797GL3α-淀粉酶氨基酸序列(SEQ ID NO1)MAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVLADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVG797GL3α-淀粉酶玉米优化核酸序列(SEQ ID NO2)ATGGCCAAGTACCTGGAGCTGGAGGAGGGCGGCGTGATCATGCAGGCGTTCTACTGGGACGTCCCGAGCGGAGGCATCTGGTGGGACACCATCCGCCAGAAGATCCCCGAGTGGTACGACGCCGGCATCTCCGCGATCTGGATACCGCCAGCTTCCAAGGGCATGTCCGGGGGCTACTCGATGGGCTACGACCCGTACGACTACTTCGACCTCGGCGAGTACTACCAGAAGGGCACGGTGGAGACGCGCTTCGGGTCCAAGCAGGAGCTCATCAACATGATCAACACGGCGCACGCCTACGGCATCAAGGTCATCGCGGACATCGTGATCAACCACAGGGCCGGCGGCGACCTGGAGTGGAACCCGTTCGTCGGCGACTACACCTGGACGGACTTCTCCAAGGTCGCCTCCGGCAAGTACACCGCCAACTACCTCGACTTCCACCCCAACGAGCTGCACGCGGGCGACTCCGGCACGTTCGGCGGCTACCCGGACATCTGCCACGACAAGTCCTGGGACCAGTACTGGCTCTGGGCCTCGCAGGAGTCCTACGCGGCCTACCTGCGCTCCATCGGCATCGACGCGTGGCGCTTCGACTACGTCAAGGGCTACGGGGCCTGGGTGGTCAAGGACTGGCTCAACTGGTGGGGCGGCTGGGCGGTGGGCGAGTACTGGGACACCAACGTCGACGCGCTGCTCAACTGGGCCTACTCCTCCGGCGCCAAGGTGTTCGACTTCCCCCTGTACTACAAGATGGACGCGGCCTTCGACAACAAGAACATCCCGGCGCTCGTCGAGGCCCTGAAGAACGGCGGCACGGTGGTCTCCCGCGACCCGTTCAAGGCCGTGACCTTCGTCGCCAACCACGACACGGACATCATCTGGAACAAGTACCCGGCGTACGCCTTCATCCTCACCTACGAGGGCCAGCCCACGATCTTCTACCGCGACTACGAGGAGTGGCTGAACAAGGACAAGCTCAAGAACCTGATCTGGATTCACGACAACCTCGCGGGCGGCTCCACTAGTATCGTGTACTACGACTCCGACGAGATGATCTTCGTCCGCAACGGCTACGGCTCCAAGCCCGGCCTGATCACGTACATCAACCTGGGCTCCTCCAAGGTGGGCCGCTGGGTGTACGTCCCGAAGTTCGCCGGCGCGTGCATCCACGAGTACACCGGCAACCTCGGCGGCTGGGTGGACAAGTACGTGTACTCCTCCGGCTGGGTCTACCTGGAGGCCCCGGCCTACGACCCCGCCAACGGCCAGTACGGCTACTCCGTGTGGTCCTACTGCGGCGTCGGC6gp3支链淀粉酶氨基酸序列(SEQ ID NO3)
MGHWYKHQRAYQFTGEDDFGKVAVVKLPMDLTKVGIIVRLNEWQAKDVAKDRFIEIKDGKAEVWILQGVEEIFYEKPDTSPRIFFAQARSNKVIEAFLTNPVDTKKKELFKVTVDGKEIPVSRVEKADPTDIDVTNYVRIVLSESLKEEDLRKDVELIIEGYKPARVIMMEILDDYYYDGELGAVYSPEKTIFRVWSPVSKWVKVLLFKNGEDTEPYQVVNMEYKGNGVWEAVVEGDLDGVFYLYQLENYGKIRTTVDPYSKAVYANNQESAVVNLARTNPEGWENDRGPKIEGYEDAIIYEIHIADITGLENSGVKNKGLYLGLTEENTKGPGGVTTGLSHLVELGVTHVHILPFFDFYTGDELDKDFEKYYNWGYDPYLFMVPEGRYSTDPKNPHTRIREVKEMVKALHKHGIGVIMDMVFPHTYGIGELSAFDQTVPYYFYRIDKTGAYLNESGCGNVIASERPMMRKFIVDTVTYWVKEYHIDGFRFDQMGLIDKKTMLEVERALHKIDPTIILYGEPWGGWGAPIRFGKSDVAGTHVAAFNDEFRDAIRGSVFNPSVKGFVMGGYGKETKIKRGVVGSINYDGKLIKSFALDPEETINYAACHDNHTLWDKNYLAAKADKKKEWTEEELKNAQKLAGAILLTSQGVPFLHGGQDFCRTTNFNDNSYNAPISINGFDYERKLQFIDVFNYHKGLIKLRKEHPAFRLKNAEEIKKHLEFLPGGRRIVAFMLKDHAGGDPWKDIVVIYNGNLEKTTYKLPEGKWNVVVNSQKAGTEVIETVEGTIELDPLSAYVLYRE6gp3支链淀粉酶玉米优化核酸序列(SEQ ID NO4)ATGGGCCACTGGTACAAGCACCAGCGCGCCTACCAGTTCACCGGCGAGGACGACTTCGGGAAGGTGGCCGTGGTGAAGCTCCCGATGGACCTCACCAAGGTGGGCATCATCGTGCGCCTCAACGAGTGGCAGGCGAAGGACGTGGCCAAGGACCGCTTCATCGAGATCAAGGACGGCAAGGCCGAGGTGTGGATACTCCAGGGCGTGGAGGAGATCTTCTACGAGAAGCCGGACACCTCCCCGCGCATCTTCTTCGCCCAGGCCCGCTCCAACAAGGTGATCGAGGCCTTCCTCACCAACCCGGTGGACACCAAGAAGAAGGAGCTGTTCAAGGTGACCGTCGACGGCAAGGAGATCCCGGTGTCCCGCGTGGAGAAGGCCGACCCGACCGACATCGACGTGACCAACTACGTGCGCATCGTGCTCTCCGAGTCCCTCAAGGAGGAGGACCTCCGCAAGGACGTGGAGCTGATCATCGAGGGCTACAAGCCGGCCCGCGTGATCATGATGGAGATCCTCGACGACTACTACTACGACGGCGAGCTGGGGGCGGTGTACTCCCCGGAGAAGACCATCTTCCGCGTGTGGTCCCCGGTGTCCAAGTGGGTGAAGGTGCTCCTCTTCAAGAACGGCGAGGACACCGAGCCGTACCAGGTGGTGAACATGGAGTACAAGGGCAACGGCGTGTGGGAGGCCGTGGTGGAGGGCGACCTCGACGGCGTGTTCTACCTCTACCAGCTGGAGAACTACGGCAAGATCCGCACCACCGTGGACCCGTACTCCAAGGCCGTGTACGCCAACAACCAGGAGTCTGCAGTGGTGAACCTCGCCCGCACCAACCCGGAGGGCTGGGAGAACGACCGCGGCCCGAAGATCGAGGGCTACGAGGACGCCATCATCTACGAGATCCACATCGCCGACATCACCGGCCTGGAGAACTCCGGCGTGAAGAACAAGGGCCTCTACCTCGGCCTCACCGAGGAGAACACCAAGGCCCCGGGCGGCGTGACCACCGGCCTCTCCCACCTCGTGGAGCTGGGCGTGACCCACGTGCACATCCTCCCGTTCTTCGACTTCTACACCGGCGACGAGCTGGACAAGGACTTCGAGAAGTACTACAACTGGGGCTACGACCCGTACCTCTTCATGGTGCCGGAGGGCCGCTACTCCACCGACCCGAAGAACCCGCACACCCGAATTCGCGAGGTGAAGGAGATGGTGAAGGCCCTCCACAAGCACGG
CATCGGCGTGATCATGGACATGGTGTTCCCGCACACCTACGGCATCGGCGAGCTGTCCGCCTTCGACCAGACCGTGCCGTACTACTTCTACCGCATCGACAAGACCGGCGCCTACCTCAACGAGTCCGGCTGCGGCAACGTGATCGCCTCCGAGCGCCCGATGATGCGCAAGTTCATCGTGGACACCGTGACCTACTGGGTGAAGGAGTACCACATCGACGGCTTCCGCTTCGACCAGATGGGCCTCATCGACAAGAAGACCATGCTGGAGGTGGAGCGCGCCCTCCACAAGATCGACCCGACCATCATCCTCTACGGCGAGCCGTGGGGCGGCTGGGGGGCCCCGATCCGCTTCGGCAAGTCCGACGTGGCCGGCACCCACGTGGCCGCCTTCAACGACGAGTTCCGCGACGCCATCCGCGGCTCCGTGTTCAACCCGTCCGTGAAGGGCTTCGTGATGGGCGGCTACGGCAAGGAGACCAAGATCAAGCGCGGCGTGGTGGGCTCCATCAACTACGACGGCAAGCTCATCAAGTCCTTCGCCCTCGACCCGGAGGAGACCATCAACTACGCCGCCTGCCACGACAACCACACCCTCTGGGACAAGAACTACCTCGCCGCCAAGGCCGACAAGAAGAAGGAGTGGACCGAGGAGGAGCTGAAGAACGCCCAGAAGCTCGCCGGCGCCATCCTCCTCACTAGTCAGGGCGTGCCGTTCCTCCACGGCGGCCAGGACTTCTGCCGCACCACCAACTTCAACGACAACTCCTACAACGCCCCGATCTCCATCAACGGCTTCGACTACGAGCGCAAGCTCCAGTTCATCGACGTGTTCAACTACCACAAGGGCCTCATCAAGCTCCGCAAGGAGCACCCGGCCTTCCGCCTCAAGAACGCCGAGGAGATCAAGAAGCACCTGGAGTTCCTCCCGGGCGGGCGCCGCATCGTGGCCTTCATGCTCAAGGACCACGCCGGCGGCGACCCGTGGAAGGACATCGTGGTGATCTACAACGGCAACCTGGAGAAGACCACCTACAAGCTCCCGGAGGGCAAGTGGAACGTGGTGGTGAACTCCCAGAAGGCCGGCACCGAGGTGATCGAGACCGTGGAGGGCACCATCGAGCTGGACCCGCTCTCCGCCTACGTGCTCTACCGCGAG硫磺矿硫化叶菌malAα-葡糖苷酶氨基酸序列(SEQ ID NO5)METIKIYENKGVYKVVIGEPFPPIEFPLEQKISSNKSLSELGLTIVQQGNKVIVEKSLDLKEHIIGLGEKAFELDRKRKRYVMYNVDAGAYKKYQDPLYVSIPLFISVKDGVATGYFFNSASKVIFDVGLEEYDKVIVTTPEDSVEFYVIEGPRIEDVLEKYTELTGKPFLPPMWAFGYMISRYSYYPQDKVVELVDIMQKEGFRVAGVFLDIHYMDSYKLFTWHPYRFPEPKKLIDELHKRNVKLITIVDHGIRVDQNYSPFLSGMGKFCEIESGELFVGKMWPGTTVYPDFFREDTREWWAGLISEWLSQGVDGIWLDMNEPTDFSRAIEIRDVLSSLPVQFRDDRLVTTFPDNVVHYLRGKRVKHEKVRNAYPLYEAMATFKGFRTSHRNEIFILSRAGYAGIQRYAFIWTGDNTPSWDDLKLQLQLVLGLSISGVPFVGCDIGCFQGRNFAEIDNSMDLLVKYYALALFFPFYRSHKATDGIDTEPVFLPDYYKEKVKEIVELRYKFLPYIYSLALEASEKGHPVIRPLFYEFQDDDDMYRIEDEYMVGKYLLYAPIVSKEESRLVTLPRGKWYNYWNGEIINGKSVVKSTHELPIYLREGSIIPLEGDELIVYGETSFKRYDNAEITSSSNEIKFSREIYVSKLTITSEKPVSKIIVDDSKEIQVEKTMQNTYVAKINQKIRGKINLE硫磺矿硫化叶菌malAα-葡糖苷酶玉米优化核酸序列(SEQ ID NO6)ATGGAGACCATCAAGATCTACGAGAACAAGGGCGTGTACAAGGTGGTGATCGGCGAGCCGTTCCCGCCGATCGAGTTCCCGCTCGAGCAGAAGATCTCCTCCAACAAGTCCCTCTCCGA
GCTGGGCCTCACCATCGTGCAGCAGGGCAACAAGGTGATCGTGGAGAAGTCCCTCGACCTCAAGGAGCACATCATCGGCCTCGGCGAGAAGGCCTTCGAGCTGGACCGCAAGCGCAAGCGCTACGTGATGTACAACGTGGACGCCGGCGCCTACAAGAAGTACCAGGACCCGCTCTACGTGTCCATCCCGCTCTTCATCTCCGTGAAGGACGGCGTGGCCACCGGCTACTTCTTCAACTCCGCCTCCAAGGTGATCTTCGACGTGGGCCTCGAGGAGTACGACAAGGTGATCGTGACCATCCCGGAGGACTCCGTGGAGTTCTACGTGATCGAGGGCCCGCGCATCGAGGACGTGCTCGAGAAGTACACCGAGCTGACCGGCAAGCCGTTCCTCCCGCCGATGTGGGCCTTCGGCTACATGATCTCCCGCTACTCCTACTACCCGCAGGACAAGGTGGTGGAGCTGGTGGACATCATGCAGAAGGAGGGCTTCCGCGTGGCCGGCGTGTTCCTCGACATCCACTACATGGACTCCTACAAGCTCTTCACCTGGCACCCGTACCGCTTCCCGGAGCCGAAGAAGCTCATCGACGAGCTGCACAAGCGCAACGTGAAGCTCATCACCATCGTGGACCACGGCATCCGCGTGGACCAGAACTACTCCCCGTTCCTCTCCGGCATGGGCAAGTTCTGCGAGATCGAGTCCGGCGAGCTGTTCGTGGGCAAGATGTGGCCGGGCACCACCGTGTACCCGGACTTCTTCCGCGAGGACACCCGCGAGTGGTGGGCCGGCCTCATCTCCGAGTGGCTCTCCCAGGGCGTGGACGGCATCTGGCTCGACATGAACGAGCCGACCGACTTCTCCCGCGCCATCGAGATCCGCGACGTGCTCTCCTCCCTCCCGGTGCAGTTCCGCGACGACCGCCTCGTGACCACCTTCCCGGACAACGTGGTGCACTACCTCCGCGGCAAGCGCGTGAAGCACGAGAAGGTGCGCAACGCCTACCCGCTCTACGAGGCGATGGCCACCTTCAAGGGCTTCCGCACCTCCCACCGCAACGAGATCTTCATCCTCTCCCGCGCCGGCTACGCCGGCATCCAGCGCTACGCCTTCATCTGGACCGGCGACAACACCCCGTCCTGGGACGACCTCAAGCTCCAGCTCCAGCTCGTGCTCGGCCTCTCCATCTCCGGCGTGCCGTTCGTGGGCTGCGACATCGGCGGCTTCCAGGGCCGCAACTTCGCCGAGATCGACAACTCGATGGACCTCCTCGTGAAGTACTACGCCCTCGCCCTCTTCTTCCCGTTCTACCGCTCCCACAAGGCCACCGACGGCATCGACACCGAGCCGGTGTTCCTCCCGGACTACTACAAGGAGAAGGTGAAGGAGATCGTGGAGCTGCGCTACAAGTTCCTCCCGTACATCTACTCCCTCGCCCTCGAGGCCTCCGAGAAGGGCCACCCGGTGATCCGCCCGCTCTTCTACGAGTTCCAGGACGACGACGACATGTACCGCATCGAGGACGAGTACATGGTGGGCAAGTACCTCCTCTACGCCCCGATCGTGTCCAAGGAGGAGTCCCGCCTCGTGACCCTCCCGCGCGGCAAGTGGTACAACTACTGGAACGGCGAGATCATCAACGGCAAGTCCGTGGTGAAGTCCACCCACGAGCTGCCGATCTACCTCCGCGAGGGCTCCATCATCCCGCTCGAGGGCGACGAGCTGATCGTGTACGGCGAGACCTCCTTCAAGCGCTACGACAACGCCGAGATCACCTCCTCCTCCAACGAGATCAAGTTCTCCCGCGAGATCTACGTGTCCAAGCTCACCATCACCTCCGAGAAGCCGGTGTCCAAGATCATCGTGGACGACTCCAAGGAGATCCAGGTGGAGAAGACCATGCAGAACACCTACGTGGCCAAGATCAACCAGAAGATCCGCGGCAAGATCAACCTCGAGTGAWaxy cDNA序列(SEQ ID NO7)ATGGCGGCTCTGGCCACGTCGCAGCTCGTCGCAACGCGCGCCGGCCTGGGCGTCCCGGACGCGTCCACGTTCCGCCGCGGCGCCGCGCAGGGCCTGAGGGGGGCCCGGGCGTCGGCGG
CGGCGGACACGCTCAGCATGCGGACCAGCGCGCGCGCGGCGCCCAGGCACCAGCACCAGCAGGCGCGCCGCGGGGCCAGGTTCCCGTCGCTCGTCGTGTGCGCCAGCGCCGGCATGAACGTCGTCTTCGTCGGCGCCGAGATGGCGCCGTGGAGCAAGACCGGAGGCCTCGGCGACGTCCTCGGCGGCCTGCCGCCGGCCATGGCCGCGAACGGGCACCGTGTCATGGTCGTCTCTCCCCGCTACGACCAGTACAAGGACGCCTGGGACACCAGCGTCGTGTCCGAGATCAAGATGGGAGACGGGTACGAGACGGTCAGGTTCTTCCACTGCTACAAGCGCGGAGTGGACCGCGTGTTCGTTGACCACCCACTGTTCCTGGAGAGGGTTTGGGGAAAGACCGAGGAGAAGATCTACGGGCCTGTCGCTGGAACGGACTACAGGGACAACCAGCTGCGGTTCAGCCTGCTATGCCAGGCAGCACTTGAAGCTCCAAGGATCCTGAGCCTCAACAACAACCCATACTTCTCCGGACCATACGGGGAGGACGTCGTGTTCGTCTGCAACGACTGGCACACCGGCCCTCTCTCGTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTCCCACGGCATCTACAGGGACGCAAAGACCGCTTTCTGCATCCACAACATCTCCTACCAGGGCCGGTTCGCCTTCTCCGACTACCCGGAGCTGAACCTCCCCGAGAGATTCAAGTCGTCCTTCGATTTCATCGACGGCTACGAGAAGCCCGTGGAAGGCCGGAAGATCAACTGGATGAAGGCCGGGATCCTCGAGGCCGACAGGGTCCTCACCGTCAGCCCCTACTACGCCGAGGAGCTCATCTCCGGCATCGCCAGGGGCTGCGAGCTCGACAACATCATGCGCCTCACCGGCATCACCGGCATCGTCAACGGCATGGACGTCAGCGAGTGGGACCCCAGCAGGGACAAGTACATCGCCGTGAAGTACGACGTGTCGACGGCCGTGGAGGCCAAGGCGCTGAACAAGGAGGCGCTGCAGGCGGAGGTCGGGCTCCCGGTGGACCGGAACATCCCGCTGGTGGCGTTCATCGGCAGGCTGGAAGAGCAGAAGGGCCCCGACGTCATGGCGGCCGCCATCCCGCAGCTCATGGAGATGGTGGAGGACGTGCAGATCGTTCTGCTGGGCACGGGCAAGAAGAAGTTCGAGCGCATGCTCATGAGCGCCGAGGAGAAGTTCCCAGGCAAGGTGCGCGCCGTGGTCAAGTTCAACGCGGCGCTGGCGCACCACATCATGGCCGGCGCCGACGTGCTCGCCGTCACCAGCCGCTTCGAGCCCTGCGGCCTCATCCAGCTGCAGGGGATGCGATACGGAACGCCCTGCGCCTGCGCGTCCACCGGTGGACTCGTCGACACCATCATCGAAGGCAAGACCGGGTTCCACATGGGCCGCCTCAGCGTCGACTGCAACGTCGTGGAGCCGGCGGACGTCAAGAAGGTGGCCACCACCTTGCAGCGCGCCATCAAGGTGGTCGGCACGCCGGCGTACGAGGAGATGGTGAGGAACTGCATGATCCAGGATCTCTCCTGGAAGGGCCCTGCCAAGAACTGGGAGAACGTGCTGCTCAGCCTCGGGGTCGCCGGCGGCGAGCCAGGGGTTGAAGGCGAGGAGATCGCGCCGCTCGCCAAGGAGAACGTGGCCGCGCCCWaxy氨基酸序列(SEQ ID NO8)MAALATSQLVATRAGLGVPDASTFRRGAAQGLRGARASAAADTLSMRTSARAAPRHQHQQARRGARFPSLVVCASAGMNVVFVGAEMAPWSKTGGLGDVLGGLPPAMAANGHRVMVVSPRYDQYKDAWDTSVVSEIKMGDGYETVRFFHCYKRGVDRVFVDHPLFLERVWGKTEEKIYGPVAGTDYRDNQLRFSLLCQAALEAPRILSLNNNPYFSGPYGEDVVFVCNDWHTGPLSCYLKSNYQSHGIYRDAKTAFCIHNISYQGRFAFSDYPELNLPERFKSSFDFIDGYEKPVEGRKINWMKAGILEADRVLTVSPYYAEELISGIARGCELDNIMRLTGITGIVNGMDVSEWDPSRDKYIAVKY
DVSTAVEAKALNKEALQAEVGLPVDRNIPLVAFIGRLEEQKGPDVMAAAIPQLMEMVEDVQIVLLGTGKKKFERMLMSAEEKFPGKVRAVVKFNAALAHHIMAGADVLAVTSRFEPCGLIQLQGMRYGTPCACASTGGLVDTIIEGKTGFHMGRLSVDCNVVEPADVKKVATTLQRAIKVVGTPAYEEMVRNCMIQDLSWKGPAKNWENVLLSLGVAGGEPGVEGEELAPLAKEMVAAP797 GL3/Waxy核酸序列(SEQ ID NO9)ATGGCCAAGTACCTGGAGCTGGAGGAGGGCGGCGTGATCATGCAGGCGTTCTACTGGGACGTCCCGAGCGGAGGCATCTGGTGGGACACCATCCGCCAGAAGATCCCCGAGTGGTACGACGCCGGCATCTCCGCGATCTGGATACCGCCAGCTTCCAAGGGCATGTCCGGGGGCTACTCGATGGGCTACGACCCGTACGACTACTTCGACCTCGGCGAGTACTACCAGAAGGGCACGGTGGAGACGCGCTTCGGGTCCAAGCAGGAGCTCATCAACATGATCAACACGGCGCACGCCTACGGCATCAAGGTCATCGCGGACATCGTGATCAACCACAGGGCCGGCGGCGACCTGGAGTGGAACCCGTTCGTCGGCGACTACACCTGGACGGACTTCTCCAAGGTCGCCTCCGGCAAGTACACCGCCAACTACCTCGACTTCCACCCCAACGAGCTGCACGCGGGCGACTCCGGCACGTTCGGCGGCTACCCGGACATCTGCCACGACAAGTCCTGGGACCAGTACTGGCTCTGGGCCTCGCAGGAGTCCTACGCGGCCTACCTGCGCTCCATCGGCATCGACGCGTGGCGCTTCGACTACGTCAAGGGCTACGGGGCCTGGGTGGTCAAGGACTGGCTCAACTGGTGGGGCGGCTGGGCGGTGGGCGAGTACTGGGACACCAACGTCGACGCGCTGCTCAACTGGGCCTACTCCTCCGGCGCCAAGGTGTTCGACTTCCCCCFGTACTACAAGATGGACGCGGCCTTCGACAACAAGAACATCCCGGCGCTCGTCGAGGCCCTGAAGAACGGCGGCACGGTGGTCTCCCGCGACCCGTTCAAGGCCGTGACCTTCGTCGCCAACCACGACACGGACATCATCTGGAACAAGTACCCGGCGTACGCCTTCATCCTCACCTACGAGGGCCAGCCCACGATCTTCTACCGCGACTACGAGGAGTGGCTGAACAAGGACAAGCTCAAGAACCTGATCTGGATTCACGACAACCTCGCGGGCGGCTCCACTAGTATCGTGTACTACGACTCCGACGAGATGATCTTCGTCCGCAACGGCTACGGCTCCAAGCCCGGCCTGATCACGTACATCAACCTGGGCTCCTCCAAGGTGGGCCGCTGGGTGTACGTCCCGAAGTTCGCCGGCGCGTGCATCCACGAGTACACCGGCAACCTCGGCGGCTGGGTGGACAAGTACGTGTACTCCTCCGGCTGGGTCTACCTGGAGGCCCCGGCCTACGACCCCGCCAACGGCCAGTACGGCTACTCCGTGTGGTCCTACTGCGGCGTCGGCACATCGATTGCTGGCATCCTCGAGGCCGACAGGGTCCTCACCGTCAGCCCCTACTACGCCGAGGAGCTCATCTCCGGCATCGCCAGGGGCTGCGAGCPCGACAACATCATGCGCCTCACCGGCATCACCGGCATCGTCAACGGCATGGACGTCAGCGAGTGGGACCCCAGCAGGGACAAGTACATCGCCGTGAAGTACGACGTGTCGACGGCCGTGGAGGCCAAGGCGCTGAACAAGGAGGCGCTGCAGGCGGAGGTCGGGCTCCCGGTGGACCGGAACATCCCGCTGGTGGCGTTCATCGGCAGGCTGGAAGAGCAGAAGGGCCCCGACGTCATGGCGGCCGCCATCCCGCAGCTCATGGAGATGGTGGAGGACGTGCAGATCGTTCTGCTGGGCACGGGCAAGAAGAAGTTCGAGCGCATGCTCATGAGCGCCGAGGAGAAGTTCCCAGGCAAGGTGCGCGCCGTGGTCAA
GTTCAACGCGGCGCTGGCGCACCACATCATGGCCGGCGCCGACGTGCTCGCCGTCACCAGCCGCTTCGAGCCCTGCGGCCTCATCCAGCTGCAGGGGATGCGATACGGAACGCCCTGCGCCTGCGCGTCCACCGGTGGACTCGTCGACACCATCATCGAAGGCAAGACCGGGTTCCACATGGGCCGCCTCAGCGTCGACTGCAACGTCGTGGAGCCGGCGGACGTCAAGAAGGTGGCCACCACCTTGCAGCGCGCCATCAAGGTGGTCGGCACGCCGGCGTACGAGGAGATGGTGAGGAACTGCATGATCCAGGATCTCTCCTGGAAGGGCCCTGCCAAGAACTGGGAGAACGTGCTGCTCAGCCTCGGGGTCGCCGGCGGCGAGCCAGGGGTTGAAGGCGAGGAGATCGCGCCGCTCGCCAAGGAGAACGTGGCCGCGCCC797 GL3/Waxy氨基酸序列(SEQ ID NO10)MAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVIADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGTSIAGILEADRVLTVSPYYAEELISGLARGCELDNIMRLTGITGIVNGMDVSEWDPSRDKYIAVKYDVSTAVEAKALNKEALQAEVGLPVDRNIPLVAFIGRLEEQKGPDVMAAAIPQLMEMVEDVQIVLLGTGKKKFERMLMSAEEKFPGKVRAVVKFNAALAHHIMAGADVLAVTSRFEPCGLIQLQGMRYGTPCACASTGGLVDTIIEGKTGFHMGRLSVDCNVVEPADVKKVATTLQRAIKVVGTPAYEEMVRNCMIQDLSWKGPAKNWENVLLSLGVAGGEPGVEGEEIAPLAKENVAAP玉蜀黍ADP-gpp启动子核酸序列(SEQ ID NO11)GGAGAGCTATGAGACGTATGTCCTCAAAGCCACTTTGCATTGTGTGAAACCAATATCGATCTTTGTTACTTCATCATGCATGAACATTTGTGGAAACTACTAGCTTACAAGCATTAGTGACAGCTCAGAAAAAAGTTATCTATGAAAGGTTTCATGTGTACCGTGGGAAATGAGAAATGTTGCCAACTCAAACACCTTCAATATGTTGTTTGCAGGCAAACTCTTCTGGAAGAAAGGTGTCTAAAACTATGAACGGGTTACAGAAAGGTATAAACCACGGCTGTGCATTTTGGAAGTATCATCTATAGATGTCTGTTGAGGGGAAAGCCGTACGCCAACGTTATTTACTCAGAAACAGCTTCAACACACAGTTGTCTGCTTTATGATGGCATCTCCACCCAGGCACCCACCATCACCTATCTCTCGTGCCTGTTTATTTTCTTGCCCTTTCTGATCATAAAAAAACATTAAGAGTTTGCAAACATGCATAGGCATATCAATATGCTCATTTATTAATTTGCTAGCAGATCATCTTCCTACTCTTTACTTTATTTATTGTTTGAAAAATATGTCCTGCACCTAGGGAGCTCGTATACAGTACCAATGCATCTTCATTAAATGTGAATTTCAGAAAGGAAGTAGGAACCTATGAGAGTATTTTCAAAATTAATTAGCGGCTTCTATTATGTTTATAGCAAAGGCCAAGGGCAAAATTGGAAC
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YDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGpNOV6201淀粉酶融合氨基酸序列(SEQ IE NO14)MRVLLVALALLALAASATSAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVIADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGSEKDELpNOV4029淀粉酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO15)MLAALATSQLVATRAGLGVPDASTFRRGAAQGLRGARASAAADTLSMRTSARAAPRHQHQQARRGARFPSLVVCASAGAMAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVIADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGTSIpNOV4031淀粉酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO16)MLAALATSQLVATRAGLGVPDASTFRRGAAQGLRGARASAAADTLSMRTSARAAPRHQHQQARRGARFPSLVVCASAGAMAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVIADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGTSIAGILEADRVLTVSPYYAEELISGIARGCELDNIMRLTGITGIVNGMDVSEWDPSRDKYIAVKYDVSTAVEAKALNKEALQAEVGLPVDR
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pNOV4833葡萄糖异构酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO29)MRVLLVALALLALAASATSMAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKVAYKLVKDGVLDKFIEEKYRSFREGIGRDIVEGKVDFEKLEEYIIDKETIELPSGKQEYLESLINSYIVKTILELRSEKDELpNOV4840葡萄糖异构酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO30)MRVLLVALALLALAASATSMAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKVAYKLVKDGVLDKFIEEKYRSFREGIGRDIVEGKVDFEKLEEYIIDKETIELPSGKQEYLESLINSYIVKTILELR大麦α淀粉酶AMY32b信号序列(SEQ ID NO31)(MGKNGNLCCFSLLLLLLAGLASGHQ)PR1a信号序列(SEQ ID NO32)(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA)797GL3融合物(SEQ ID NO33)MRVLLVALALLALAASATSAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVIADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGSEKDEL
6GP3融合物(SEQ ID NO34)MRVLLVALALLALAASATSAGHWYKHQRAYQFTGEDDFGKVAVVKLPMDLTKVGIIVRLNEWQAKDVAKDRFIEIKDGKAEVWILQGVEEIFYEKPDTSPRIFFAQARSNKVIEAFLTNPVDTKKKELFKVTVDGKEIPVSRVEKADPTDIDVTNYVRIVLSESLKEEDLRKDVELIIEGYKPARVIMMEILDDYYYDGELGAVYSPEKTIFRVWSPVSKWVKVLLFKNGEDTEPYQVVNMEYKGNGVWEAVVEGDLDGVFYLYQLENYGKIRTTVDPYSKAVYANNQESAVVNLARTNPEGWENDRGPKIEGYEDAIIYEIHIADITGLENSGVKNKGLYLGLTEENTKAPGGVTTGLSHLVELGVTHVHILPFFDFYTGDELDKDFEKYYNWGYDPYLFMVPEGRYSTDPKNPHTRIREVKEMVKALHKHGIGVIMDMVFPHTYGIGELSAFDQTVPYYFYRIDKTGAYLNESGCGNVIASERPMMRKFIVDTVTYWVKEYHIDGFRFDQMGLIDKKTMLEVERALHKIDPTIILYGEPWGGWGAPIPFGKSDVAGTHVAAFNDEFRDAIRGSVFNPSVKGFVMGGYGKETKIKRGVVGSINYDGKLIKSFALDPEETINYAACHDNHTLWDKNYLAAKADKKKEWTEEELKNAQKLAGAILLTSQGVPFLHGGQDFCRTTNFNDNSYNAPISINGFDYERKLQFIDVFNYHKGLIKLRKEHPAFRLKNAEEIKKHLEFLPGGRRIVAFMLKDHAGGDPWKDIVVIYNGNLEKTTYKLPEGKWNVVVNSQKAGTEVIETVEGTIELDPLSAYVLYRESEKDEL797GL3融合物(SEQ ID NO35)MRVLLVALALLALAASATSAKYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMSGGYSMGYDPYDYFDLGEYYQKGTVETRFGSKQELINMINTAHAYGIKVIADIVINHRAGGDLEWNPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDAWRFDYVKGYGAWVVKDWLNWWGGWAVGEYWDTNVDALLNWAYSSGAKVFDFPLYYKMDAAFDNKNIPALVEALKNGGTVVSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTSIVYYDSDEMIFVRNGYGSKPGLITYINLGSSKVGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVGSEKDELmalA融合物(SEQ ID NO36)MRVLLVALALLALAASATSMETIKIYENKGVYKVVIGEPFPPIEFPLEQKISSNKSLSELGLTIVQQGNKVIVEKSLDLKEHIIGLGEKAFELDRKRKRYVMYNVDAGAYKKYQDPLYVSIPLFISVKDGVATGYFFNSASKVIFDVGLEEYDKVIVTIPEDSVEFYVIEGPRIEDVLEKYTELTGKPFLPPMWAFGYMISRYSYYPQDKVVELVDIMQKEGFRVAGVFLDIHYMDSYKLFTWHPYRFPEPKKLIDELHKRNVKLITIVDHGIRVDQNYSPFLSGMGKFCEIESGELFVGKMWPGTTVYPDFFREDTREWWAGLISEWLSQGVDGIWLDMNEPTDFSRAIEIRDVLSSLPVQFRDDRLVTTFPDNVVHYLRGKRVKHEKVRNAYPLYEAMATFKGFRTSHRNEIFILSRAGYAGIQRYAFIWTGDNTPSWDDLKLQLQLVLGLSISGVPFVGCDIGGFQGRNFAEIDNSMDLLVKYYALALFFPFYRSHKATDGIDTEPVFLPDYYKEKVKEIVELRYKFLPYIYSLALEASEKGHPVIRPLFYEFQDDDDMYRIEDEYMVGKYLLYAPIVSKEESRLVTLPRGKWYNYWNGEIINGKSVVKSTHELPIYLREGSIIP
LEGDELIVYGETSFKRYDNAEITSSSNEIKFSREIYVSKLTITSEKPVSKIIVDDSKEIQVEKTMQNTYVAKINQKIRGKINLESEKDELpNOV4829葡萄糖异构酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO37)ATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCCTGGTGCCACGCGGTTCCATGGCCGAGTTCTTCCCGGAGATCCCGAAGATCCAGTTCGAGGGCAAGGAGTCCACCAACCCGCTCGCCTTCCGCTTCTACGACCCGAACGAGGTGATCGACGGCAAGCCGCTCAAGGACCACCTCAAGTTCTCCGTGGCCTTCTGGCACACCTTCGTGAACGAGGGCCGCGACCCGTTCGGCGACCCGACCGCCGAGCGCCCGTGGAACCGCTTCTCCGACCCGATGGACAAGGCCTTCGCCCGCGTGGACGCCCTCTTCGAGTTCTGCGAGAAGCTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACCGCGACATCGCCCCGGAGGGCAAGACCCTCCGCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGGTGGTGGAGCGCATCAAGGAGCGCATGAAGGACTCCAACGTGAAGCTCCTCTGGGGCACCGCCAACCTCTTCTCCCACCCGCGCTACATGCACGGCGCCGCCACCACCTGCTCCGCCGACGTGTTCGCCTACGCCGCCGCCCAGGTGAAGAAGGCCCTGGAGATCACCAAGGAGCTGGGCGGCGAGGGCTACGTGTTCTGGGGCGGCCGCGAGGGCTACGAGACCCTCCTCAACACCGACCTCGGCCTGGAGCTGGAGAACCTCGCCCGCTTCCTCCGCATGGCCGTGGAGTACGCCAAGAAGATCGGCTTCACCGGCCAGTTCCTCATCGAGCCGAAGCCGAAGGAGCCGACCAAGCACCAGTACGACTTCGACGTGGCCACCGCCTACGCCTTCCTCAAGAACCACGGCCTCGACGAGTACTTCAAGTTCAACATCGAGGCCAACCACGCCACCCTCGCCGGCCACACCTTCCAGCACGAGCTGCGCATGGCCCGCATCCTCGGCAAGCTCGGCTCCATCGACGCCAACCAGGGCGACCTCCTCCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGACCAACATCTACGACACCACCCTCGCCATGTACGAGGTGATCAAGGCCGGCGGCTTCACCAAGGGCGGCCTCAACTTCGACGCCAAGGTGCGCCGCGCCTCCTACAAGGTGGAGGACCTCTTCATCGGCCACATCGCCGGCATGGACACCTTCGCCCTCGGCTTCAAGATCGCCTACAAGCTCGCCAAGGACGGCGTGTTCGACAAGTTCATCGAGGAGAAGTACCGCTCCTTCAAGGAGGGCATCGGCAAGGAGATCGTGGAGGGCAAGACCGACTTCGAGAAGCTGGAGGAGTACATCATCGACAAGGAGGACATCGAGCTGCCGTCCGGCAAGCAGGAGTACCTGGAGTCCCTCCTCAACTCCTACATCGTGAAGACCATCGCCGAGCTGCGCTCCGAGAAGGACGAGCTGTGApNOV4829葡萄糖异构酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO38)MKETAAAKFERQHMDSPDLGTLVPRGSMAEFFPEIPKIQFEGKESTNPLAFRFYDPNEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTAERPWNRFSDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELENLARFLRMAVEYAKKIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKNHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKV
RRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKIAYKLAKDGVFDKFIEEKYRSFKEGIGKEIVEGKTDFEKLEEYIIDKEDIELPSGKQEYLESLLNSYIVKTIAELRSEKDELpNOV4830葡萄糖异构酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO39)ATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCCTGGTGCCACGCGGTTCCATGGCCGAGTTCTTCCCGGAGATCCCGAAGGTGCAGTTCGAGGGCAAGGAGTCCACCAACCCGCTCGCCTTCAAGTTCTACGACCCGGAGGAGATCATCGACGGCAAGCCGCTCAAGGACCACCTCAAGTTCTCCGTGGCCTTCTGGCACACCTTCGTGAACGAGGGCCGCGACCCGTTCGGCGACCCGACCGCCGACCGCCCGTGGAACCGCTACACCGACCCGATGGACAAGGCCTTCGCCCGCGTGGACGCCCTCTTCGAGTTCTGCGAGAAGCTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACCGCGACATCGCCCCGGAGGGCAAGACCCTCCGCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGGTGGTGGAGCGCATCAAGGAGCGCATGAAGGACTCCAACGTGAAGCTCCTCTGGGGCACCGCCAACCTCTTCTCCCACCCGCGCTACATGCACGGCGCCGCCACCACCTGCTCCGCCGACGTGTTCGCCTACGCCGCCGCCCAGGTGAAGAAGGCCCTGGAGATCACCAAGGAGCTGGGCGGCGAGGGCTACGTGTTCTGGGGCGGCCGCGAGGGCTACGAGACCCTCCTCAACACCGACCTCGGCTTCGAGCTGGAGAACCTCGCCCGCTTCCTCCGCATGGCCGTGGACTACGCCAAGCGCATCGGCTTCACCGGCCAGTTCCTCATCGAGCCGAAGCCGAAGGAGCCGACCAAGCACCAGTACGACTTCGACGTGGCCACCGCCTACGCCTTCCTCAAGTCCCACGGCCTCGACGAGTACTTCAAGTTCAACATCGAGGCCAACCACGCCACCCTCGCCGGCCACACCTTCCAGCACGAGCTGCGCATGGCCCGCATCCTCGGCAAGCTCGGCTCCATCGACGCCAACCAGGGCGACCTCCTCCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGACCAACGTGTACGACACCACCCTCGCCATGTACGAGGTGATCAAGGCCGGCGGCTTCACCAAGGGCGGCCTCAACTTCGACGCCAAGGTGCGCCGCGCCTCCTACAAGGTGGAGGACCTCTTCATCGGCCACATCGCCGGCATGGACACCTTCGCCCTCGGCTTCAAGGTGGCCTACAAGCTCGTGAAGGACGGCGTGCTCGACAAGTTCATCGAGGAGAAGTACCGCTCCTTCCGCGAGGGCATCGGCCGCGACATCGTGGAGGGCAAGGTGGACTTCGAGAAGCTGGAGGAGTACATCATCGACAAGGAGACCATCGAGCTGCCGTCCGGCAAGCAGGAGTACCTGGAGTCCCTCATCAACTCCTACATCGTGAAGACCATCCTGGAGCTGCGCTCCGAGAAGGACGAGCTGTGApNOV4830葡萄糖异构酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO40)MKETAAAKFERQHMDSPDLGTLVPRGSMAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVR
RASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKVAYKLVKDGVLDKFIEEKYRSFREGIGRDIVEGKVDFEKLEEYIIDKETIELPSGKQEYLESLINSYIVKTILELRSEKDELpNOV4835海栖热袍菌葡萄糖异构酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO41)ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGATCCCCATGGCCGAGTTCTTCCCGGAGATCCCGAAGATCCAGTTCGAGGGCAAGGAGTCCACCAACCCGCTCGCCTTCCGCTTCTACGACCCGAACGAGGTGATCGACGGCAAGCCGCTCAAGGACCACCTCAAGTTCTCCGTGGCCTTCTGGCACACCTTCGTGAACGAGGGCCGCGACCCGTTCGGCGACCCGACCGCCGAGCGCCCGTGGAACCGCTTCTCCGACCCGATGGACAAGGCCTTCGCCCGCGTGGACGCCCTCTTCGAGTTCTGCGAGAAGCTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACCGCGACATCCCCCGGAGGGCAAGACCCTCCGCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGGTGGTGGAGCGCATCAAGGAGCGCATGAAGGACTCCAACGTGAAGCTCCTCTGGGGCACCGCCAACCTCTTCTCCCACCCGCGCTACATGCACGGCGCCGCCACCACCTGCTCCGCCGACGTGTTCGCCTACGCCGCCGCCCAGGTGAAGAAGGCCCTGGAGATCACCAAGGAGCTGGGCGGCGAGGGCTACGTGTTCTGGGGCGGCCGCGAGGGCTACGAGACCCTCCTCAACACCGACCTCGGCCTGGAGCTGGAGAACCTCGCCCGCTTCCTCCGCATGGCCGTGGAGTACGCCAAGAAGATCGGCTTCACCGGCCAGTTCCTCATCGAGCCGAAGCCGAAGGAGCCGACCAAGCACCAGTACGCTTCGACGTGGCCACCGCCTACGCCTTCCTCAAGAACCACGGCCTCGACGAGTACTTCAAGTTCAACATCGAGGCCAACCACGCCACCCTCGCCGGCCACACCTTCCAGCACGAGCTGCGCATGGCCCGCATCCTCGGCAAGCTCGGCTCCATCGACGCCAACCAGGGCGACCTCCTCCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGACCAACATCTACGACACCACCCTCGCCATGTACGAGGTGATCAAGGCCGGCGGCTTCACCAAGGGCGGCCTCAACTTCGACGCCAAGGTGCGCCGCGCCTCCTACAAGGTGGAGGACCTCTTCATCGGCCACATCGCCGGCATGGACACCTTCGCCCTCGGCTTCAAGATCGCCTACAAGCTCGCCAAGGACGGCGTGTTCGACAAGTTCATCGAGGAGAAGTACCGCTCCTTCAAGGAGGGCATCGGCAAGGAGATCGTGGAGGGCAAGACCGACTTCGAGAAGCTGGAGGAGTACATCATCGACAAGGAGGACATCGAGCTGCCGTCCGGCAAGCAGGAGTACCTGGAGTCCCTCCTCAACTCCTACATCGTGAAGACCATCGCCGAGCTGCGCTGApNOV4835海栖热袍菌葡萄糖异构酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO42)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRIPMAEFFPEIPKIQFEGKESTNPLAFRFYDPNEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTAERPWNRFSDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELENLARFLRMAVEYAKKIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKNHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEVIKAGGFTKGG
LNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKIAYKLAKDGVFDKFIEEKYRSFKEGIGKEIVEGKTDFEKLEEYIIDKEDIELPSGKQEYLESLLNSYIVKTIAELRpNOV4836那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO43)ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGATCCCCATGGCCGAGTTCTTCCCGGAGATCCCGAAGGTGCAGTTCGAGGGCAAGGAGTCCACCAACCCGCTCGCCTTCAAGTTCTACGACCCGGAGGAGATCATCGACGGCAAGCCGCTCAAGGACCACCTCAAGTTCTCCGTGGCCTTCTGGCACACCTTCGTGAACGAGGGCCGCGACCCGTTCGGCGACCCGACCGCCGACCGCCCGTGGAACCGCTACACCGACCCGATGGACAAGGCCTTCGCCCGCGTGGACGCCCTCTTCGAGTTCTGCGAGAAGCTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACCGCGACATCCCCCGGAGGGCAAGACCCTCCGCGAGACCAACAAGATCCTCGACAAGGTGGTGGAGCGCATCAAGGAGCGCATGAAGGACTCCAACGTGAAGCTCCTCTGGGGCACCGCCAACCTCTTCTCCCACCCGCGCTACATGCACGGCGCCGCCACCACCTGCTCCGCCGACGTGTTCGCCTACGCCGCCGCCCAGGTGAAGAAGGCCCTGGAGATCACCAAGGAGCTGGGCGGCGAGGGCTACGTGTTCTGGGGCGGCCGCGAGGGCTACGAGACCCTCCTCAACACCGACCTCGGCTTCGAGCTGGAGAACCTCGCCCGCTTCCTCCGCATGGCCGTGGACTACGCCAAGCGCATCGGCTTCACCGGCCAGTTCCTCATCGAGCCGAAGCCGAAGGAGCCGACCAAGCACCAGTACGACTTCGACGTGGCCACCGCCTACGCCTTCCTCAAGTCCCACGGCCTCGACGAGTACTTCAAGTTCAACATCGAGGCCAACCACGCCACCCTCGCCGGCCACACCTTCCAGCACGAGCTGCGCATGGCCCGCATCCTCGGCAAGCTCGGCTCCATCGACGCCAACCAGGGCGACCTCCTCCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGACCAACGTGTACGACACCACCCTCGCCATGTACGAGGTGATCAAGGCCGGCGGCTTCACCAAGGGCGGCCTCAACTTCGACGCCAAGGTGCGCCGCGCCTCCTACAAGGTGGAGGACCTCTTCATCGGCCACATCGCCGGCATGGACACCTTCGCCCTCGGCTTCAAGGTGGCCTACAAGCTCGTGAAGGACGGCGTGCTCGACAAGTTCATCGAGGAGAAGTACCGCTCCTTCCGCGAGGGCATCGGCCGCGACATCGTGGAGGGCAAGGTGGACTTCGAGAAGCTGGAGGAGTACATCATCGACAAGGAGACCATCGAGCTGCCGTCCGGCAAGCAGGAGTACCTGGAGTCCCTCATCAACTCCTACATCGTGAAGACCATCCTGGAGCTGCGCTGApNOV4836那不勒斯栖热袍菌葡萄糖异构酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO44)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRIPMAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFLIEPKPKPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGL
NFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKVAYKLVKDGVLDKFIEEKYRSFREGIGRDIVEGKVDFEKLEEYIIDKETIELPSGKQEYLESLINSYIVKTILELRAspergillus shirousamiα-淀粉酶/葡糖淀粉酶融合氨基酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO45)ATPADWRSQSIYFLLTDRFARTDGSTTATCNTADQKYCGGTWQGIIDKLDYIQGMGFTAIWITPVTAQLPQTTAYGDAYHGYWQQDIYSLNENYGTADDLKALSSALHERGMYLMVDVVANHMGYDGAGSSVDYSVFKPFSSQDYFHPFCFIQNYEDQTQVEDCWLGDNTVSLPDLDTTKDVVKNEWYDWVGSLVSNYSIDGLRIDTVKHVQKDFWPGYNKAAGVYCIGEVLDVDPAYTCPYQNVMDGVLNYPIYYPLLNAFKSTSGSMDDLYNMINTVKSDCPDSTLLGTFVENHDNPRFASYTNDIALAKNVAAFIILNDGIPIIYAGQEQHYAGGNDPANREATWLSGYPTDSELYKLIASANAIRNYAISKDTGFVTYKNWPIYKDDTTIAMRKGTDGSQIVTILSNKGASGDSYTLSLSGAGYTAGQQLTEVIGCTFVTVGSDGNVPVPMAGGLPRVLYPTEKLAGSKICSSSKPATLDSWLSNEATVARTAILNNIGADGAWVSGADSGIVVASPSTDNPDYFYTWTRDSGIVLKTLVDLFRNGDTDLLSTIEHYISSQAIIQGVSNPSGDLSSGGLGEPKFNVDETAYAGSWGRPQRDGPALRATAMIGFGQWLLDNGYTSAATEIVWPLVRNDLSYVAQYWNQTGYDLWEEVNGSSFFTIAVQHRALVEGSAFATAVGSSCSWCDSQAPQILCYLQSFWTGSYILANFDSSRSGKDTNTLLGSIHTFDPEAGCDDSTFQPCSPRALANHKEVVDSFRSIYTLNDGLSDSEAVAVGRYPEDSYYNGNPWFLCTLAAAEQLYDALYQWDKQGSLEIIDVSLDFFKALYSGAATGTYSSSSSTYSSIVSAVKTFADGFVSIVETHAASNGSLSEQFDKSDGDELSARDLTWSYAALLTANNRRNSVVPPSWGETSASSVPGTCAATSASGTYSSVTVTSWPSIVATGGTTTTATTTGSGGVTSTSKTTTTASKTSTTTSSTSCTTPTAVAVTFDLTATTTYGENTYLVGSISQLGDWETSDGIALSADKYTSSNPPWYVTVTLPAGESFEYKFIRVESDDSVEWESDPNREYTVPQACGESTATVTDTWRAspergillus shirousamiα-淀粉酶/葡糖淀粉酶融合玉米优化核酸序列(不含信号序列)(SEQ IDNO46)GCCACCCCGGCCGACTGGCGCTCCCAGTCCATCTACTTCCTCCTCACCGACCGCTTCGCCCGCACCGACGGCTCCACCACCGCCACCTGCAACACCGCCGACCAGAAGTACTGCGGCGGCACCTGGCAGGGCATCATCGACAAGCTCGACTACATCCAGGGCATGGGCTTCACCGCCATCTGGATCACCCCGGTGACCGCCCAGCTCCCGCAGACCACCGCCTACGGCGACGCCTACCACGGCTACTGGCAGCAGGACATCTACTCCCTCAACGAGAACTACGGCACCGCCGACGACCTCAAGGCCCTCTCCTCCGCCCTCCACGAGCGCGGCATGTACCTCATGGTGGACGTGGTGGCCAACCACATGGGCTACGACGGCGCCGGCTCCTCCGTGGACTACTCCGTGTTCAAGCCGTTCTCCTCCCAGGACTACTTCCACCCGTTCTGCTTCATCCAGAACTACGAGGACCAGACCCAGGTGGAGGACTGCTGGCTCGGCGACAACACCGTGTCCCTCCCGGACCTCGACACCACCAAGGACGTGGTGAAGAACGAGTGGTACGACTGGGTGGGCTCCCTCGTGTCCAACTACTCCATCGACGGCCTCCGCATCGACACCGTGAAGCACGTGCAGAAGGACTTCTGGCCGGGC
TACAACAAGGCCGCCGGCGTGTACTGCATCGGCGAGGTGCTCGACGTGGACCCGGCCTACACCTGCCCGTACCAGAACGTGATGGACGGCGTGCTCAACTACCCGATCTACTACCCGCTCCTCAACGCCTTCAAGTCCACCTCCGGCTCGATGGACGACCTCTACAACATGATCAACACCGTGAAGTCCGACTGCCCGGACTCCACCCTCCTCGGCACCTTCGTGGAGAACCACGACAACCCGCGCTTCGCCTCCTACACCAACGACATCGCCCTCGCCAAGAACGTGGCCGCCTTCATCATCCTCAACGACGGCATCCCGATCATCTACGCCGGCCAGGAGCAGCACTACGCCGGCGGCAACGACCCGGCCAACCGCGAGGCCACCTGGCTCTCCGGCTACCCGACCGACTCCGAGCTGTACAAGCTCATCGCCTCCGCCAACGCCATCCGCAACTACGCCATCTCCAAGGACACCGGCTTCGTGACCTACAAGAACTGGCCGATCTACAAGGACGACACCACCATCGCCATGCGCAAGGGCACCGACGGCTCCCAGATCGTGACCATCCTCTCCAACAAGGGCGCCTCCGGCGACTCCTACACCCTCTCCCTCTCCGGCGCCGGCTACACCGCCGGCCAGCAGCTCACCGAGGTGATCGGCTGCACCACCGTGACCGTGGGCTCCGACGGCAACGTGCCGGTGCCGATGGCCGGCGGCCTCCCGCGCGTGCTCTACCCGACCGAGAAGCTCGCCGGCTCCAAGATATGCTCCTCCTCCAAGCCGGCCACCCTCGACTCCTGGCTCTCCAACGAGGCCACCGTGGCCCGCACCGCCATCCTCAACAACATCGGCGCCGACGGCGCCTGGGTGTCCGGCGCCGACTCCGGCATCGTGGTGGCCTCCCCGTCCACCGACAACCCGGACTACTTCTACACCTGGACCCGCGACTCCGGCATCGTGCTCAAGACCCTCGTGGACCTCTTCCGCAACGGCGACACCGACCTCCTCTCCACCATCGAGCACTACATCTCCTCCCAGGCCATCATCCAGGGCGTGTCCAACCCGTCCGGCGACCTCTCCTCCGGCGGCCTCGGCGAGCCGAAGTTCAACGTGGACGAGACCGCCTACGCCGGCTCCTGGGGCCGCCCGCAGCGCGACGGCCCGGCCCTCCGCGCCACCGCCATGATCGGCTTCGGCCAGTGGCTCCTCGACAACGGCTACACCTCCGCCGCCACCGAGATCGTGTGGCCGCTCGTGCGCAACGACCTCTCCTACGTGGCCCAGTACTGGAACCAGACCGGCTACGACCTCTGGGAGGAGGTGAACGGCTCCTCCTTCTTCACCATCGCCGTGCAGCACCGCGCCCTCGTGGAGGGCTCCGCCTTCGCCACCGCCGTGGGCTCCTCCTGCTCCTGGTGCGACTCCCAGGCCCCGCAGATCCTCTGCTACCTCCAGTCCTTCTGGACCGGCTCCTACATCCTCGCCAACTTCGACTCCTCCCGCTCCGGCAAGGACACCAACACCCTCCTCGGCTCCATCCACACCTTCGACCCGGAGGCCGGCTGCGACGACTCCACCTTCCAGCCGTGCTCCCCGCGCGCCCTCGCCAACCACAAGGAGGTGGTGGACTCCTTCCGCTCCATCTACACCCTCAACGACGGCCTCTCCGACTCCGAGGCCGTGGCCGTGGGCCGCTACCCGGAGGACTCCTACTACAACGGCAACCCGTGGTTCCTCTGCACCCTCGCCGCCGCCGAGCAGCTCTACGACGCCCTCTACCAGTGGGACAAGCAGGGCTCCCTGGAGATCACCGACGTGTCCCTCGACTTCTTCAAGGCCCTCTACTCCGGCGCCGCCACCGGCACCTACTCCTCCTCCTCCTCCACCTACTCCTCCATCGTGTCCGCCGTGAAGACCTTCGCCGACGGCTTCGTGTCCATCGTGGAGACCCACGCCGCCTCCAACGGCTCCCTCTCCGAGCAGTTCGACAAGTCCGACGGCGACGAGCTGTCCGCCCGCGACCTCACCTGGTCCTACGCCGCCCTCCTCACCGCCAACAACCGCCGCAACTCCGTGGTGCCGCCGTCCTGGGGCGAGACCTCCGCCTCCTCCGTGCCGGGCACCTGCGCCGCCACCTCCGCCTCCGGCACCTACTCCTCCGTGACCGTGACCTCCTGGCCGTCCATCGTGGCCACCGGCGGCACCACCA
CCACCGCCACCACCACCGGCTCCGGCGGCGTGACCTCCACCTCCAAGACCACCACCACCGCCTCCAAGACCTCCACCACCACCTCCTCCACCTCCTGCACCACCCCGACCGCCGTGGCCGTGACCTTCGACCTCACCGCCACCACCACCTACGGCGAGAACATCTACCTCGTGGGCTCCATCTCCCAGCTCGGCGACTGGGAGACCTCCGACGGCATCGCCCTCTCCGCCGACAAGTACACCTCCTCCAACCCGCCGTGGTACGTGACCGTGACCCTCCCGGCCGGCGAGTCCTTCGAGTACAAGTTCATCCGCGTGGAGTCCGACGACTCCGTGGAGTGGGAGTCCGACCCGAACCGCGAGTACACCGTGCCGCAGGCCTGCGGCGAGTCCACCGCCACCGTGACCGACACCTGGCGC热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobaterium thermosaecharolgticum)葡糖淀粉酶氨基酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO47)VLSGCSNNVSSIKIDRFNNISAVNGPGEEDTWASAQKQGVGTANNYVSRVWFTLANGAISEVYYPTIDTADVKEIKFIVTDGKSFVSDETKDAISKVEKFTDKSLGYKLVNTDKKGRYRITKEIFTDVKRNSLIMKAKFEALEGSIHDYKLYLAYDPHIKNQGSYNEGYVIKANNNEMLMAKRDNVYTALSSNIGWKGYSIGYYKVNDIMTDLDENKQMTKHYDSARGNIIEGAEIDLTKNSEFEIVLSFGGSDSEAAKTALETLGEDYNNLKNNYIDEWTKYCNTLNNFNGKANSLYYNSMMILKASEDKTNKGAYIASLSIPWGDGQRDDNTGGYHLVWSRDLYHVANAFIAAGDVDSANRSLDYLAKVVKDNGMIPQNTWISGKPYWTSIQLDEQADPIILSYRLKRYDLYDSLVKPLADFIIKIGPKTGQERWEEIGGYSPATMAAEVAGLTCAAYIAEQNKDYESAQKYQEKADNWQKLIDNLTYTENGPLGNGQYYIRIAGLSDPNADFMINIANGGGVYDQKEIVDPSFLELVRLGVKSADDPKILNTLKVVDSTIKVDTPKGPSWYRYNHDGYGEPSKTELYHGAGKGRLWPLLTGERGMYEIAAGKDATPYVKAMEKFANEGGIISEQVWEDTGLPTDSASPLNWAHAEYVILFASNIEHKVLDMPDIVY热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobaterium thermosaccharolgticum)葡糖淀粉酶玉米优化核酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO48)GTGCTCTCCGGCTGCTCCAACAACGTGTCCTCCATCAAGATCGACCGCTTCAACAACATCTCCGCCGTGAACGGCCCGGGCGAGGAGGACACCTGGGCCTCCGCCCAGAAGCAGGGCGTGGGCACCGCCAACAACTACGTGTCCCGCGTGTGGTTCACCCTCGCCAACGGCGCCATCTCCGAGGTGTACTACCCGACCATCGACACCGCCGACGTGAAGGAGATCAAGTTCATCGTGACCGACGGCAAGTCCTTCGTGTCCGACGAGACCAAGGACGCCATCTCCAAGGTGGAGAAGTTCACCGACAAGTCCCTCGGCTACAAGCTCGTGAACACCGACAAGAAGGGCCGCTACCGCATCACCAAGGAAATCTTCACCGACGTGAAGCGCAACTCCCTCATCATGAAGGCCAAGTTCGAGGCCCTCGAGGGCTCCATCCACGACTACAAGCTCTACCTCGCCTACGACCCGCACATCAAGAACCAGGGCTCCTACAACGAGGGCTACGTGATCAAGGCCAACAACAACGAGATGCTCATGGCCAAGCGCGACAACGTGTACACCGCCCTCTCCTCCAACATCGGCTGGAAGGGCTACTCCATCGGCTACTACAAGGTGAACGACATCATGACCGACCTCGACGAGAACAAGCAGATGACCAAGCACTACGACTCCGCCCGCGGCAACATCATCGAGGGCGCCGAGATCGAC
CTCACCAAGAACTCCGAGTTCGAGATCGTGCTCTCCTTCGGCGGCTCCGACTCCGAGGCCGCCAAGACCGCCCTCGAGACCCTCGGCGAGGACTACAACAACCTCAAGAACAACTACATCGACGAGTGGACCAAGTACTGCAACACCCTCAACAACTTCAACGGCAAGGCCAACTCCCTCTACTACAACTCCATGATGATCCTCAAGGCCTCCGAGGACAAGACCAACAAGGGCGCCTACATCGCCTCCCTCTCCATCCCGTGGGGCGACGGCCAGCGCGACGACAACACCGGCGGCTACCACCTCGTGTGGTCCCGCGACCTCTACCACGTGGCCAACGCCTTCATCGCCGCCGGCGACGTGGACTCCGCCAACCGCTCCCTCGACTACCTCGCCAAGGTGGTGAAGGACAACGGCATGATCCCGCAGAACACCTGGATCTCCGGCAAGCCGTACTGGACCTCCATCCAGCTCGACGAGCAGGCCGACCCGATCATCCTCTCCTACCGCCTCAAGCGCTACGACCTCTACGACTCCCTCGTGAAGCCGCTCGCCGACTTCATCATCAAGATCGGCCCGAAGACCGGCCAGGAGCGCTGGGAGGAGATCGGCGGCTACTCCCCGGCCACGATGGCCGCCGAGGTGGCCGGCCTCACCTGCGCCGCCTACATCGCCGAGCAGAACAAGGACTACGAGTCCGCCCAGAAGTACCAGGAGAAGGCCGACAACTGGCAGAAGCTCATCGACAACCTCACCTACACCGAGAACGGCCCGCTCGGCAACGGCCAGTACTACATCCGCATCGCCGGCCTCTCCGACCCGAACGCCGACTTCATGATCAACATCGCCAACGGCGGCGGCGTGTACGACCAGAAGGAGATCGTGGACCCGTCCTTCCTCGAGCTGGTGCGCCTCGGCGTGAAGTCCGCCGACGACCCGAAGATCCTCAACACCCTCAAGGTGGTGGACTCCACCATCAAGGTGGACACCCCGAAGGGCCCGTCCTGGTATCGCTACAACCACGACGGCTACGGCGAGCCGTCCAAGACCGAGCTGTACCACGGCGCCGGCAAGGGCCGCCTCTGGCCGCTCCTCACCGGCGAGCGCGGCATGTACGAGATCGCCGCCGGCAAGGACGCCACCCCGTACGTGAAGGCGATGGAGAAGTTCGCCAACGAGGGCGGCATCATCTCCGAGCAGGTGTGGGAGGACACCGGCCTCCCGACCGACTCCGCCTCCCCGCTCAACTGGGCCCACGCCGAGTACGTGATCCTCTTCGCCTCCAACATCGAGCACAAGGTGCTCGACATGCCGGACATCGTGTAC米根霉(Rhizopus oryzae)葡糖淀粉酶氨基酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO49)ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVTYADGSDNWNNNGNTIAASYSAPISGSNYEYWTFSASINGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTSKPTTTTATATTTTAPSTSTTTPPSRSEPATFPTGNSTISSWIKKQEGISRFAMLRNINPPGSATGFIAASLSTAGPDYYYAWTRDAALTSNVIVYEYNTTLSGNKTILNVLKDYVTFSVKTQSTSTVCNCLGEPKFNPDASGYTGAWGRPQNDGPAERATTFILFADSYLTQTKDASYVTGTLKPAIFKDLDYVVNVWSNGCFDLWEEVNGVHFYTLMVMRKGLLLGADFAKRNGDSTRASTYSSTASTIANKISSFWVSSNNWIQVSQSVTGGVSKKGLDVSTLLAANLGSVDDGFFTPGSEKILATAVAVEDSFASLYPINKNLPSYLGNSIGRYPEDTYNGNGNSQGNSWFLAVTGYAELYYRAIKEWIGNGGVTVSSISLPFFKKFDSSATSGKKYTVGTSDFNNLAQNLALAADRFLSTVQLHAHNNGSLAEEFDRTTGLSTGARDLTWSHASLITASYAKAGAPAA
米根霉葡糖淀粉酶玉米优化核酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO50)GCCTCCATCCCGTCCTCCGCCTCCGTGCAGCTCGACTCCTACAACTACGACGGCTCCACCTTCTCCGGCAAAATCTACGTGAAGAACATCGCCTACTCCAAGAAGGTGACCGTGATCTACGCCGACGGCTCCGACAACTGGAACAACAACGGCAACACCATCGCCGCCTCCTACTCCGCCCCGATCTCCGGCTCCAACTACGAGTACTGGACCTTCTCCGCCTCCATCAACGGCATCAAGGAGTTCTACATCAAGTACGAGGTGTCCGGCAAGACCTACTACGACAACAACAACTCCGCCAACTACCAGGTGTCCACCTCCAAGCCGACCACCACCACCGCCACCGCCACCACCACCACCGCCCCGTCCACCTCCACCACCACCCCGCCGTCCCGCTCCGAGCCGGCCACCTTCCCGACCGGCAACTCCACCATCTCCTCCTGGATCAAGAAGCAGGAGGGCATCTCCCGCTTCGCCATGCTCCGCAACATCAACCCGCCGGGCTCCGCCACCGGCTTCATCGCCGCCTCCCTCTCCACCGCCGGCCCGGACTACTACTACGCCTGGACCCGCGACGCCGCCCTCACCTCCAACGTGATCGTGTACGAGTACAACACCACCCTCTCCGGCAACAAGACCATCCTCAACGTGCTCAAGGACTACGTGACCTTCTCCGTGAAGACCCAGTCCACCTCCACCGTGTGCAACTGCCTCGGCGAGCCGAAGTTCAACCCGGACGCCTCCGGCTACACCGGCGCCTGGGGCCGCCCGCAGAACGACGGCCCGGCCGAGCGCGCCACCACCTTCATCCTCTTCGCCGACTCCTACCTCACCCAGACCAAGGACGCCTCCTACGTGACCGGCACCCTCAAGCCGGCCATCTTCAAGGACCTCGACTACGTGGTGAACGTGTGGTCCAACGGCTGCTTCGACCTCTGGGAGGAGGTGAACGGCGTGCACTTCTACACCCTCATGGTGATGCGCAAGGGCCTCCTCCTCGGCGCCGACTTCGCCAAGCGCAACGGCGACTCCACCCGCGCCTCCACCTACTCCTCCACCGCCTCCACCATCGCCAACAAAATCTCCTCCTTCTGGGTGTCCTCCAACAACTGGATACAGGTGTCCCAGTCCGTGACCGGCGGCGTGTCCAAGAAGGGCCTCGACGTGTCCACCCTCCTCGCCGCCAACCTCGGCTCCGTGGACGACGGCTTCTTCACCCCGGGCTCCGAGAAGATCCTCGCCACCGCCGTGGCCGTGGAGGACTCCTTCGCCTCCCTCTACCCGATCAACAAGAACCTCCCGTCCTACCTCGGCAACTCCATCGGCCGCTACCCGGAGGACACCTACAACGGCAACGGCAACTCCCAGGGCAACTCCTGGTTCCTCGCCGTGACCGGCTACGCCGAGCTGTACTACCGCGCCATCAAGGAGTGGATCGGCAACGGCGGCGTGACCGTGTCCTCCATCTCCCTCCCGTTCTTCAAGAAGTTCGACTCCTCCGCCACCTCCGGCAAGAAGTACACCGTGGGCACCTCCGACTTCAACAACCTCGCCCAGAACATCGCCCTCGCCGCCGACCGCTTCCTCTCCACCGTGCAGCTCCACGCCCACAACAACGGCTCCCTCGCCGAGGAGTTCGACCGCACCACCGGCCTCTCCACCGGCGCCCGCGACCTCACCTGGTCCCACGCCTCCCTCATCACCGCCTCCTACGCCAAGGCCGGCGCCCCGGCCGCC玉米α-淀粉酶氨基酸序列(SEQ ID NO51)MAKHLAAMCWCSLLVLVLLCLGSQLAQSQVLFQGFNWESWKKQGGWYNYLLGRVDDIAATGATHVWLPQPSHSVAPQGYMPGRLYDLDASKYGTHAELKSLTAAFHAKGVQCVADVVINHRCADYKDGRGIYCVFEGGTPDSRLDWGPDMICSDDTQYSNGRGHRDTGADFAAAPDDIHL
NPRVQQELSDWLNWLKSDLGFDGWRLDFAKGYSAAVAKVYVDSTAPTFVVAEIWSSLHYDGNGEPSSNQDADRQELVNWAQAVGGPAAAFDFTTKGVLQAAVQGELWRMKDGNGKAPGMIGWLPEKAVTFVDNHDTGSTQNSWPFPSDKVMQGYAYILTHPGTPCIFYDHVFDWNLKQEISALSAVRSRNGIHPGSELNILAADGDLYVAKIDDKVIVKIGSRYDVGNLIPSDFHAVAHGNNYCVWEKHGLRVPAGRHH玉米α-淀粉酶核酸序列(SEQ ID NO52)ATGGCGAAGCACTTGGCTGCCATGTGCTGGTGCAGCCTCCTAGTGCTTGTACTGCTCTGCTTGGGCTCCCAGCTGGCCCAATCCCAGGTCCTCTTCCAGGGGTTCAACTGGGAGTCGTGGAAGAAGCAAGGTGGGTGGTACAACTACCTCCTGGGGCGGGTGGACGACATCGCCGCGACGGGGGCCACGCACGTCTGGCTCCCGCAGCCGTCGCACTCGGTGGCGCCGCAGGGGTACATGCCCGGCCGGCTCTACGACCTGGACGCGTCCAAGTACGGCACCCACGCGGAGCTCAAGTCGCTCACCGCGGCGTTCCACGCCAAGGGCGTCCAGTGCGTCGCCGACGTCGTGATCAACCACCGCTGCGCCGACTACAAGGACGGCCGCGGCATCTACTGCGTCTTCGAGGGCGGCACGCCCGACAGCCGCCTCGACTGGGGCCCCGACATGATCTGCAGCGACGACACGCAGTACTCCAACGGGCGCGGGCACCGCGACACGGGGGCCGACTTCGCCGCCGCGCCCGACATCGACCACCTCAACCCGCGCGTGCAGCAGGAGCTCTCGGACTGGCTCAACTGGCTCAAGTCCGACCTCGGCTTCGACGGCTGGCGCCTCGACTTCGCCAAGGGCTACTCCGCCGCCGTCGCCAAGGTGTACGTCGACAGCACCGCCCCCACCTTCGTCGTCGCCGAGATATGGAGCTCCCTCCACTACGACGGCAACGGCGAGCCGTCCAGCAACCAGGACGCCGACAGGCAGGAGCTGGTCAACTGGGCGCAGGCGGTGGGCGGCCCCGCCGCGGCGTTCGACTTCACCACCAAGGGCGTGCTGCAGGCGGCCGTCCAGGGCGAGCTGTGGCGCATGAAGGACGGCAACGGCAAGGCGCCCGGGATGATCGGCTGGCTGCCGGAGAAGGCCGTCACGTTCGTCGACAACCACGACACCGGCTCCACGCAGAACTCGTGGCCATTCCCCTCCGACAAGGTCATGCAGGGCTACGCCTATATCCTCACGCACCCAGGAACTCCATGCATCTTCTACGACCACGTTTTCGACTGGAACCTGAAGCAGGAGATCAGCGCGCTGTCTGCGGTGAGGTCAAGAAACGGGATCCACCCGGGGAGCGAGCTGAACATCCTCGCCGCCGACGGGGATCTCTACGTCGCCAAGATTGACGACAAGGTCATCGTGAAGATCGGGTCACGGTACGACGTCGGGAACCTGATCCCCTCAGACTTCCACGCCGTTGCCCCTGGCAACAACTACTGCGTTTGGGAGAAGCACGGTCTGAGAGTTCCAGCGGGGCGGCACCACTAG粗淀粉结合位点氨基酸序列(SEQ ID NO53)ATGGTTTTATTTGSGGVTSTSKTTTTASKTSTTTSSTSCTTPTAV粗淀粉结合位点玉米优化核酸序列(SEQ ID NO54)
GCCACCGGCGGCACCACCACCACCGCCACCACCACCGGCTCCGGCGGCGTGACCTCCACCTCCAAGACCACCACCACCGCCTCCAAGACCTCCACCACCACCTCCTCCACCTCCTGCACCACCCCGACCGCCGTGTC激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)EGLA氨基酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO55)IYFVEKYHTSEDKSTSNTSSTPPQTTLSTTKVLKIRYPDDGEWPGAPIDKDGDGNPEFYIEINLWNILNATGFAEMTYNLTSGVLHYVQQLDNIVLRDRSNWVHGYPEIFYGNKPWNANYATDGPIPLPSKVSNLTDFYLTISYKLEPKNGLPINFAIESWLTREAWRTTGINSDEQEVMIWIYYDGLQPAGSKVKEIVVPIIVNGTPVNATFEVWKANIGWEYVAFRIKTPIKEGTVTIPYGAFISVAANISSLPNYTELYLEDVEIGTEFGTPSTTSAHLEWWITNITLTPLDRPLIS激烈火球菌EGLA玉米优化核酸序列(不含信号序列)(SEQ ID NO56)ATCTACTTCGTGGAGAAGTACCACACCTCCGAGGACAAGTCCACCTCCAACACCTCCTCCACCCCGCCGCAGACCACCCTCTCCACCACCAAGGTGCTCAAGATCCGCTACCCGGACGACGGCGAGTGGCCCGGCGCCCCGATCGACAAGGACGGCGACGGCAACCCGGAGTTCTACATCGAGATCAACCTCTGGAACATCCTCAACGCCACCGGCTTCGCCGAGATGACCTACAACCTCACTAGTGGCGTGCTCCACTACGTGCAGCAGCTCGACAACATCGTGCTCCGCGACCGCTCCAACTGGGTGCACGGCTACCCGGAAATCTTCTACGGCAACAAGCCGTGGAACGCCAACTACGCCACCGACGGCCCGATCCCGCTCCCGTCCAAGGTGTCCAACCTCACCGACTTCTACCTCACCATCTCCTACAAGCTCGAGCCGAAGAACGGTCTCCCGATCAACTTCGCCATCGAGTCCTGGCTCACCCGCGAGGCCTGGCGCACCACCGGCATCAACTCCGACGAGCAGGAGGTGATGATCTGGATCTACTACGACGGCCTCCAGCCCGCGGGCTCCAAGGTGAAGGAGATCGTGGTGCCGATCATCGTGAACGGCACCCCGGTGAACGCCACCTTCGAGGTGTGGAAGGCCAACATCGGCTGGGAGTACGTGGCCTTCCGCATCAAGACCCCGATCAAGGAGGGCACCGTGACCATCCCGTACGGCGCCTTCATCTCCGTGGCCGCCAACATCTCCTCCCTCCCGAACTACACCGAGAAGTACCTCGAGGACGTGGAGATCGGCACCGAGTTCGGCACCCCGTCCACCACCTCCGCCCACCTCGAGTGGTGGATCACCAACATCACCCTCACCCCGCTCGACCGCCCGCTCATCTCCTAG黄栖热菌(Thermus flavus)木糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID NO57)MYEPKPEHRFTFGLWTVDNVDRDPFGDTVRERLDPVYVVHKLAELGAYGVNLHDEDLIPRGTPPQERDQIVRRFKKALDETVLKVPMVTANLFSEPAFRDGASTTRDPWVWAYALRKSLETMDLGAELGAEIYMFWMVRERSEVESTDKTRKVWDWVRETLNFMTAYTEDQGYGYRFSVEPKPNEPRGDIYFTTVGSMLALIHTLDRPER
FGLNPEFAHETMAGLNFDHAVAQAVDAGKLFHIDLNDQRMSRFDQDLRFGSENLKAGFFLVDLLESSGYQGPRHFEAHALRTEDEEGVWTFVRVCMRTYLIIKVRAETFREDPEVKELLAAYYQEDPATLALLDPYSREKAEALKRAELPLETKRRRGYALERLDQLAVEYLLGVRGpNOV4800核苷酸序列(Amy32B信号序列和EGLA)(SEQ ID NO58)ATGGGGAAGAACGGCAACCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTTCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCCGGCCATCAAATCTACTTCGTGGAGAAGTACCACACCTCCGAGGACAAGTCCACCTCCAACACCTCCTCCACCCCGCCGCAGACCACCCTCTCCACCACCAAGGTGCTCAAGATCCGCTACCCGGACGACGGTGAGTGGCCCGGCGCCCCGATCGACAAGGACGGCGACGGCAACCCGGAGTTCTACATCGAGATCAACCTCTGGAACATCCTCAACGCCACCGGCTTCGCCGAGATGACCTACAACCTCACTAGTGGCGTGCTCCACTACGTGCAGCAGCTCGACAACATCGTGCTCCGCGACCGCTCCAACTGGGTGCACGGCTACCCGGAAATCTTCTACGGCAACAAGCCGTGGAACGCCAACTACGCCACCGACGGCCCGATCCCGCTCCCGTCCAAGGTGTCCAACCTCACCGACTTCTACCTCACCATCTCCTACAAGCTCGAGCCGAAGAACGGTCTCCCGATCAACTTCGCCATCGAGTCCTGGCTCACCCGCGAGGCCTGGCGCACCACCGGCATCAACTCCGACGAGCAGGAGGTGATGATCTGGATCTACTACGACGGCCTCCAGCCCGCGGGCTCCAAGGTGAAGGAGATCGTGGTGCCGATCATCGTGAACGGCACCCCGGTGAACGCCACCTTCGAGGTGTGGAAGGCCAACATCGGCTGGGAGTACGTGGCCTTCCGCATCAAGACCCCGATCAAGGAGGGCACCGTGACCATCCCGTACGGCGCCTTCATCTCCGTGGCCGCCAACATCTCCTCCCTCCCGAACTACACCGAGAAGTACCTCGAGGACGTGGAGATCGGCACCGAGTTCGGCACCCCGTCCACCACCTCCGCCCACCTCGAGTGGTGGATCACCAACATCACCCTCACCCCGCTCGACCGCCCGCTCATCTCCTAG黑色曲霉(Aspergillus niger)玉米优化核酸(SEQ ID NO59)ATGTCCTTCCGCTCCCTCCTCGCCCTCTCCGGCCTCGTGTGCACCGGCCTCGCCAACGTGATCTCCAAGCGCGCCACCCTCGACTCCTGGCTCTCCAACGAGGCCACCGTGGCCCGCACCGCCATCCTCAACAACATCGGCGCCGACGGCGCCTGGGTGTCCGGCGCCGACTCCGGCATCGTGGTGGCCTCCCCGTCCACCGACAACCCGGACTACTTCTACACCTGGACCCGCGACTCCGGCCTCGTGCTCAAGACCCTCGTGGACCTCTTCCGCAACGGCGACACCTCCCTCCTCTCCACCATCGAGAACTACATCTCCGCCCAGGCCATCGTGCAGGGCATCTCCAACCCGTCCGGCGACCTCTCCTCCGGCGCCGGCCTCGGCGAGCCGAAGTTCAACGTGGACGAGACCGCCTACACCGGCTCCTGGGGCCGCCCGCAGCGCGACGGCCCGGCCCTCCGCGCCACCGCCATGATCGGCTTCGGCCAGTGGCTCCTCGACAACGGCTACACCTCCACCGCCACCGACATCGTGTGGCCGCTCGTGCGCAACGACCTCTCCTACGTGGCCCAGTACTGGAACCAGACCGGCTACGACCTCTGGGAGGAGGTGAACGGCTCCTCCTTCTTCACCATCGCCGTGCAGCACCGCGCC
CTCGTGGAGGGCTCCGCCTTCGCCACCGCCGTGGGCTCCTCCTGCTCCTGGTGCGACTCCCAGGCCCCGGAGATCCTCTGCTACCTCCAGTCCTTCTGGACCGGCTCCTTCATCCTCGCCAACTTCGACTCCTCCCGCTCCGGCAAGGACGCCAACACCCTCCTCGGCTCCATCCACACCTTCGACCCGGAGGCCGCCTGCGACGACTCCACCTTCCAGCCGTGCTCCCCGCGCGCCCTCGCCAACCACAAGGAGGTGGTGGACTCCTTCCGCTCCATCTACACCCTCAACGACGGCCTCTCCGACTCCGAGGCCGTGGCCGTGGGCCGCTACCCGGAGGACACCTACTACAACGGCAACCCGTGGTTCCTCTGCACCCTCGCCGCCGCCGAGCAGCTCTACGACGCCCTCTACCAGTGGGACAAGCAGGGCTCCCTCGAGGTGACCGACGTGTCCCTCGACTTCTTCAAGGCCCTCTACTCCGACGCCGCCACCGGCACCTACTCCTCCTCCTCCTCCACCTACTCCTCCATCGTGGACGCCGTGAAGACCTTCGCCGACGGCTTCGTGTCCATCGTGGAGACCCACGCCGCCTCCAACGGCTCCATGTCCGAGCAGTACGACAAGTCCGACGGCGAGCAGCTCTCCGCCCGCGACCTCACCTGGTCCTACGCCGCCCTCCTCACCGCCAACAACCGCCGCAACTCCGTGGTGCCGGCCTCCTGGGGCGAGACCTCCGCCTCCTCCGTGCCGGGCACCTGCGCCGCCACCTCCGCCATCGGCACCTACTCCTCCGTGACCGTGACCTCCTGGCCGTCCATCGTGGCCACCGGCGGCACCACCACCACCGCCACCCCGACCGGCTCCGGCTCCGTGACCTCCACCTCCAAGACCACCGCCACCGCCTCCAAGACCTCCACCTCCACCTCCTCCACCTCCTGCACCACCCCGACCGCCGTGGCCGTGACCTTCGACCTCACCGCCACCACCACCTACGGCGAGAACATCTACCTCGTGGGCTCCATCTCCCAGCTCGGCGACTGGGAGACCTCCGACGGCATCGCCCTCTCCGCCGACAAGTACACCTCCTCCGACCCGCTCTGGTACGTGACCGTGACCCTCCCGGCCGGCGAGTCCTTCGAGTACAAGTTCATCCGCATCGAGTCCGACGACTCCGTGGAGTGGGAGTCCGACCCGAACCGCGAGTACACCGTGCCGCAGGCCTGCGGCACCTCCACCGCCACCGTGACCGACACCTGGCGC
权利要求
1.分离的多核苷酸，其a)含有SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52，或59或其互补序列，或在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52，或59任一序列的互补序列杂交并且编码具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶或葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，或b)编码含有SEQ ID NO10，13，14，15，16，18，20，24，26，27，28，29，30，33，34，35，36，38，40，42，44，45，47，49或51或其酶活性片段的多肽。
2.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸编码含有第一多肽和第二肽的融合多肽，其中所述第一多肽具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶或葡糖淀粉酶活性。
3.权利要求2的分离多核苷酸，其中所述第二肽含有信号序列肽。
4.权利要求3的分离多核苷酸，其中所述信号序列肽将所述第一多肽靶向植物的液泡，内质网，叶绿体，淀粉颗粒，种子或细胞壁。
5.权利要求3的分离多核苷酸，其中所述信号序列是waxy的N末端信号序列，γ-玉米醇溶蛋白的N末端信号序列，淀粉结合域或C末端淀粉结合域。
6.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO2，9，或52任一序列的互补序列杂交，并且编码具有α-淀粉酶活性的多肽。
7.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO4或25任一序列的互补序列杂交，并且编码具有支链淀粉酶活性的多肽。
8.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ IDNO6的互补序列杂交，并且编码具有α-葡糖苷酶活性的多肽。
9.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列的互补序列杂交，并且编码具有葡萄糖异构酶活性的多肽。
10.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO46，48，50或59任一序列的互补序列杂交，并且编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。
11.含有SEQ ID NO2或9任何一个或其互补序列的分离多核苷酸。
12.含有SEQ ID NO4或25任何一个或其互补序列的分离多核苷酸。
13.含有SEQ ID NO6或其互补序列的分离多核苷酸。
14.含有SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列或其互补序列的分离多核苷酸。
15.含有SEQ ID NO46，48，50，或59任一序列或其互补序列的分离多核苷酸。
16.含有多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸a)具有SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52，或59或其互补序列，或在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO2，4，6，9，19，21，25，37，39，41，43，46，48，50，52，或59任一序列的互补序列杂交并且编码具有α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶或葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，或b)编码含有SEQ IDNO10，13，14，15，16，18，20，24，26，27，28，29，30，33，34，35，36，38，40，42，44，45，47，49或51或其酶活性片段的多肽。
17.权利要求16的表达盒，其与启动子可操作地相连。
18.权利要求17的表达盒，其中所述启动子为诱导型启动子。
19.权利要求17的表达盒，其中所述启动子为组织特异性启动子。
20.权利要求19的表达盒，其中所述启动子为胚乳特异性启动子。
21.权利要求20的表达盒，其中所述胚乳特异性启动子为玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子或玉米ADP-gpp启动子。
22.权利要求21的表达盒，其中所述启动子含有SEQ ID NO11或SEQ ID NO12。
23.权利要求16的表达盒，其中所述多核苷酸以相对于所述启动子的有义方向定向。
24.权利要求16的表达盒，其中所述a)多核苷酸还编码与该多核苷酸编码的多肽可操作地相连的信号序列。
25.权利要求24的表达盒，其中所述信号序列将所述可操作地相连的多肽导向植物的液泡，内质网，叶绿体，淀粉颗粒，种子或细胞壁。
26.权利要求25的表达盒，其中所述信号序列为waxy的N末端信号序列或γ-玉米醇溶蛋白的N末端信号序列。
27.权利要求25的表达盒，其中所述信号序列为淀粉结合域。
28.权利要求16的表达盒，其中所述b)多核苷酸与组织特异性启动子可操作地相连。
29.权利要求28的表达盒，其中所述组织特异性启动子为玉蜀黍(Zea mays)γ-玉米醇溶蛋白启动子或玉蜀黍ADP-gpp启动子。
30.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸含有SEQ ID NO2或9的任一序列或其互补序列。
31.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸含有SEQ ID NO6或其互补序列。
32.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸含有SEQ ID NO19，21，37，39，41，或43的任一序列或其互补序列。
33.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸含有SEQ ID NO46，48，50或59的任一序列或其互补序列。
34.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸含有SEQ ID NO4或25的任一序列或其互补序列。
35.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO10，13，14，15，16，24，26，27，28，29，30，33，34，35，36，38，40，42，44，45，47，49或51任一氨基酸序列或其酶活性片段的多肽。
36.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO10，13，14，15，16，33，35，或51任一氨基酸序列或其具有α-淀粉酶活性的活性片段的多肽。
37.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO3，24，或34任一氨基酸序列或其具有支链淀粉酶活性的活性片段的多肽。
38.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO5，26，或27任一氨基酸序列或其具有α-葡糖苷酶活性的活性片段的多肽。
39.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO18，20，28，29，30，38，40，42或44任一氨基酸序列或其具有葡萄糖异构酶活性的活性片段的多肽。
40.含有多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO45，47或49任一氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的活性片段的多肽。
41.含有权利要求16的表达盒的载体。
42.含有权利要求30-40任一项的表达盒的载体。
43.含有权利要求16的表达盒的细胞。
44.含有权利要求30-40任一项的表达盒的细胞。
45.权利要求44的细胞，其中所述细胞选自土壤杆菌属，单子叶植物细胞，双子叶植物细胞，Liliopsida细胞，Panicoideae细胞，玉米细胞，或谷类细胞。
46.权利要求45的细胞，其中所述细胞为玉米细胞。
47.权利要求45的细胞，其中所述细胞选自土壤杆菌属，单子叶植物细胞，双子叶植物细胞，Liliopsida细胞，Panicoideae细胞，玉米细胞，或谷类细胞。
48.权利要求47的细胞，其中所述细胞为玉米细胞。
49.用权利要求41的载体稳定转化的植物。
50.用权利要求42的载体稳定转化的植物。
51.用含有α-淀粉酶的载体稳定转化的植物，所述α-淀粉酶具有SEQ ID NO1，10，13，14，15，16，33或35的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO2或9的多核苷酸编码。
52.权利要求51的植物，其中所述α-淀粉酶是耐超高温的。
53.用含有支链淀粉酶的载体稳定转化的植物，所述支链淀粉酶具有SEQ ID NO24或34的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO4或25的多核苷酸编码。
54.用含有α-葡糖苷酶的载体稳定转化的植物，所述α-葡糖苷酶具有SEQ ID NO26或27的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO6的多核苷酸编码。
55.权利要求54的植物，其中所述α-葡糖苷酶是耐超高温的。
56.用含有葡萄糖异构酶的载体稳定转化的植物，所述葡萄糖异构酶具有SEQ ID NO18，20，28，29，30，38，40，42或44的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列的多核苷酸编码。
57.权利要求56的植物，其中所述α-葡糖苷酶是耐超高温的。
58.用含有葡糖淀粉酶的载体稳定转化的植物，所述葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO45，47或49的任一氨基酸序列，或由含有SEQ IDNO46，48，50或59任一序列的多核苷酸编码。
59.权利要求58的植物，其中所述葡糖淀粉酶是耐超高温的。
60.来自权利要求49的植物的种子，果实，或谷粒。
61.来自权利要求50的植物的种子，果实，或谷粒。
62.来自权利要求51的植物的种子，果实，或谷粒。
63.来自权利要求53的植物的种子，果实，或谷粒。
64.来自权利要求54的植物的种子，果实，或谷粒。
65.来自权利要求56的植物的种子，果实，或谷粒。
66.来自权利要求58的植物的种子，果实，或谷粒。
67.转化的植物，其基因组中增加了编码至少一种与启动子序列可操作地相连的加工酶的重组多核苷酸，所述多核苷酸的序列已被优化用于在植物内表达。
68.权利要求67的植物，其中所述植物为单子叶植物。
69.权利要求68的植物，其中所述单子叶植物为玉米。
70.权利要求67的植物，其中所述植物为双子叶植物。
71.权利要求67的植物，其中所述植物为谷类植物或商业种植植物。
72.权利要求67的植物，其中所述加工酶选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，葡聚糖酶，β-淀粉酶，α-葡糖苷酶，异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶，淀粉支链淀粉酶(amylopullulanase)，纤维素酶，外切-1，4-β-纤维二糖水解酶，外切-1，3-β-D-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶，内切葡聚糖酶，L-阿拉伯糖酶，α-阿拉伯糖苷酶，半乳聚糖酶，半乳糖苷酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，木糖苷酶，蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，酯酶，植酸酶和脂酶。
73.权利要求72的植物，其中所述加工酶是选自下述酶的淀粉加工酶α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，β-淀粉酶，α-葡糖苷酶，异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶和淀粉支链淀粉酶。
74.权利要求73的植物，其中所述酶选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶，和支链淀粉酶。
75.权利要求74的植物，其中所述酶是耐超高温的。
76.权利要求72的植物，其中所述酶是选自下述酶的非淀粉降解酶蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，酯酶，植酸酶和脂酶。
77.权利要求76的植物，其中所述酶是耐超高温的。
78.权利要求67的植物，其中所述酶在植物的液泡，内质网，叶绿体，淀粉颗粒，种子或细胞壁中积累。
79.权利要求78的植物，其中所述酶在内质网中积累。
80.权利要求78的植物，其中所述酶在淀粉颗粒中积累。
81.权利要求67的植物，其基因组还增加了含有非耐超高温酶的第二重组多核苷酸。
82.转化的植物，其基因组中增加了编码至少一种选自下述组的加工酶的重组多核苷酸α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶，和支链淀粉酶，所述多核苷酸与启动子序列可操作地相连，所述多核苷酸的序列已被优化用于在该植物内表达。
83.权利要求82的转化植物，其中所述加工酶是耐超高温的。
84.权利要求82的转化植物，其中所述植物为玉米。
85.转化的玉米植物，其基因组中增加了编码至少一种选自下述组的加工酶的重组多核苷酸α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶，和支链淀粉酶，所述多核苷酸与启动子序列可操作地相连，所述多核苷酸的序列已被优化用于在该玉米植物内表达。
86.权利要求85的转化玉米植物，其中所述加工酶是耐超高温的。
87.转化的植物，其基因组中增加了具有SEQ ID NO2，9或52的重组多核苷酸，该多核苷酸与启动子和信号序列可操作地相连。
88.转化的植物，其基因组中增加了具有SEQ ID NO4或25的重组多核苷酸，该多核苷酸与启动子和信号序列可操作地相连。
89.转化的植物，其基因组中增加了具有SEQ ID NO6的重组多核苷酸，该多核苷酸与启动子和信号序列可操作地相连。
90.转化的植物，其基因组中增加了具有SEQ ID NO19，21，37，39，41或43的重组多核苷酸。
91.转化的植物，其基因组中增加了具有SEQ ID NO46，48，50或59的重组多核苷酸。
92.权利要求82的转化植物的产物。
93.权利要求85的转化植物的产物。
94.权利要求87-91任一项的转化植物的产物。
95.权利要求92的产物，其中该产物为种子，果实或谷粒。
96.权利要求92的产物，其中该产物为加工酶，淀粉或糖。
97.从权利要求82的植物获得的植物。
98.从权利要求85的植物获得的植物。
99.从权利要求87-91任一项的植物获得的植物。
100.权利要求97的植物，其为杂交植物。
101.权利要求98的植物，其为杂交植物。
102.权利要求99的植物，其为杂交植物。
103.权利要求97的植物，其为近交植物。
104.权利要求98的植物，其为近交植物。
105.权利要求99的植物，其为近交植物。
106.含有至少一种加工酶的淀粉组合物，所述酶为蛋白酶，葡聚糖酶或酯酶。
107.权利要求106的淀粉组合物，其中所述酶是耐超高温的。
108.含有至少一种加工酶的谷物，所述酶为α-淀粉酶，支链淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶或葡萄糖异构酶。
109.权利要求108的谷物，其中所述酶是耐超高温的。
110.制备淀粉颗粒的方法，包括a)将含有至少一种非淀粉加工酶的谷物在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，产生含有淀粉颗粒和非淀粉降解产物的混合物，其中所述谷物获自转化的植物，其基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；和b)从混合物中分离出淀粉颗粒。
111.权利要求110的方法，其中所述酶为蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶，或酯酶。
112.权利要求111的方法，其中所述酶是耐超高温的。
113.权利要求110的方法，其中所述谷物为破裂的谷物。
114.权利要求110的方法，其中所述谷物在低含水量条件下处理。
115.权利要求110的方法，其中所述谷物在高含水量条件下处理。
116.权利要求110的方法，其中所述谷物用二氧化硫处理。
117.权利要求110的方法，进一步包括从混合物中分离非淀粉产物。
118.根据权利要求110的方法获得的淀粉。
119.根据权利要求112的方法获得的淀粉。
120.根据权利要求110的方法获得的非淀粉产物。
121.根据权利要求112的方法获得的非淀粉产物。
122.生产超甜玉米的方法，包括在活化所述至少一种酶的条件下，处理转化的玉米或其部分，所述玉米或其部分的基因组中增加了编码至少一种淀粉降解酶或淀粉异构化酶的表达盒，并在胚乳中表达该表达盒，以致将玉米中的多糖转化为糖，产生超甜玉米。
123.权利要求122的方法，其中所述表达盒还含有与编码所述酶的多核苷酸可操作地相连的启动子。
124.权利要求123的方法，其中所述启动子为组成型启动子。
125.权利要求123的方法，其中所述启动子为种子特异性启动子。
126.权利要求123的方法，其中所述启动子为胚乳特异性启动子。
127.权利要求123的方法，其中所述酶是耐超高温的。
128.权利要求127的方法，其中所述酶为α-淀粉酶。
129.权利要求122的方法，其中所述表达盒还含有编码与所述至少一种酶可操作地相连的信号序列的多核苷酸。
130.权利要求129的方法，其中所述信号序列将所述耐超高温酶导向质外体。
131.权利要求129的方法，其中所述信号序列将所述耐超高温酶导向内质网。
132.权利要求122的方法，其中所述酶含有SEQ ID NO13，14，15，16，33或35的任一序列。
133.生产超甜玉米的方法，包括在活化所述至少一种酶的条件下，处理转化的玉米或其部分，所述玉米或其部分的基因组中增加了编码α-淀粉酶的表达盒，并在胚乳中表达该表达盒，以致将玉米中的多糖转化为糖，产生超甜玉米。
134.权利要求133的方法，其中所述酶是耐超高温的。
135.权利要求134的方法，其中所述耐超高温α-淀粉酶含有SEQ ID NO10，13，14，15，16，33或35的任一氨基酸序列，或其具有α-淀粉酶活性的酶活性片段。
136.权利要求134的方法，其中所述表达盒含有选自SEQ IDNO2，9或52任一序列或其互补序列的多核苷酸，或者在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO2，9或52任一序列杂交，并且编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸。
137.制备水解的淀粉产物溶液的方法，包括a)将含有淀粉颗粒和至少一种加工酶的植物部分在活化所述至少一种酶的条件下处理，由此加工淀粉颗粒以形成含有水解的淀粉产物的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种淀粉加工酶的表达盒；以及b)收集含有水解的淀粉产物的水性溶液。
138.权利要求137的方法，其中所述水解的淀粉产物含有糊精，麦芽寡糖，糖和/或其混合物。
139.权利要求137的方法，其中所述酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，淀粉支链淀粉酶，葡萄糖异构酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶或其组合。
140.权利要求137的方法，其中所述至少一种加工酶是耐超高温的。
141.权利要求139的方法，其中所述至少一种加工酶是耐超高温的。
142.权利要求137的方法，其中所述植物部分的基因组中进一步增加了编码非耐超高温淀粉加工酶的表达盒。
143.权利要求142的方法，其中所述非耐超高温淀粉加工酶选自淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其组合。
144.权利要求137的方法，其中所述至少一种加工酶在胚乳内表达。
145.权利要求137的方法，其中所述植物部分为谷粒。
146.权利要求137的方法，其中所述植物部分来自玉米，小麦，大麦，黑麦，燕麦，甘蔗或稻。
147.权利要求137的方法，其中所述至少一种加工酶与启动子和信号序列可操作地相连，所述信号序列可将酶导向淀粉颗粒或内质网或细胞壁。
148.权利要求137的方法，进一步包括分离水解的淀粉产物。
149.权利要求137的方法，进一步包括发酵水解的淀粉产物。
150.制备水解的淀粉产物的方法，包括a)将含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分在活化所述至少一种酶的条件下处理，从而加工淀粉颗粒以形成含有水解的淀粉产物的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码至少一种α-淀粉酶的表达盒；以及b)收集含有水解的淀粉产物的水性溶液。
151.权利要求150的方法，其中所述α-淀粉酶是耐超高温的。
152.权利要求151的方法，其中所述耐超高温α-淀粉酶含有SEQ ID NO1，10，13，14，15，16，33或35任一氨基酸序列或其具有α-淀粉酶活性的活性片段。
153.权利要求151的方法，其中所述表达盒含有选自SEQ IDNO2，9，46或52任何序列或其互补序列的多核苷酸，或者在低严谨性杂交条件下与SEQ ID NO2，9，46或52的任一序列杂交并且编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸。
154.权利要求150的方法，其中所述转化植物的基因组进一步含有编码非耐热性淀粉加工酶的多核苷酸。
155.权利要求150的方法，进一步包括用非耐超高温淀粉加工酶处理植物部分。
156.转化的植物部分，其包含在植物细胞内存在的至少一种淀粉加工酶，其中所述植物部分获自转化的植物，所述转化的植物的基因组中增加了编码所述至少一种淀粉加工酶的表达盒。
157.权利要求156的植物部分，其中所述酶为选自下组的淀粉加工酶α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，β-淀粉酶，α-葡糖苷酶，异淀粉酶，支链淀粉酶，新支链淀粉酶，异支链淀粉酶和淀粉支链淀粉酶。
158.权利要求156的植物部分，其中所述酶是耐超高温的。
159.权利要求156的植物部分，其中所述植物为玉米。
160.转化的植物部分，其含有在植物细胞壁或细胞内存在的至少一种非淀粉加工酶，其中所述植物部分获自转化的植物，所述转化的植物的基因组中增加了编码所述至少一种非淀粉加工酶或至少一种非淀粉多糖加工酶的表达盒。
161.权利要求160的植物部分，其中所述酶是耐超高温的。
162.权利要求160的植物部分，其中所述非淀粉加工酶选自蛋白酶，葡聚糖酶，木聚糖酶，酯酶，植酸酶和脂酶。
163.权利要求156或160的植物部分，其为穗，种子，果实，谷粒，秸杆，谷壳或渣屑。
164.含有α-淀粉酶的转化的植物部分，所述α-淀粉酶具有SEQID NO1，10，13，14，15，16，33或35的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO2，9，46或52任一序列的多核苷酸编码。
165.含有α-葡糖苷酶的转化的植物部分，所述α-葡糖苷酶具有SEQ ID NO5，26，或27的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO6的多核苷酸编码。
166.含有葡萄糖异构酶的转化的植物部分，所述葡萄糖异构酶具有SEQ ID NO28，29，30，38，40，42，或44的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列的多核苷酸编码。
167.含有葡糖淀粉酶的转化的植物部分，所述葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO45，或SEQ ID NO47或SEQ ID NO49的氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO46，48，50，或59任何序列的多核苷酸编码。
168.含有支链淀粉酶的转化的植物部分，所述支链淀粉酶由含有SEQ ID NO4或25任一序列的多核苷酸编码。
169.转化权利要求156的转化的植物部分中的淀粉的方法，包括活化其中所含的淀粉加工酶。
170.将权利要求164-168任一项的转化的植物部分中的淀粉转化为淀粉衍生产物的方法，包括活化其中所含的酶。
171.根据权利要求169的方法产生的淀粉，糊精，麦芽寡糖或糖。
172.根据权利要求170的方法产生的淀粉，糊精，麦芽寡糖或糖。
173.在其细胞壁或细胞内含有至少一种非淀粉加工酶的转化的植物部分的使用方法，包括a)将含有至少一种非淀粉多糖加工酶的转化的植物部分在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，由此消化非淀粉多糖以形成含有寡糖和/或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种非淀粉多糖加工酶的表达盒；以及b)收集含有寡糖和/或糖的水性溶液。
174.权利要求173的方法，其中所述非淀粉多糖加工酶是耐超高温的。
175.含有至少一种加工酶的转化的种子的使用方法，包括a)将含有至少一种蛋白酶或脂酶的转化的种子在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，产生含有氨基酸和脂肪酸的水性混合物，其中所述种子获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；以及b)收集水性混合物。
176.权利要求175的方法，其中分离所述氨基酸，脂肪酸，或两者。
177.权利要求175的方法，其中所述至少一种蛋白酶或脂酶是耐超高温的。
178.制备乙醇的方法，包括a)将含有至少一种多糖加工酶的植物部分在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，从而消化多糖以形成寡糖或可发酵糖，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒；以及b)在促进可发酵糖或寡糖转化为乙醇的条件下，孵育可发酵糖。
179.权利要求178的方法，其中所述植物部分为谷粒，果实，种子，茎，木材，蔬菜或根。
180.权利要求178的方法，其中所述植物部分从选自下组的植物获得燕麦，大麦，小麦，浆果，葡萄，黑麦，玉米，稻，马铃薯，甜菜，甘蔗菠萝，草和树。
181.权利要求178的方法，其中所述多糖加工酶为α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，支链淀粉酶或其组合。
182.权利要求178的方法，其中所述多糖加工酶是耐超高温的。
183.权利要求178的方法，其中所述多糖加工酶是耐中温的。
184.权利要求181的方法，其中所述多糖加工酶是耐超高温的。
185.一种制备乙醇的方法，包括a)将含有至少一种酶的植物部分在能够活化所述至少一种酶的时间长度和条件下加热处理，由此消化多糖以形成可发酵糖，所述酶选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，或支链淀粉酶或其组合，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；以及b)在促进可发酵糖转化为乙醇的条件下孵育可发酵糖。
186.权利要求185的方法，其中所述的至少一种酶是耐超高温的。
187.权利要求185的方法，其中所述的至少一种酶是耐中温的。
188.权利要求185的方法，其中所述α-淀粉酶具有SEQ ID NO1，10，13，14，15，16，33或35的任一氨基酸序列，或由含有SEQID NO2或9任一序列的多核苷酸编码。
189.权利要求185的方法，其中所述α-葡糖苷酶具有SEQ IDNO5，26，或27的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO6的多核苷酸编码。
190.权利要求185的方法，其中所述葡萄糖异构酶具有SEQID NO28，29，30，38，40，42，或44的任一氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO19，21，37，39，41或43任一序列的多核苷酸编码。
191.权利要求185的方法，其中所述葡糖淀粉酶具有SEQ IDNO45的氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO46，48或50任一序列的多核苷酸编码。
192.权利要求185的方法，其中所述支链淀粉酶具有SEQ IDNO24或34的氨基酸序列，或由含有SEQ ID NO4或25任一序列的多核苷酸编码。
193.制备乙醇的方法，包括a)将含有至少一种非淀粉加工酶的植物部分在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，由此消化非淀粉多糖为寡糖和可发酵糖，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；以及b)在促进可发酵糖转化为乙醇的条件下孵育可发酵糖。
194.权利要求193的方法，其中所述非淀粉加工酶为葡聚糖酶，木聚糖酶或纤维素酶。
195.一种制备乙醇的方法，包括a)将含有至少一种酶的植物部分在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，由此消化多糖以形成可发酵糖，所述酶选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡萄糖异构酶，支链淀粉酶或其组合，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；以及b)在促进可发酵糖转化为乙醇的条件下孵育可发酵糖。
196.权利要求195的方法，其中所述的至少一种酶是耐超高温的。
197.一种不加入额外甜味剂而生产增甜谷粉制食品的方法，包括a)将含有至少一种淀粉加工酶的植物部分在活化所述至少一种酶的条件下处理，由此加工植物部分中的淀粉颗粒为糖，从而形成增甜产品，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；以及b)将所述增甜产品加工成谷粉制食品。
198.权利要求197的方法，其中所述谷粉制食品由增甜产品和水制成。
199.权利要求197的方法，其中所述谷粉制食品含有麦芽，调味剂，维生素，矿物质，着色剂或其任意组合。
200.权利要求197的方法，其中所述至少一种酶是耐超高温的。
201.权利要求197的方法，其中所述酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其任意组合。
202.权利要求197的方法，其中所述植物选自大豆，黑麦，燕麦，大麦，小麦，玉米，稻和甘蔗。
203.权利要求197的方法，其中所述谷粉制食品是谷类食品。
204.权利要求197的方法，其中所述谷粉制食品为早餐食品。
205.权利要求197的方法，其中所述谷粉制食品为即食食品。
206.权利要求197的方法，其中所述谷粉制食品为焙烤食品。
207.权利要求197的方法，其中所述加工为焙烤，煮沸，加热，汽蒸，放电或其任意组合。
208.一种不加入甜味剂而增甜含淀粉产品的方法，包括a)将含有至少一种淀粉加工酶的淀粉在能够活化所述至少一种酶的条件下处理，由此消化淀粉以形成糖从而形成增甜淀粉，其中所述淀粉获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种酶的表达盒；以及b)将所述增甜淀粉加入产品中以制成增甜的含淀粉产品。
209.权利要求208的方法，其中所述转化植物选自玉米，大豆，黑麦，燕麦，大麦，小麦，稻和甘蔗。
210.权利要求208的方法，其中所述的至少一种酶是耐超高温的。
211.权利要求208的方法，其中所述至少一种酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其任意组合。
212.通过权利要求197的方法获得的谷粉制食品。
213.通过权利要求208的方法获得的增甜含淀粉产品。
214.增甜含多糖水果或蔬菜的方法，包括将含有至少一种多糖加工酶的水果或蔬菜在活化所述至少一种酶的条件下处理，从而加工水果或蔬菜中的多糖以形成糖，产生增甜水果或蔬菜，其中所述水果或蔬菜获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种多糖加工酶的表达盒。
215.权利要求214的方法，其中所述水果或蔬菜选自马铃薯，番茄，香蕉，南瓜，豌豆类和菜豆类。
216.权利要求214的方法，其中所述的至少一种酶是耐超高温的。
217.权利要求214的方法，其中所述酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，葡糖淀粉酶，支链淀粉酶，葡萄糖异构酶或其任意组合。
218.制备含糖的水性溶液的方法，包括在活化所述至少一种酶的条件下，处理获自权利要求156的植物部分的淀粉颗粒，从而产生含糖的水性溶液。
219.不涉及在淀粉衍生产物回收之前湿磨或干磨谷粒而从谷粒中制备淀粉衍生产物的方法，包括a)将含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分在活化所述至少一种酶的条件下处理，由此加工淀粉颗粒形成含有糊精或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种淀粉加工酶的表达盒；以及b)收集所述含有淀粉衍生产物的水性溶液。
220.权利要求219的方法，其中所述的至少一种淀粉加工酶是耐超高温的。
221.分离α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶的方法，包括培养权利要求82的转化植物并分离α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶。
222.权利要求221的方法，其中所述α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖异构酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶是耐超高温的。
223.制备麦芽糖糊精的方法，包括a)将转基因谷粒与水混合；b)加热所述混合物；c)从(b)产生的糊精糖浆分离固体，以及d)收集麦芽糖糊精。
224.权利要求223的方法，其中所述转基因谷粒含有至少一种淀粉加工酶。
225.权利要求224的方法，其中所述淀粉加工酶为α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，和葡萄糖异构酶。
226.权利要求225的方法，其中所述的至少一种淀粉加工酶是耐超高温的。
227.通过权利要求223-226任一项的方法产生的麦芽糖糊精。
228.通过权利要求223-226任一项的方法产生的麦芽糖糊精组合物。
229.不涉及在回收淀粉衍生产物之前机械破坏谷物而从谷物制备糊精或糖的方法，包括a)将含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分在活化所述至少一种酶的条件下处理，从而加工淀粉颗粒以形成含糊精或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，该植物的基因组中增加了编码所述至少一种加工酶的表达盒；以及b)收集含有糖和/或糊精的水性溶液。
230.权利要求229的方法，其中所述淀粉加工酶为α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，和葡萄糖异构酶。
231.制备可发酵糖的方法，包括a)将含有淀粉颗粒和至少一种淀粉加工酶的植物部分在活化所述至少一种酶的条件下处理，由此加工淀粉颗粒以形成含有糊精或糖的水性溶液，其中所述植物部分获自转化的植物，所述植物的基因组中增加了编码所述至少一种加工酶的表达盒；以及b)收集所述含有可发酵糖的水性溶液。
232.权利要求249的方法，其中所述淀粉加工酶为α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，和葡萄糖异构酶。
233.用含有耐超高温α-淀粉酶的载体稳定转化的玉米植物。
234.用含有编码α-淀粉酶的多核苷酸序列的载体稳定转化的玉米植物，所述酶与SEQ ID NO1或SEQ ID NO51的一致性高于60％。
全文摘要
本发明提供多核苷酸序列，优选合成的多核苷酸，其编码为在植物中表达而优化的加工酶。该多核苷酸编码耐中温、耐高温或耐超高温的加工酶，该酶在适当的活化条件下能够被活化从而对目的底物发挥作用，本发明还提供“自加工”的转基因植物以及植物部分，如谷粒，这些植物能够表达一种或多种这样的酶，并且具有改变了的组分，所述组分利于植物和谷粒生长。还提供了制备及使用这些植物的方法，例如生产风味改善的食物产品的方法，生产可发酵底物用于制备乙醇以及发酵饮料的方法。
文档编号C12N9/34GK1564866SQ02819856
公开日2005年1月12日 申请日期2002年8月27日 优先权日2001年8月27日
发明者M·B·拉纳汉, S·S·巴苏, C·J·巴泰, 陈文 , J·克莱格, M·肯克玛 申请人:辛根塔参与股份公司